CN109593750B - 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109593750B
CN109593750B CN201910039981.3A CN201910039981A CN109593750B CN 109593750 B CN109593750 B CN 109593750B CN 201910039981 A CN201910039981 A CN 201910039981A CN 109593750 B CN109593750 B CN 109593750B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nitrile hydratase
glu
mutant
ala
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910039981.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109593750A (zh
Inventor
周哲敏
刘中美
周丽
崔文璟
郭军玲
蓝瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910039981.3A priority Critical patent/CN109593750B/zh
Publication of CN109593750A publication Critical patent/CN109593750A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109593750B publication Critical patent/CN109593750B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用，属于酶工程技术领域。本发明是将腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y‑βM46K/E108R/S212Y(公开于发明专利CN102216455A)的第47位甘氨酸突变为天冬酰胺，获得的新突变酶具有更好的温度耐受性和产物耐受性，有利于以后的工业生产。将含该腈水合酶突变体的重组菌株高密度发酵，以烟腈为底物，进行全细胞催化反应制备烟酰胺。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，与酶法相比，底物价格便宜，催化效率高，终产物烟酰胺产率95％以上，浓度达到680g/L，简化了产物的分离纯化步骤。

Description

一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
腈水合酶(NHase)可用于催化3-氰基吡啶为药用价值更高的烟酰胺，烟酰胺是一种维生素，已经被广泛的用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，估计每年需要2000多吨，但目前我国烟酰胺的生产水平不高，规模不大，需要大量的进口，约1000吨。因此，将NHase用于烟酰胺的生产有很大潜力。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。同时腈水合酶的底物和产物都是有机物，高浓度的有机物对酶的结构会产生较大的破坏作用，使酶活急速降低，催化活性下降，所以，在生产催化过程中，提高腈水合酶的热稳定性和底物产物耐受性尤为重要。
目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，需要100h，并且生产效率不高，只有162g/(L·h)。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。
目前的腈水合酶在自然界中广泛存在，其中有关来自细菌和放线菌的腈水合酶报道最多例如来自红球菌，诺卡氏菌，芽孢杆菌，假诺卡氏菌的腈水合酶。目前大部分腈水合酶热稳定性都不高，因此，选择来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)获得一种稳定性提高的腈水合酶对于酰胺类产品的工业化生产具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种腈水合酶突变体，含有PtNHase-α亚基、PtNHase-β亚基以及一个调控蛋白PtNHase-p，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述腈水合酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供含有上述基因的载体或细胞。
本发明的第四个目的是提供含上述腈水合酶突变体的组合物。
本发明的第五个目的是提供一种重组大肠杆菌，表达上述的腈水合酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，重组菌是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET 24a(+)为表达载体。
本发明的第六个目的是提供一种提高腈水合酶稳定性的方法，是以α亚基、β亚基、调控蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3所示的腈水合酶为亲本酶，将α亚基的第6位亮氨酸突变为苏氨酸、第19位丙氨酸突变为缬氨酸、第126位苯丙氨酸突变为酪氨酸，β亚基的第46位甲硫氨酸突变为赖氨酸、第47位甘氨酸突变为天冬氨酸、第108位谷氨酸突变为精氨酸、第212位丝氨酸突变为酪氨酸。
本发明的第七个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，所述方法是将如SEQID NO.8所示的编码腈水合酶的基因与表达载体连接，转入大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，是将编码氨基酸序列SEQ ID NO.2的PtNHase-β亚基基因、如SEQ ID NO.6所示的间隔序列a、编码氨基酸序列SEQ ID NO.1的PtNHase-α亚基基因、如SEQ ID NO.7所示的间隔序列b、编码氨基酸序列SEQ ID NO.3的调控蛋白PtNHase-p基因依次连接，得到腈水合酶的基因NHase，将NHase与表达载体连接，转入大肠杆菌中。
本发明的第八个目的是提供上述的腈水合酶突变体或表达上述的腈水合酶突变体的细胞在生产含烟酰胺或丙烯酰胺的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以烟腈或丙烯腈作为底物，利用上述重组大肠杆菌进行发酵，发酵后的菌液用于全细胞转化生产烟酰胺或丙烯酰胺。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌发酵的条件为：将培养6-8h的重组大肠杆菌菌液按5-8％的接种量接种于含卡那霉素浓度为80-120μg/mL的发酵罐培养基中，35-38℃培养，当OD600达到70-75时，温度降至28-30℃，以0.20-0.22g/(L·h)的恒速流加140-150mL的诱导剂，诱导培养35-40h结束发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵罐培养基包括：葡萄糖12.0g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，磷酸氢二铵4.0g/L，柠檬酸1.7g/L，硫酸镁1.68g/L，微量元素10mL。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素包括：七水硫酸亚铁1.0g/100mL，七水硫酸锌0.525g/100mL，五水硫酸铜0.3g/100mL，四水硫酸锰0.05g/100mL，硼砂0.023g/100mL，氯化钙0.2g/100mL，钼酸铵0.01g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，利用所述重组大肠杆菌作为全细胞催化剂催化所述底物转化生产烟酰胺的反应条件为：调整温度为25-28℃，底物烟腈与湿菌体的质量比为0.5-2，当底物反应完毕后再加入下一批底物。
在本发明的一种实施方式中，利用所述重组大肠杆菌作为全细胞催化剂催化所述底物转化生产丙烯酰胺的反应条件为：调整温度为25-28℃，底物丙烯腈与湿菌体的质量比为1-1.5，当底物反应完毕后再加入下一批底物。
本发明的第九个目的是提供上述的腈水合酶突变体或表达上述的腈水合酶突变体的细胞在饲料、食品或制药领域内的应用。
本发明的有益效果：
第一，本发明提供的腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y的最适温度为36℃，50℃处理80分钟仍有53％残留的酶活性，相比对照酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y(将亲本酶的α亚基的第6位亮氨酸突变为苏氨酸、第19位丙氨酸突变为缬氨酸、第126位苯丙氨酸突变为酪氨酸，β亚基的第46位甲硫氨酸突变为赖氨酸、第47位甘氨酸突变为天冬氨酸、第108位谷氨酸突变为精氨酸、第212位丝氨酸突变为酪氨酸)50℃处理80分钟剩余37％酶活，提高了43％，突变体热稳定性有明显提高。在当底物3-氰基吡啶浓度为0.2M时，酶活最高，定义为100％，突变酶的底物耐受性未受到影响；突变体在2M的产物烟酰胺下处理20min后，突变酶的剩余酶活由对照的28％提高到52％同时该突变体也具备了更好的产物耐受性；因此，本发明提供的腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y具有很好的酶学性质，有利于以后的工业生产。
第二，本发明通过构建表达腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y的重组大肠杆菌，获得具有高酶活的腈水合酶菌株，重组腈水合酶的纯酶比酶活达907.69U/mg。将重组菌株高密度发酵，以烟腈和丙烯腈作为底物，进行全细胞催化反应制备烟酰胺和丙烯酰胺，烟酰胺的产量达680g/L，丙烯酰胺的产量达514.8g/L。此法与玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺相比，终产物烟酰胺和丙烯酰胺的产率达95％以上，且简化了产物的分离纯化步骤，发酵周期短，生产效率高。
附图说明
图1：PtNHase蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准(6.5-200KDa)，1为大肠杆菌BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y对照菌的细胞破碎液上清；2为大肠杆菌BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y重组菌诱导后的细胞破碎液上清。
图2：在50℃下保存后酶的热稳定性曲线，酶1：αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y酶2：αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y。
图3：在不同3-氰基吡啶浓度下的相对酶活变化，菌1：BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y；菌2：BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y。
图4：在不同产物烟酰胺浓度下的相对酶活变化，菌1：BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y；菌2：BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y。
图5：全细胞催化生产烟酰胺示意图。
图6：全细胞催化生产丙烯酰胺示意图。
具体实施方式
(一)酶活、比酶活和相对酶活的定义及酶活的测定方法
酶活的定义(U)：每分钟转化3-氰基吡啶生成1μmol/L烟酰胺所需的酶量定义为1U。
比酶活(U/mg)：每毫克NHase的酶活。
相对酶活的定义：突变酶αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y在pH＝8.4，温度为36℃反应10分钟测得的酶活定义为100％。
测发酵液酶活的方法：将100μL，OD 600＝1.0的菌体(磷酸缓冲液溶解)加入400μL、125mmol/L烟腈溶液中，25℃反应10min，500μL乙腈终止反应，加入终止液后立即在4℃，12000r/min条件下离心1min，吸取上清。反应液经0.22μm微孔滤膜过滤，载入C18色谱柱进行HPLC分析，流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液。烟腈与烟酰胺测定方法：流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液，流速0.6mL/min，吸光值215nm，采集时间12min。细胞密度：UV-1800PC型紫外可见分光光度计测量OD600，根据吸光值和OD的关系换算，换算关系：1g/L＝0.3683OD600。
测腈水合酶酶活的方法：底物为490μL 200mM的烟腈，加入浓度为0.5μg/μL的纯酶溶液10μL或OD＝10的菌液10μL在36℃的温度下反应10min后用500μL乙腈终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。
(二)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L。
发酵罐培养基(g/L)：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10mL。
补料培养基(g/L)：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0。
诱导剂(g/100mL)：乳糖10.0，CoCl 2·6H2O 0.8。
微量元素(g/100mL)：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。
(三)HPLC检测腈水合酶、烟酰胺和丙烯酰胺含量的方法
腈水合酶反应体系：底物为490μL 200mM的3-氰基吡啶，加入浓度为0.5μg/μL的纯酶溶液10μL或在600nm波长下，OD＝10的菌液10μL在36℃的温度下反应10min后用500μL乙腈终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。
HPLC检测腈水合酶含量：采用安捷伦1260进行HPLC检测，流动相为水乙腈缓冲液；检测波长210nm，流速为0.6mL/min；色谱柱为C18柱。
HPLC检测烟酰胺或丙烯酰胺的含量：采用安捷伦1260进行HPLC检测，流动相为水乙腈缓冲液；检测波长210nm，流速为0.6mL/min；色谱柱为C18柱。
(四)温度稳定性的确定
以酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y(将同一亲本酶的α亚基的第6位亮氨酸突变为苏氨酸、第19位丙氨酸突变为缬氨酸、第126位苯丙氨酸突变为酪氨酸，β亚基的第46位甲硫氨酸突变为赖氨酸、第47位甘氨酸突变为天冬氨酸、第108位谷氨酸突变为精氨酸、第212位丝氨酸突变为酪氨酸；公开于发明专利CN102216455A中)为对照。
将对照和突变体在pH＝8.4的KPB缓冲液中，50℃分别保温20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟后测定残留酶活，得到温度稳定性结果。
(五)底物耐受性的确定
将对照和突变体稀释在pH＝8.4的KPB缓冲液中成为在600nm波长下OD＝10的菌液，36℃分别在200mM、400mM、600mM、800mM、1000mM的3-氰基吡啶的浓度下保温20分钟后测定残留酶活，得到底物耐受性结果。
(六)产物耐受性的确定
将对照和突变体稀释到pH＝8.4的KPB缓冲液中成为在600nm波长下OD＝10的菌液，36℃分别在0.5M、1M、1.5M、2M的烟酰胺的浓度下保温20分钟后测定残留酶活，得到产耐受性结果。
实施例1重组大肠杆菌的构建
(1)突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y的构建：
化学合成法合成腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y基因，并将该基因克隆于pET24a质粒的NdeI和Bpu10I酶切位点处，由通用生物系统(安徽)有限公司完成，获得pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y重组质粒。以pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y为模版，在表1所示条件下进行PCR，所用上游引物序列信息如SEQ ID NO.9所示，所用下游引物序列信息如SEQ ID NO.10所示。PCR产物转入E.coliJM109后获得携带编码突变体基因的重组质粒pET24a--αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y。将重组质粒pET24a--αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y转化E.coli BL21菌株，获得重组菌株BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y。
以类似的方法构建表达腈水合酶突变体αL6T/A19V/F126Y-βM46K/E108R/S212Y的对照质粒和对照菌株。
表1全质粒PCR扩增反应体系
Figure BDA0001947214880000061
PCR扩增反应条件为：
Figure BDA0001947214880000062
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入大肠杆菌BL21感受态细胞。
(2)将BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y重组大肠杆菌接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。
将上述过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mL LB表达培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至在600nm波长下OD600至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导12-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。
(3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(20mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl、6mmol/L KCl)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的strep Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，用8倍柱体积的20mM Na2HPO4、280mM NaCl、6mM KCl，2.5mM脱硫生物素缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。
实施例2腈水合酶的表达
将BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y重组大肠杆菌接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，20℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鉴定腈水合酶重组蛋白表达水平，结果如图1所示。通过超声破碎，12000rpm离心60min，用亲和层析柱Strep Trap FF纯化蛋白，重组腈水合酶的纯酶的比酶活为907.69U/mg。
实施例3热稳定性测定
在500μL缓冲反应体系(20mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl和6mmol/L KCl)中加入0.5mg/ml实施例1纯化后的突变酶10μL，保存于50℃金属浴中，每隔20分钟取样，测定残留酶活。
如图2所示，发现突变体在50℃下处理80min后，突变酶的剩余酶活由对照的37％(剩余酶活333U/mg)提高到53％(剩余酶活为424U/mg)；在50℃处理100min后，突变酶的相对酶活由对照的24％(剩余酶活216U/mg)提高到45％(剩余酶活360U/mg)。突变体热稳定性有明显提高。
实施例4底物耐受性测定
配制0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1M不同浓度的底物溶液，将在600nm波长下，OD＝10的对照和突变体菌液分别在不同底物浓度的溶液中36℃处理20min后用KPB重悬清洗两次细胞，取10μL测定残余酶活。
如图3所示，在当底物3-氰基吡啶浓度为0.2M时，酶活定义为100％，经过突变以后其底物耐受性并没有受到明显影响。
实施例5产物耐受性测定
配制0.5M、1M、1.5M、2M不同浓度的产物烟酰胺溶液，将在600nm波长下，OD600＝10的对照和突变体菌液分别在不同底物浓度的溶液中36℃处理20min后用KPB重悬清洗两次细胞，取10μL测定残余酶活。
如图4所示，不用产物处理时的酶活定义为100％，发现突变体在2M的产物烟酰胺下处理20min后，突变酶的剩余酶活由对照的28％提高到52％。突变体对产物烟酰胺的耐受性有明显提高。
实施例6重组大肠杆菌高密度发酵
将重组大肠杆菌BL21/pET24a-αL6T/A19V/F126Y-βM46K/G47N/E108R/S212Y接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养6-8h。将上述培养物按6％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的2L发酵罐发酵培养基中，37℃补料培养，当OD600达到60时，温度降至30℃，以0.20-0.22g/(L·h)的恒速流加140-150mL的诱导剂，诱导培养36h结束发酵。发酵结束后，酶活达到24763.48U/mL。
实施例7全细胞催化法生产烟酰胺
将高密度发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。调整温度为25-28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝150-160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到烟酰胺的浓度为680g/L，如图5所示。
实施例8全细胞催化法生产丙烯酰胺
将高密度发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。调整温度为25-28℃，丙烯腈以64g/L的终浓度加入到OD600＝150-160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到丙烯酰胺的浓度为514.8g/L，如图6所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Thr Glu Asn Ile Thr Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu
1 5 10 15
Ile Thr Val Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly
20 25 30
Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn
35 40 45
Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr
50 55 60
Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys
65 70 75 80
Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val
85 90 95
Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser
100 105 110
Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys Glu
115 120 125
Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys
130 135 140
Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp
145 150 155 160
Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala
165 170 175
Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg
180 185 190
Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val
20 25 30
Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Lys Asn Leu
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly
65 70 75 80
Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Arg His Glu Gln Lys
100 105 110
Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val
130 135 140
Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg
145 150 155 160
Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His
180 185 190
Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly
195 200 205
Asp Pro Asn Tyr Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu
210 215 220
Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
225 230 235 240
Lys
<210> 3
<211> 144
<212> PRT
<213> Pseudonocardia thermophila
<400> 3
Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu
1 5 10 15
Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp
20 25 30
Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe
35 40 45
Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln
50 55 60
Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala
85 90 95
Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu
100 105 110
Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His
115 120 125
His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser
130 135 140
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> Pseudonocardia thermophila
<400> 4
Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu
1 5 10 15
Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly
20 25 30
Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn
35 40 45
Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr
50 55 60
Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys
65 70 75 80
Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val
85 90 95
Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser
100 105 110
Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu
115 120 125
Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys
130 135 140
Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp
145 150 155 160
Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala
165 170 175
Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg
180 185 190
Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala
195 200 205
<210> 5
<211> 241
<212> PRT
<213> Pseudonocardia thermophila
<400> 5
Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val
20 25 30
Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly
65 70 75 80
Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys
100 105 110
Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val
130 135 140
Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg
145 150 155 160
Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His
180 185 190
Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly
195 200 205
Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu
210 215 220
Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
225 230 235 240
Lys
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ctgttgaata taagaataag gaggtatttt a 31
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tgaatattaa ggaggttatt t 21
<210> 8
<211> 1831
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atgaatggcg tttatgatgt tggtggcacc gatggtctgg gtccgattaa tcgcccggcc 60
gatgaaccgg tttttcgcgc cgaatgggaa aaagttgcat ttgccatgtt tccggcaacc 120
tttcgcgcag gttttaaaaa tctggatgaa tttcgttttg gcattgaaca gatgaatccg 180
gcagaatatc tggaaagtcc gtattattgg cattggattc gtacctatat tcatcatggc 240
gtgcgtaccg gtaaaattga tctggaagaa ctggaacgtc gtacccagta ttatcgtgaa 300
aatccggatg ccccgctgcc gcgccatgaa cagaaaccgg aactgattga atttgtgaat 360
caggccgttt atggcggcct gccggcaagc cgtgaagttg atcgtccgcc gaaattcaaa 420
gaaggtgacg tggtgcgctt tagcaccgcc agtccgaaag gccatgcacg tcgtgcccgc 480
tatgtgcgtg gcaaaaccgg taccgtggtt aaacatcatg gtgcatatat ctatccggat 540
accgccggta atggcctggg tgaatgtccg gaacatctgt ataccgttcg ctttaccgca 600
caggaactgt ggggcccgga aggtgacccg aattatagtg tttattatga ttgctgggag 660
ccgtatattg aactggtgga taccaaagca gcagccgcat ggagccaccc gcagttcgaa 720
aagtgactgt tgaatataag aataaggagg tattttaatg accgaaaaca tcacccgtaa 780
aagcgatgaa gaaattcaga aagaaatcac cgtgcgcgtt aaagccctgg aaagtatgct 840
gattgaacag ggcattctga ccaccagtat gattgatcgt atggccgaaa tctatgaaaa 900
tgaagttggc ccgcatctgg gcgccaaagt ggtggttaaa gcctggaccg atccggagtt 960
taaaaaacgc ctgctggccg atggcaccga agcatgtaaa gaactgggca ttggtggcct 1020
gcagggcgaa gatatgatgt gggtggaaaa taccgatgaa gtgcatcatg tggtggtttg 1080
taccctgtgc agttgctatc cgtggccggt tctgggcctg ccgccgaatt ggtataaaga 1140
accgcagtat cgcagccgtg ttgtgcgtga accgcgtcag ctgctgaaag aagaatttgg 1200
ttttgaagtt ccgccgagta aagaaattaa ggtttgggat agcagcagcg aaatgcgttt 1260
tgtggtgctg ccgcagcgtc cggccggtac agatggttgg agcgaagaag aactggccac 1320
cctggtgacc cgcgaaagta tgattggtgt tgaaccggcc aaagcagtgg catgatgaat 1380
attaaggagg ttatttatga gcgctgaagc caaagtgcgt ctgaaacatt gtccgaccgc 1440
cgaagatcgc gccgccgcag atgcactgct ggcacagctg ccgggcggcg accgcgcgct 1500
cgatcgcggt tttgatgaac cgtggcagct gcgcgccttt gccctggccg tggccgcctg 1560
tcgcgccggc cgctttgaat ggaaacagct gcagcaggcc ctgattagca gtattggcga 1620
atgggaacgt acccatgatc tggatgatcc gagctggagc tattatgaac attttgtggc 1680
cgcactggaa agtgtgctgg gcgaagaagg tattgttgaa ccggaagcac tggatgaacg 1740
caccgccgaa gttctggcca atccgccgaa taaggatcat catggcccgc atctggaacc 1800
ggttgcagtg catccggcag ttcgcagcta a 1831
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
cgcgcaggtt ttaaaaatct ggatgaattt cgt 33
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ttcatccaga tttttaaaac ctgcgcgaaa ggttg 35

Claims (10)

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，含有PtNHase-α亚基、PtNHase-β亚基以及一个调控蛋白PtNHase-p，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.含权利要求1所述腈水合酶突变体的组合物。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述的腈水合酶突变体。
6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET24a(+)为表达载体。
7.一种提高腈水合酶稳定性的方法，其特征在于，以α亚基、β亚基、调控蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3所示的腈水合酶为亲本酶，将α亚基的第6位亮氨酸突变为苏氨酸、第19位丙氨酸突变为缬氨酸、第126位苯丙氨酸突变为酪氨酸，β亚基的第46位甲硫氨酸突变为赖氨酸、第47位甘氨酸突变为天冬氨酸、第108位谷氨酸突变为精氨酸、第212位丝氨酸突变为酪氨酸。
8.权利要求5或6所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，是将如SEQ ID NO.8所示的编码腈水合酶的基因与表达载体连接，转入大肠杆菌中。
9.权利要求1所述的腈水合酶突变体或表达权利要求1所述的腈水合酶突变体的细胞在生产含烟酰胺或丙烯酰胺的产品中的应用。
10.权利要求1所述的腈水合酶突变体或表达权利要求1所述的腈水合酶突变体的细胞在饲料、食品或制药领域内的应用。
CN201910039981.3A 2019-01-16 2019-01-16 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用 Active CN109593750B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910039981.3A CN109593750B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910039981.3A CN109593750B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109593750A CN109593750A (zh) 2019-04-09
CN109593750B true CN109593750B (zh) 2020-01-21

Family

ID=65965262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910039981.3A Active CN109593750B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109593750B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690675B (zh) * 2019-08-01 2022-07-19 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用
CN110938616B (zh) * 2019-10-31 2021-01-29 江南大学 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体
WO2021081868A1 (zh) 2019-10-31 2021-05-06 江南大学 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体
CN114790452B (zh) * 2020-11-20 2024-03-26 江南大学 一种对腈类化合物具有高稳定性的腈水合酶突变体
CN112501151B (zh) * 2020-12-09 2021-11-16 江南大学 一种腈水合酶突变体及其应用
CN112553185B (zh) * 2020-12-30 2022-02-11 浙江工业大学 一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
CN113444714B (zh) * 2021-07-29 2022-06-21 浙江大学杭州国际科创中心 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用
CN114107269B (zh) * 2021-11-23 2024-03-01 江南大学 一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用
CN114277022B (zh) * 2021-12-03 2023-08-08 江南大学 一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004215513A (ja) * 2003-01-09 2004-08-05 Mitsubishi Rayon Co Ltd 改良型ニトリルヒドラターゼ
US7645605B2 (en) * 2004-05-26 2010-01-12 Mitsubishi Rayon Co., Ltd Heat-resistant nitrile hydratase
JP5069032B2 (ja) * 2007-04-04 2012-11-07 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
EP2363473B1 (en) * 2008-11-14 2018-01-10 Mitsui Chemicals, Inc. Nitrile hydratase variant
CN102517271B (zh) * 2011-12-13 2013-04-03 清华大学 一种突变腈水合酶
CN104561064B (zh) * 2014-12-30 2018-05-22 杭州师范大学 一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用
JP6757422B2 (ja) * 2016-12-28 2020-09-16 三井化学株式会社 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法
CN107177576B (zh) * 2017-05-10 2020-07-28 浙江工业大学 腈水解酶突变体及其应用
CN108486088B (zh) * 2018-02-14 2021-02-02 浙江工业大学 腈水解酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109593750A (zh) 2019-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593750B (zh) 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
CN110938616B (zh) 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体
CN108467860B (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的方法
CN109251882B (zh) 一株异源表达耐热腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用
US11332731B2 (en) Nitrile hydratase mutant, genetically engineered bacterium containing mutant and applications thereof
CN110791494A (zh) 一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用
CN112322606B (zh) 一种腈水合酶突变体及其应用
CN109251881A (zh) 一株异源表达腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用
CN113337495B (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN113122526B (zh) 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k1、编码基因及应用
CN112941062B (zh) 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h1、编码基因及应用
CN108004225B (zh) 一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体
CN114836406B (zh) 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用
CN113151234B (zh) 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h2r、编码基因及应用
CN114277022B (zh) 一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体
CN113151233B (zh) 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h2、编码基因及应用
CN110804602B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN102936590A (zh) 一种腈水解酶及其基因序列与应用方法
CN109337891B (zh) 一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体
CN118207172B (zh) 双功能谷胱甘肽合酶突变体及其应用
CN109370997B (zh) 一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体
CN114107270B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体
CN110904087B (zh) L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用
CN110951717B (zh) 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用
CN116286701A (zh) 一种不透明红球菌l-氨基酸氧化酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant