CN102517271B - 一种突变腈水合酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于酶工程和工业微生物技术领域的一种耐热和超声耐受性突变腈水合酶。该突变腈水合酶的获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换和添加；所述置换的残基对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的残基位于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的末端残基之后，添加个数为1-2个。本发明突变腈水合酶的抗逆性好，耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升。

Description

一种突变腈水合酶

技术领域

本发明属于酶工程和工业微生物技术领域，具体涉及一种耐热和超声耐受性突变腈水合酶、该酶的构建方法及其在微生物法生产丙烯酰胺中的应用。

背景技术

微生物生产的腈水合酶，可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合产生的聚丙烯酰胺在三次采油、水处理、造纸等工业生产领域具有非常广泛的应用。利用微生物产生的腈水合酶催化生产丙烯酰胺具有一系列优点，包括反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等，因此逐渐成为丙烯酰胺生产的主要方法。

微生物法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现和改造以及对腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；清华大学公开了“一种腈水合酶及其编码基因与应用”，构建了α亚基起始密码子突变的腈水合酶，并在大肠杆菌中高活性表达(专利号：ZL 200410042576.0)；清华大学在专利“一种腈水合酶基因簇及其应用”中公开了赤(红色)红球菌Rhodococcus ruber TH中与腈水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列(中国专利申请号：200910076710.1)。

除了产物/底物耐受性外，在微生物法生产丙烯酰胺的催化水合过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的耐热性较差，水合温度必须通过低温制冷剂控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是强放热反应，工业生产中控温的冷量经常供应不足，导致水合温度波动到25℃以上。较高的水合温度一方面会加快反应速率，提高生产效率，另一方面则会造成腈水合酶的快速失活，减少反应批次，增加生产成本。日本三菱丽阳株式会社公开了专利《改良型腈水合酶》(公开号：CN 1961072A)，对腈水合酶β亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了腈水合酶的热稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种突变腈水合酶及其突变基因。

本发明的目的还在于提供含有上述腈水合酶突变基因的转化体。

本发明的目的还在于提供突变腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

一种突变腈水合酶，该突变腈水合酶的获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换和添加；所述置换的残基对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的残基位于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的末端残基之后，添加个数为1-2个。

所述氨基酸残基的置换包括将对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列中141位的Ser残基置换为Lys，将对应于143位的Ser残基置换为Lys，将对应于144位的Leu残基置换为Glu；所述氨基酸残基的添加包括在SEQ ID NO：1氨基酸序列的末端添加的Asp和Thr。

上述突变腈水合酶的基因，或含有该基因的表达载体。

所述突变基因或含有该基因表达载体的转化体。

所述转化体为大肠杆菌、诺卡氏菌、红球菌或丙酸棒杆菌。

上述改良腈水合酶转化体的构建方法，可采用氯化钙法或电穿孔转化法(Sambrook J等.Molecular Cloning：A Laboratory manual.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)将载体导入受体菌。也可以将改良腈水合酶基因直接插入转化体的染色体。

上述突变腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

本发明所述改良腈水合酶转化体的游离细胞可直接用于从丙烯腈水合制备丙烯酰胺。

本发明的有益效果：本发明突变腈水合酶的抗逆性好，耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升。本发明突变腈水合酶表达活性高，即稳定性的提升没有导致腈水合酶活性的下降。采用本发明提供的突变腈水合酶，能够高效催化底物丙烯腈水合生成产物丙烯酰胺，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为携带突变腈水合酶基因的重组质粒pET-NHM示意图；

其中，M1表示替换突变，包括：G422A、T423A、C428T、C430G、T431A、C432A；M2为插入突变：688-GACACT-693。

图2为突变腈水合酶NHM与原腈水合酶的活性和热耐受性、丙烯酰胺耐受性、超声耐受性比较；

其中，C1、C3、C5、C7分别为原始腈水合酶的表达活性、热耐受性、丙烯酰胺耐受性和超声耐受性；M2、M4、M6、M8分别为突变腈水合酶的酶活、热耐受性、丙烯酰胺耐受性和超声耐受性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1改良腈水合酶NHM基因突变及其转化体构建

(1)参考清华大学专利(中国发明专利申请号：200910076710.1)所述的方法，采用上游引物：PNH-F：TTTAAGAAGGAGATATACCATGGATGGAT和下游引物：PNH-R：CCGCAAGCTTTCATACGATCACTTC，常规操作扩增红球菌Rhodococcus ruber TH(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.2380)中的腈水合酶基因(序列如SEQ ID NO：3所示)，在37℃下进行NcoI/BamHI双酶切反应4h。将所得酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化(Takara公司)，然后用T4DNA连接酶(Promega公司)在4℃与质粒载体pET-28a(Novagen公司)进行连接反应16h；再将连接反应产物转化宿主菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞(天根生化科技有限公司)，采用卡那霉素抗性(Kan)LB固体培养基(培养基组成为：50ml/300ml摇瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素，50mg/L，琼脂粉，15g/L，pH 7.0)平板挑选阳性克隆，得到含有腈水合酶基因片断的重组质粒pET28-NHase。将重组质粒提交诺赛基因公司进行DNA测序，测序结果表明所得NHase基因具有序列表中SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

以质粒pET28-NHase为模板，采用反向聚合酶链式反应(PCR)方法进行基因突变。设计上游引物A3M-F：AAGAAGGTGACAAGGTCAAAGTGAA和下游引物A3M-R：TGAATTTCGGCTCCGCTCCTGGAA引入3个替换突变Serβ141Lys、Serβ143Lys和Leuβ144Glu。突变用试剂盒Mutan BEST购自Takara公司(大连)，PCR的反应体系为：

反应条件为：94℃，5min；94℃0.5min、60℃0.5min、72℃8min，循环30次；最后72℃15min。扩增产物按试剂盒方法进行连接，获得中间质粒pEN28-NHaseM。进一步以上述质粒为模板，设计上游引物E-F：ACTTGAAAGGAATACGATAATA和下游引物E-R：TCCGCAGAGATCAGTACGGTT携带两个新的氨基酸残基：β230Asp和β231Thr，并通过反向PCR扩增插入腈水合酶基因β亚基末端，PCR反应体系同上，质粒模板替换为pEN28-NHaseM。退火温度下调为55℃。扩增片段按试剂盒方法连接后即获得重组质粒pET-NHM，其中，突变腈水合酶NHM具有β亚基Serβ141Lys、Serβ143Lys和Leuβ144Glu替换突变以及β230Asp和β231Thr插入突变(如图1所示)，其β亚基氨基酸序列为SEQ ID NO：4，α亚基氨基酸序列为SEQ ID NO：2，突变基因序列为SEQ ID NO：5。测序验证后常规电穿孔方法转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，固体LB培养基(卡那霉素抗性)37℃过夜培养至长出大小适中的单菌落，即得转化体BL21(DE3)/pET-NHM。

实施例2本发明改良腈水合酶在转化体中的表达

将实施例1获得的本发明改良腈水合酶因SEQ ID NO：5的诱导型表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-NHM进行摇瓶培养。首先在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中(组成为：50ml/300ml摇瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)接种单菌落，37℃、200rpm培养12h，制作种瓶。

从种瓶中按照1％接种量转接到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基(50ml)中培养2.5h。加入2％的0.5mol/L乳糖，0.2％的0.2mol/L CoCl₂作为诱导剂诱导腈水合酶表达。28℃培养8小时后收获细胞进行酶活测定。

酶活测定以丙烯腈为底物，采用气相色谱法。取3.7ml 50mM pH 7.0的磷酸盐PBS缓冲液(50mM磷酸氢二钠和50mM磷酸二氢钾)和1ml的菌液装入7ml Eppendorf管中，恒温至20℃，加入100μl丙烯腈后迅速混匀，与此同时，按下秒表计时，准确反应5分钟后，加入200μl 2.5M HCl终止反应。将反应液离心后，与0.4％的乙酰胺(内标)溶液等体积混合，采用气相色谱仪GC-2010(SHIMADZU，日本)内标法测量丙烯酰胺浓度。柱温190℃，检测温度260℃，氮气流速，25cm/min。酶活单位定义为每分钟催化生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量。

酶活测定结果表明，重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-NHM表达改良型腈水合酶的酶活为100U/ml，突变前腈水合酶酶活为96U/ml，突变后酶活没有下降，反而略有上升(图2，M2和C1)。

实施例3本发明改良腈水合酶的抗逆性评估

将实施例2收获的50ml重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-NHM细胞(表达改良腈水合酶)与对照菌株E.coli BL21(DE3)/pET-Nhase细胞(表达未突变原腈水合酶)用等体积的无菌水离心洗涤一次，再重悬于等体积的50mM pH 7.0的PBS缓冲液中备用。

各取5ml在PBS缓冲液中重悬的重组细胞，在42℃水浴中放置12h。平行测量改良腈水合酶和原腈水合酶的残留酶活，结果表明，改良腈水合酶残留活性为30％，而未突变腈水合酶的残留活性仅为2％。改良腈水合酶的热稳定性显著提高(如图2，M4和C3)。

各取5ml在PBS缓冲液中重悬的细胞，与等体积20％的丙烯酰胺溶液混合，放置30分钟后测量改良腈水合酶和原腈水合酶的残余酶活。结果表明，改良腈水合酶的残余酶活为82.5％，而原腈水合酶的残余酶活73.5％，改良腈水合酶的产物耐受性提高(如图2，M6和C5)。

各取5ml在PBS缓冲液中重悬的细胞，采用SCIENTZ-2D超声波细胞粉碎机(总功率950W，Ningbo scientz biotechnology CO.，LTD)在30％功率下进行超声破碎2分钟。平行测量改良腈水合酶和原腈水合酶的残余酶活。结果表明，改良腈水合酶的残留活性为73.5％，远高于原腈水合酶的42％，表面改良腈水合酶的超声耐受性显著提高(如图2，M8和C7)。

实施例4本发明改良腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺

如实施例2所述方法培养重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-NHM细胞，用等体积无菌水离心洗涤一次。重悬在四口烧瓶(250mL)中配制细胞悬浮液100mL(腈水合酶酶活为2000U/mL，pH7.5)，冰浴进行催化水合反应。边搅拌边连续滴加丙烯腈，滴加速度以控制反应温度为18～25℃来调节。反应2.5h，测定丙烯酰胺产物浓度达到300g/L。说明突变腈水合酶可以在较高温度下高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。

Claims (9)

1.一种突变腈水合酶，其特征在于：该突变腈水合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.一种编码权利要求1所述突变腈水合酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求2所述的基因。

4.一种转化体，其特征在于：含有权利要求2所述的基因。

5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于：所述转化体为大肠杆菌、诺卡氏菌、红球菌或丙酸棒杆菌。

6.权利要求1所述突变腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

7.权利要求2所述基因在制备丙烯酰胺中的应用。

8.权利要求3所述表达载体在制备丙烯酰胺中的应用。

9.权利要求4或5所述转化体在制备丙烯酰胺中的应用。

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