CN106119268A - 一种提高α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1热稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1热稳定性的方法。以原始型α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1（WT）基因为模板，采用易错 PCR 方法进行随机突变，构建该酶的突变文库，并建立了 96 孔板诱导表达及高通量筛选方法，最终获得了热稳定性提高的突变体。V529A突变体对试验使用的金属离子及效应物都具有与WT同样的耐受性。该突变体V529A具有优良的酶学性质，同时本发明也成功地构建了含上述突变体V529A的重组载体，实现了异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。

Description

一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程的技术领域，尤其涉及一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橘皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。CAZy(http://www.cazy.org/)数据库中糖苷水解酶的分类依据是其氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在四个糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family,GH)，分别是GH13、GH28、GH78和GH106。

α-L-鼠李糖苷酶的来源非常广泛，已有动物组织、植物组织和微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道。目前关于动物组织和植物组织来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过芽孢杆菌、拟杆菌、乳杆菌、链霉菌、单胞菌等细菌和黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、青霉、木霉、酵母、犁头霉等真菌发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。由于黑曲霉是重要的酶制剂生产菌种，其具有重要的糖苷水解酶合成能力，并且是美国食品药品监督管理局允许使用的食品用酶生产菌，本实验采用基因工程技术手段对从原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1进行定向进化。

作为一种重要的工业酶类，α-L-鼠李糖苷酶在饮料加工行业和药物制备行业具有重要的应用价值。例如：在饮料加工行业，该酶可用于对柑橘类果汁进行脱苦处理和澄清处理，消除橙汁中的橘皮苷晶体，增加葡萄酒的香气，提高芦笋汁的抗氧化活性；在药物制备行业，α-L-鼠李糖苷酶可以用来制备具有抗炎和抗病毒的作用的普鲁宁。

在工业生产中，蛋白质热稳定性越高，其应用价值和潜在优势越大。由于大部分天然α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性都存在一定的缺陷，建立一个高效的分子改造的方法提高其热稳定性是极其必要的，为将来开发更多功能，更优质的酶打下坚实的理论及实验基础。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热稳定性提高的α-L-鼠李糖苷酶，该α-L-鼠李糖苷酶可用于饮料加工行业和药物制备行业。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小为1 968bp。

一种α-L-鼠李糖苷酶V529A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该蛋白编码655个氨基酸残基。

一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，含有所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A基因的表达载体pPIC9k-V529A。

一种重组α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组α-L-鼠李糖苷酶V529A。

作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为毕赤酵母。

作为实施例的优选方式，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表达载体转化至寄主细胞毕赤酵母GS115，经甲醇诱导，得到可溶性表达的重组α-L-鼠李糖苷酶V529A。

作为实施例的优选方式，所述的甲醇终浓度为0.5％，诱导温度为30℃。

作为实施例的优选方式，α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的温度范围为30℃～80℃，最适温度为60℃；所述的水解pH范围为3.0～10.0，最适pH为5.0。最适温度及最适pH与WT一致。

以pNPR为底物，分别将WT及V529A分别放置在60℃，65℃，70℃下进行热处理，其中，60℃下每2h取样测定残余酶活，65℃下每15min取样测定残余酶活，70℃下每2min取样测定残余酶活，上述酶反应在其他反应条件固定的情况下测定。初始酶活为没有经过热处理的酶液测定的酶活。结果显示，60℃下V529A的热稳定性比WT提高了1.92h；65℃下V529A的热稳定性比WT提高了25min；70℃下V529A的热稳定性比WT提高了2min。

V529A对试验使用的金属离子及效应物都具有与WT同样的耐受性。

本发明通过易错PCR随机突变的方法得到一株α-L-鼠李糖苷酶热稳定性提高的突变体V529A，发现了该突变体具有优良的酶学特性，可应用于饮料加工行业和药物制备行业。同时，本次发明也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该热稳定性提高的α-L-鼠李糖苷酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。

附图说明

图1为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的SDS-PAGE图。其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的WT；2：纯化后的V529A；

图2为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在60℃时的热稳定性曲线图；

图3为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在65℃时的热稳定性曲线图；

图4为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在70℃时的热稳定性曲线图；

图5为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最适反应温度曲线图；

图6为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最适反应pH曲线图；

图7为α-L-鼠李糖苷酶WT的pH稳定性曲线图；

图8为α-L-鼠李糖苷酶V529A的pH稳定性曲线图。

具体实施方式

实施例1：α-L-鼠李糖苷酶基因的获取

接种含有WT(pPIC9K-rha)质粒的大肠杆菌DH5α于含有1mg/mL氨苄抗性的30mL LB液体培养基中37℃培养16h。

使用质粒小提取试剂盒(Takara公司)按说明提取WT(pPIC9K-rha)质粒。采用EcoRI及Bln I双酶切验证。验证结果正确后作为易错PCR的模板。

实施例2：α-L-鼠李糖苷酶突变库的构建及筛选

将WT基因进行易错PCR，建立突变库，96微孔板对该酶进行诱导表达，经过筛选，获得了热稳性显著提高的突变体。

采用WT(KC750908.1)基因，设计一对特异性引物：

上游引物Q9KF(SEQ ID NO.3)：5′-CCGGAATTCGTACCCTACGAGGAGTACATTCTAG-3′，

下游引物Q9KR(SEQ ID NO.4)：5′-CGCCCTAGGTTACACATTCAACCGCCATTTC-3′；

PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2.5min，35循环后，72℃延伸7min。使用Takara公司PCR产物柱式回收试剂盒对PCR产物进行纯化。

采用酶切克隆的方法构建重组表达质粒，即用EcoRI和BlnI双酶切易错PCR产物，割胶回收酶切后的片段与同样经EcoRI和BlnI双酶切的质粒pPIC9K进行连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中。从氨苄抗性筛选平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定含α-L-鼠李糖苷酶的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，验证阳性克隆率及库容量。

将PCR验证正确的pPIC9K-rha^ep的阳性克隆子提取质粒并使用SalI将所提质粒线性化，采用电击转化法转化至毕赤酵母GS115中，涂于MD平板中30℃培养直至长出单菌落，将所有单菌落分别进行保种并用96孔板进行诱导表达及筛选。将其诱导表达后的酶液在65℃下进行热处理，筛选得到1株热稳定性提高的突变体，提取该突变体的基因组进行PCR实验验证，并进行测序确定该突变体的突变位点。经过序列分析发现，该突变体是529位Val突变为Ala。

实施例3：利用重组表达菌株表达和纯化α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A

将菌种以1％接种量接种于50mLYPD液体培养基中进行菌种活化，30℃振荡培养16h；再以1％的接种量将活化菌种接种至100mL的BMGY培养基，30℃，200r/min，培养16h后，测量确定其OD₆₀₀达到3.0-5.0范围内；利离心10min收集所有菌体，弃上清，将菌体加全部转接至100mLBMMY培养基，30℃，培养7d，培养期间每隔24h则向培养基中加入0.5％无菌甲醇溶液；培养结束，离心收集上清即为酶液。

收集α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A粗酶液，经30kDa的膜进行超滤浓缩，备用。在流速0.5mL/min的条件，用20mmol/L的C₆H₈O₇-Na₂HPO₄缓冲液和0.15mol/L氯化钠溶液对Sephacryl^TMS-200HR进行平衡，将浓缩后的重组酶液进行上样，用1倍柱体积的pH 6.0的平衡缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，进行α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A酶活的测定。将有α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A酶活的样品进行SDS-PAGE电泳分析。经SDS-PAGE检测，纯化后的α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A蛋白的分子量为90kDa，结果如图1所示。

实施例4：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的活性检测

采用对硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷(pNPR)法测定α-L-鼠李糖苷酶的活力。具体操作：以pNPR为底物，取10μL酶液与490μL缓冲液混合，取20μL混合液加入至60μL的0.1％的pNPR溶液和120μL缓冲液在60℃条件下反应10min后，加入200μL的1M的Na₂CO₃终止反应，测定其在410nm处的吸光值，并计算相对酶活。空白对照组为在100℃下处理15min后灭活的WT及V529A。

实施例5：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的热稳定性研究

α-L-鼠李糖苷酶原始型(WT)及突变体(V529A)在60℃，65℃，70℃的热稳定性研究，测定热稳定性时，以灭活菌液作为空白对照，没有经过热处理条件下的酶作为最高酶活计算器相对酶活力。具体操作：

60℃时热稳定性的测定：取WT及V529A的酶液10μL与其对应的最适pH的490μL缓冲液混合，将混合液放在60℃预处理16h，每隔2h取10μL混合液加入体系中并在最适温度下反应并测定其酶活力。测定结果表明：60℃下V529A的热稳定性比WT提高了1.92h，结果如图2所示。

65℃时热稳定性的测定：取WT及V529A的酶液10μL与其对应的最适pH的490μL缓冲液混合，混合液在65℃下预处理90min，每隔10min取10μL酶液加入中并在最适温度下反应并测定其酶活力。测定结果表明：65℃下V529A的热稳定性比WT提高了25min，结果如图3所示。

70℃热稳定性的测定：取WT及V529A的酶液10μL与其对应的最适pH的490μL缓冲液混合，混合液在70℃下预处理16h，每隔2h取10μL酶液加入体系中并在最适温度下反应并测定其酶活力。测定结果表明：70℃下V529A的热稳定性比WT提高了2min，结果如图4所示。

实施例6：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的酶学性质分析

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最适温度在30℃～80℃范围内进行测定。具体操作：以pNPR为底物，取10μL酶液与490μL缓冲液混合，取20μL混合液加入至60uL的0.1％的pNPR溶液和120_μL缓冲液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下反应10min后，加入200μL的1M的Na₂CO₃终止反应，测定其在410nm处的吸光值，并计算相对酶活。空白对照组为在100℃下处理15min后灭活的WT及V529A。测定结果表明：WT及V529A最适温度均为60℃，结果如图5所示。

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A最适pH在3.0～12.0范围内进行测定。具体操作为：以pNPR为底物，取10μL酶液与490μL缓冲液混合，取20μL混合液加入至60μL的0.1％pNPR溶液和120μL缓冲液在60℃下反应10min后，加入200μL1M的Na₂CO₃终止反应。分别将WT及V529A在pH 3.0～8.0，pH 8.0～10.0及pH 10.0～12.0中测定酶活，在其它条件一致下进行酶反应，空白对照组为在100℃下处理15min后灭活的WT及V529A。反应终止后，吸取200μL到酶标板中，用酶标仪测定吸光值，根据标准曲线计算酶活。测定结果表明：WT及V529A最适pH均为5.0，结果如图6所示。

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的pH稳定性在3.0～12.0范围内进行测定。具体操作为：将10μLWT及V529A酶液分别在490μLpH 3.0～8.0，pH 8.0～10.0，pH 10.0～12.0的缓冲液中30℃下处理1h后，取出20uL处理液加入至60μL的0.1％pNPR溶液和120μL对应缓冲液在60℃下反应10min后，加入200μL 1M的Na₂CO₃终止反应，测定其在410nm处的吸光值，并计算相对残余酶活作图。空白对照为没有经过各pH，30℃下处理的酶液。测定结果表明：WT及V529A在pH 3.0～8.0内都能够维持80％以上的酶活性，该酶具有很宽泛的pH耐受性，且比较嗜酸性。在pH 8.0～10.0范围内，WT及V529A仍旧可以维持60％以上的活性，证明该酶对碱性也有一定的耐受性。但在pH 10.0以上，该酶完全失活，证明在强碱性的条件下，该酶会受到很大的影响，结果如图7及图8所示。

金属离子对α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的影响的测定具体操作为：取10μL WT及V529A酶液与含有不同浓度的金属离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺)的缓冲液混合至500μL，将混合液放置在30℃下处理1h后，取10μL酶液加入其对应的最适反应体系中反应15min后，测定其酶活力。其空白对照组为没有经过金属离子处理的酶液。测定结果，如表1所示：1mM及10mM的K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Zn²⁺对WT及V529A都有一定的激活作用，Zn²⁺及Ca²+可以显著提高酶活性。1mM的Fe²⁺对酶活性没有影响，但是10mM的Fe²⁺抑制酶的活性，1mM及10mM的Fe³⁺对酶活性影响很大。由此结果可知，V529A突变位点并不会造成金属离子对WT的影响，能够与WT保持对金属离子同样的耐受性。

表1金属离子对WT及V529A的影响

效应物对α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A活性的影响的测定具体操作为：取10μL WT及V529A酶液与含有不同浓度的效应物(SDS、β-ME、EDTA、DTT)的缓冲液混合至500μL，将混合液放置在30℃下处理1h后，取10μL酶液加入其对应的最适反应体系中反应10min后，加入200μL 1M的Na₂CO₃溶液终止反应，测定其酶活力。其空白对照组为没有经过效应物处理的酶液。测定结果如表2所示：10mM的SDS对WT及V529A酶活影响较大，而对其它浓度的效应物耐受性则较强，几乎对酶活没有产生影响。

表2不同效应物对WT及V529A的影响

综上所述，本发明筛选得到了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶热稳定性提高的突变体，发现了该突变体具有优良的酶学特性，可应用于饮料加工行业和药物制备行业。同时，本次发明也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该酯酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种α-L-鼠李糖苷酶V529A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因的表达载体pPIC9k-V529A。

4.一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得α-L-鼠李糖苷酶V529A。

5.根据权利要求4所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所述的寄主细胞为毕赤酵母。

6.根据权利要求5所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶表达载体转化至寄主细胞毕赤酵母GS115，经甲醇诱导，得到可溶性表达的重组α-L-鼠李糖苷酶。

7.根据权利要求6所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所述的甲醇终浓度为0.5%，诱导温度为30℃。

8.根据权利要求4所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所获得的α-L-鼠李糖苷酶V529A具有以下热稳定性特征：60ºC下V529A的热稳定性比WT提高了1.92h；65 ºC下V529A的热稳定性比WT提高了25 min；70 ºC下V529A的热稳定性比WT提高了2 min。

9.根据权利要求4所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所获得的α-L-鼠李糖苷酶V529A具有以下特征：α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的温度范围为30℃~80℃，pH范围为3.0~10.0。

10.根据权利要求9所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所获得的α-L-鼠李糖苷酶V529A具有以下特征：α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的最适温度为60℃，最适pH为5.0。