CN113088528B

CN113088528B - 一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用

Info

Publication number: CN113088528B
Application number: CN202110331543.1A
Authority: CN
Inventors: 倪辉; 李利君; 孙江; 李文静; 龚建业; 李清彪; 姜泽东
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113088528A

Abstract

本发明公开了一种专一性转化橙皮苷生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的α‑L‑鼠李糖苷酶、基因及其表达制备方法，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。该酶是以黑曲霉来源的α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1基因进行定点突变得到突变体S303R基因，在毕赤酵母SMD1168中表达制备而得到。该酶只水解橙皮苷，而不水解其他柑橘黄酮，可以将柑橘粗黄酮中的橙皮苷特异水解生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，从而提高橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的制备效率，为橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的工业化制备提供了重要的工具酶。

Description

一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种序列改良的α-L-鼠李糖苷酶突变酶（突变体）、编码基因及表达制备方法，该α-L-鼠李糖苷酶突变酶能够专一转化橙皮苷生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷。

背景技术

橙皮素-7-O-葡萄糖苷，分子式为C₂₂H₂₄O₁₁，是由橙皮苷脱掉1分子鼠李糖后的产物，是橙皮苷/橙皮素衍生物，非糖部分都是橙皮素。橙皮素7-O-葡萄糖苷的水溶性是橙皮苷的50倍，其生物利用度比橙皮苷好，橙皮素7-O-葡萄糖苷开环加氢后是一种新型低热值甜味剂，即橙皮素二氢查耳酮的单葡萄糖，是一种新型甜味剂的前体物质。目前，橙皮素7-O-葡萄糖苷的制备方法有化学法和生物转化法。化学法的制备条件难以控制，且目标产物容易进一步水解为橙皮素，从而使得目标产物得率较低，且易对环境造成严重污染；而酶法生物合成的条件温和，不会引起橙皮苷母核结构的变化。

柑橘黄酮粗提物中含有大量黄酮糖苷类化合物，包括橙皮苷及新橙皮苷。目前，主要是利用α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷或新橙皮苷制备橙皮素7-O-葡萄糖苷。α-L-鼠李糖苷酶[E.C.3.2.1.40]可作用于黄酮糖苷类物质中α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键连接的L-鼠李糖。当α-L-鼠李糖苷酶作用于柑橘黄酮粗提物时，不仅产生橙皮素7-O-葡萄糖苷，还会有其他副产物生成。以含橙皮苷或新橙皮苷的柑橘黄酮粗提物为原料制备橙皮素7-O-葡萄糖，需先将原料纯化成橙皮苷或新橙皮苷，再经过α-L-鼠李糖苷酶水解，再进一步纯化为橙皮素7-O-葡萄糖，需要经过2次纯化及2次浓缩结晶才能制备得到橙皮素7-O-葡萄糖，该工艺复杂，得率低。

发明内容

本发明的目的在于制备专一性转化橙皮苷的α-L-鼠李糖苷酶，可用于将柑橘粗提物中的橙皮素特异性转化为橙皮素7-O-葡萄糖苷，避免其他副产物的生成，避免二次纯化，节约成本。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案包括：

一种编码α-L-鼠李糖苷酶突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶，所述突变酶由所述基因编码，所述突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

所述基因的突变方法为，采用基因工程技术手段对从原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1进行定向进化，得到突变酶S303R的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示（1968 bp），其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示（655个氨基酸残基）。

一种表达制备所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶的方法，表达载体为pPIC9k-S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导终浓度为0.5 %，诱导温度为30℃。

对所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶进行表达制备，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶S303R表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组α-L-鼠李糖苷酶S303R。其中，表达载体为pPIC9k-S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导浓度为0.5 %，诱导温度为30℃。

与其他相关酶相比，本发明提供的α-L-鼠李糖苷酶突变酶S303R在催化含有橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、枸橘苷等成分的黄酮粗提取物时，可特异性转化橙皮苷，没有其他副产物生成，且转化率大幅度提高。该方法制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2 α-L-鼠李糖苷酶WT及S303R的SDS-PAGE图。其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的WT；2：纯化后的S303R。

图2为根据本发明实施例4的WT及S303R最适温度曲线图。

图3为根据本发明实施例4的WT及S303R最适pH曲线图。

图4为根据本发明实施例5、6、7及对比例1、2、3的WT及S303R针对柑橘黄酮粗提物的底物特异性统计图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1：α-L-鼠李糖苷酶突变酶S303R编码基因表达载体的构建

接种含有WT(pPIC9K-r-Rha1)质粒的大肠杆菌DH5α于含有1 mg/mL氨苄抗性的30mL LB液体培养基中37 ℃培养16 h。使用质粒小提取试剂盒按说明提取WT((pPIC9K-r-Rha1)质粒。使用TOYOBO生物科技有限公司的定点突变试剂盒构建突变体，步骤如下：

①反向PCR

将合成的引物都稀释成10 µM，模板质粒 pPIC9K-r-Rha1的浓度调整至50 ng/µL后其反向PCR的反应体系如下：17.5 µL的无菌水，2.5 µL的10×Buffer for iPCR；2.5 µL的2 mM dNTPs；0.75 µL的引物S303R-F、S303R-R；0.5 µL的模板质粒；0.5 µL的KOD-Plus。

PCR反应条件：94 ℃条件下预变性2 min，98 ℃条件下变性10 s，68℃条件下延伸12 min，循环13次后在4 ℃条件下保存。

其中引物如下：S303R-F CGCTTCACCTACCATCTGCACAGCCTGGTT

S303R-R GACCGTGTCGTAGAATGGCTTTCCAGCATA

②用Dpn I酶切质粒模板

向步骤①得到的PCR反应液中（25 µL）加入1 µL的Dpn I，轻轻吸打混匀后，在37℃条件下反应1 h。

③反向PCR产物的自身环化

另取一个PCR管，向其中加入7 µL的无菌水；1 µL的T4 Polynuleotide Kinase 5µL的Ligation high；2 µL的步骤②中得到的反应液，将混匀后的PCR管放在PCR仪中16 ℃条件下反应1 h。

将构建的突变体质粒pPIC9K-S303R利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。从氨苄抗性筛选平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定含pPIC9K-S303R的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，验证阳性克隆。

将验证正确的pPIC9K-S303R的阳性克隆子提取质粒并使用Sal I将所提质粒线性化，采用电击转化法转化至毕赤酵母SMD1168中，涂于MD平板中30 ℃培养直至长出单菌落。从MD平板上挑取单菌落，转接于含G418（终浓度为2.5 mg/mL）抗性的YPD平板上，在恒温培养箱中30 ℃条件下倒置培养至有单菌落生长。挑取单菌落，转接于10 mL的YPD液体培养基中，在30 ℃、180 rpm条件下过夜培养18 h，将活化菌液进行保种和阳性鉴定。将鉴定成功后保藏的菌种进行发酵。

实施例2：利用重组表达菌株表达和纯化α-L-鼠李糖苷酶WT及突变酶S303R

将实施例1制备的菌种以1％接种量接种于50mL YPD液体培养基中进行菌种活化，30℃振荡培养16 h；再以1％的接种量将活化菌种接种至100 mL的BMGY培养基，30℃，200rpm，培养16 h后，测量确定其OD600达到3.0-5.0范围内；离心10min收集所有菌体，弃上清，将菌体加全部转接至100mL BMMY培养基，30℃，培养7 d，培养期间每隔24 h则向培养基中加入0.5％无水甲醇；培养结束，离心收集上清即为酶液。

收集α-L-鼠李糖苷酶WT及突变酶S303R粗酶液，经30 kDa的膜进行超滤浓缩，备用。经Sephacry S-200HR凝胶柱进行纯化后，通过SDS-PAGE检验，如图1所示，WT及突变酶S303R均为单一条带，大小为100 kDa。

实施例3 α-L-鼠李糖苷酶WT及S303R底物特异性研究

以0.5 mmol/L的柚皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、枸橘苷为底物，测定纯化后的WT和S303R的底物特异性水解率，反应体系为：1 mL 0.5 mmol/L 柚皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、枸橘苷，980 µL的0.02 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0），在60℃条件下温育10 min后迅速加入20 µL酶液，反应10 min后放入100℃的沸水中煮沸10 min终止反应。用1 mL注射器取1 mL反应液，通过0.22 µm的水相滤膜注入1.5 mL的液相瓶中，最后通过安捷伦1260液相色谱仪测定残余底物浓度，测定残余底物浓度表明不同酶的底物特异性转化率空白对照是在对应的pH条件下，100℃下处理30 min的灭活WT和S303R。测定结果如表1所示，S303R仅对橙皮苷有生物转化作用，且与WT相比，转化率提高了36.7 %。

表1：

转化率	橙皮苷	芸香柚皮苷	柚皮苷	枸橘苷
					WT	43.68%	98.69%	25.96%	27.86%
S303R	59.73%	0	0	0

实施例4：α-L-鼠李糖苷酶S303R最适温度及pH研究

以0.5 mmol/L 的橙皮苷为底物，按实施例3的反应体系，将反应液放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同的温度环境中温育10 min，沸水浴10 min终止反应后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100℃下处理30 min的灭活WT和S303R。结果如图2所示，最适温度为60 ℃。

以0.5 mmol/L 的橙皮苷为底物，按实施例3的反应体系，将其放在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的反应液，在60℃条件下温育10 min，沸水浴10 min终止反应后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100℃下处理30 min的灭活WT和S303R。结果如图3所示，最适pH为4.0。

实施例5：α-L-鼠李糖苷酶S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性研究

对比例1：以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在pH3.0的反应液中，在30℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30 min的灭活WT，分析WT对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性。

以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在pH3.0的反应液中，在30 ℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30min的灭活S303R。分析S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性，结果如图4所示，突变体酶S303R只对黄酮粗提物中橙皮苷有水解作用，对其他黄酮类化合物均无作用。

实施例6：α-L-鼠李糖苷酶S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性研究

对比例2：以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在Ph4.0的反应液中，在60 ℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30 min的灭活WT，分析WT对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性。

以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在pH4.0的反应液中，在60 ℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30min的灭活S303R。分析S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性，结果如图4所示，突变体酶S303R只对黄酮粗提物中橙皮苷有水解作用，对其他黄酮类化合物均无作用。

实施例7：α-L-鼠李糖苷酶S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性研究

对比例3：以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在pH7.0的反应液中，在80 ℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30 min的灭活WT，分析WT对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性。

以0.5 mmol/L 的柑橘黄酮粗提物为底物，按照实施例3的反应体系，将其放在pH7.0的反应液中，在80 ℃条件下温育10 min。沸水浴10 min终止反后，将反应液用0.22 µm的滤膜过滤后，通过高效液相色谱检测其残余底物的浓度。空白对照是在100 ℃下处理30min的灭活S303R。分析S303R对粗提物中主要黄酮类化合物水解特性，结果如图4所示，突变体酶S303R只对黄酮粗提物中橙皮苷有水解作用，对其他黄酮类化合物均无作用。

综上所述，本发明通过定点突变的方法得到一株α-L-鼠李糖苷酶突变体S303R，发现了该突变体具有优良的酶学特性，并对该突变体S303R相关的编码基因进行了测序。与WT相比，在催化橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、枸橘苷等黄酮类化合物时，可特异性转化橙皮苷，没有其他副产物生成，且转化率提高了36.7%。当突变体酶S303R作用于柑橘黄酮粗提物时，只对橙皮苷有水解作用，生成相应的橙皮素-7-O-葡萄糖苷。该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好，避免二次纯化，节约成本等优点，具有广阔的应用前景，为橙皮素-7-O-葡萄糖苷的工业化制备提供了重要的工具酶。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶、基因及表达制备方法

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggtctt cctggctgct gtcggcatta ctggccactg aagcgttggc cgtaccctac 60

gaggagtaca ttctagcccc gagctctcgc gacttggctc ctgcgtccgt tcgccaggtg 120

aacggttccg tcaccaatgc ggccgctttg accggtgctg gtggacaggc cacttttaat 180

ggcgtctcgt cagtcacata cgattttggc atcaatgttg ctggtattgt gtctgtggat 240

gtcgcttccg cctcctccga gtccgccttt atcggcgtga ccttcaccga gtctagtatg 300

tggattagta acgaggcatg cgatgctacc caggatgcgg gtcttgacac tcccctctgg 360

tttgctgtcg gacagggagc gggtgtgtat tcagtgggga agaagtacac ccggggtgcc 420

ttccggtata tgacggtcgt tagcaacaca accgccacag tctccctcaa cagcgtcaag 480

atcaactata cggcatctcc catacaggac ctccgtgcat acacggggta cttccacagc 540

agtgatgaac tcctcaaccg catctggtat gccggtgcgt ataccttaca actatgcagt 600

atcgatccca ccacgggaga cgctttggtg ggactgggcg ccatcacctc gtctgagacc 660

atcacgctgc cgcagacgga caagtggtgg accaactaca ccatcaccaa tggcagcagt 720

acgttgacgg atggagccaa acgtgaccga cttgtctggc caggtgacat gtccattgct 780

ttggagagtg tagctgtcag taccgaggat ctgtatagtg tccgcacagc gttggaatct 840

ttgtatgctc ttcagaaagc cgatggccaa cttccctatg ctggaaagcc attctacgac 900

acggtcaggt tcacctacca tctgcacagc ctggttggcg cggcatctta ttaccaatac 960

actggggacc gcgcgtggtt gacccggtat tggggtcagt acaagaaggg tgttcaatgg 1020

gcgttgtcgg gcgtggacag cacaggtctg gccaatatca cagccagtgc tgactggctg 1080

aggtttggca tgggggcaca taatatcgaa gcgaacgcaa tcctgtacta tgttctcaat 1140

gatgccatct ctctcgccca gtctctgaat gacaacgcac ccatcaggaa ttggactgct 1200

actgcagccc ggatcaagac agtggcaaac gaactccttt gggacgacaa gaacggactc 1260

tataccgaca acgagaccac caccctgcac ccgcaagacg gcaactcctg ggctgtcaag 1320

gcaaacctga ccctctcggc caaccagagt gccatcatct ctgaatcgct cgctgcccgc 1380

tggggcccat acggagctcc cgccccagag gcaggcgcaa cggtgtcgcc tttcatcggc 1440

ggtttcgagc tgcaggccca ctaccaggcc ggccagcccg accgcgcact tgatttactg 1500

cggttgcagt ggggattcat gctggacgac ccgcggatga ccaactcgac tttcatcgag 1560

gggtactcca cggacggatc gctggtatac gcgccgtaca ccaataggcc gcgagtgtcg 1620

cacgcgcacg ggtggtccac gggcccgacg tcagcattga ccatctacac ggccgggttg 1680

cgtgtcaccg gaccagcggg tgcgacctgg ctgtacaagc cacagccggg aaatttgacc 1740

caagttgaag ctgggtttag tacccggctg gggtcgtttg cgtcaagctt cagcagatca 1800

gggggtagat atcaggaact gtcgttcacc actccgaacg ggacgactgg ctcggtggag 1860

ctgggggatg tgagtggaca attagtctcg gaggggggag tgaaggtgca gttagtggga 1920

ggtaaggcga gtggactgca gggtgggaaa tggcggttga atgtgtaa 1968

<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Trp Ser Ser Trp Leu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Thr Glu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Val Pro Tyr Glu Glu Tyr Ile Leu Ala Pro Ser Ser Arg Asp Leu

20 25 30

Ala Pro Ala Ser Val Arg Gln Val Asn Gly Ser Val Thr Asn Ala Ala

35 40 45

Ala Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gln Ala Thr Phe Asn Gly Val Ser Ser

50 55 60

Val Thr Tyr Asp Phe Gly Ile Asn Val Ala Gly Ile Val Ser Val Asp

65 70 75 80

Val Ala Ser Ala Ser Ser Glu Ser Ala Phe Ile Gly Val Thr Phe Thr

85 90 95

Glu Ser Ser Met Trp Ile Ser Asn Glu Ala Cys Asp Ala Thr Gln Asp

100 105 110

Ala Gly Leu Asp Thr Pro Leu Trp Phe Ala Val Gly Gln Gly Ala Gly

115 120 125

Val Tyr Ser Val Gly Lys Lys Tyr Thr Arg Gly Ala Phe Arg Tyr Met

130 135 140

Thr Val Val Ser Asn Thr Thr Ala Thr Val Ser Leu Asn Ser Val Lys

145 150 155 160

Ile Asn Tyr Thr Ala Ser Pro Ile Gln Asp Leu Arg Ala Tyr Thr Gly

165 170 175

Tyr Phe His Ser Ser Asp Glu Leu Leu Asn Arg Ile Trp Tyr Ala Gly

180 185 190

Ala Tyr Thr Leu Gln Leu Cys Ser Ile Asp Pro Thr Thr Gly Asp Ala

195 200 205

Leu Val Gly Leu Gly Ala Ile Thr Ser Ser Glu Thr Ile Thr Leu Pro

210 215 220

Gln Thr Asp Lys Trp Trp Thr Asn Tyr Thr Ile Thr Asn Gly Ser Ser

225 230 235 240

Thr Leu Thr Asp Gly Ala Lys Arg Asp Arg Leu Val Trp Pro Gly Asp

245 250 255

Met Ser Ile Ala Leu Glu Ser Val Ala Val Ser Thr Glu Asp Leu Tyr

260 265 270

Ser Val Arg Thr Ala Leu Glu Ser Leu Tyr Ala Leu Gln Lys Ala Asp

275 280 285

Gly Gln Leu Pro Tyr Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Asp Thr Val Arg Phe

290 295 300

Thr Tyr His Leu His Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Tyr Tyr Gln Tyr

305 310 315 320

Thr Gly Asp Arg Ala Trp Leu Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Tyr Lys Lys

325 330 335

Gly Val Gln Trp Ala Leu Ser Gly Val Asp Ser Thr Gly Leu Ala Asn

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Ala Asp Trp Leu Arg Phe Gly Met Gly Ala His Asn

355 360 365

Ile Glu Ala Asn Ala Ile Leu Tyr Tyr Val Leu Asn Asp Ala Ile Ser

370 375 380

Leu Ala Gln Ser Leu Asn Asp Asn Ala Pro Ile Arg Asn Trp Thr Ala

385 390 395 400

Thr Ala Ala Arg Ile Lys Thr Val Ala Asn Glu Leu Leu Trp Asp Asp

405 410 415

Lys Asn Gly Leu Tyr Thr Asp Asn Glu Thr Thr Thr Leu His Pro Gln

420 425 430

Asp Gly Asn Ser Trp Ala Val Lys Ala Asn Leu Thr Leu Ser Ala Asn

435 440 445

Gln Ser Ala Ile Ile Ser Glu Ser Leu Ala Ala Arg Trp Gly Pro Tyr

450 455 460

Gly Ala Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ala Thr Val Ser Pro Phe Ile Gly

465 470 475 480

Gly Phe Glu Leu Gln Ala His Tyr Gln Ala Gly Gln Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Leu Asp Leu Leu Arg Leu Gln Trp Gly Phe Met Leu Asp Asp Pro Arg

500 505 510

Met Thr Asn Ser Thr Phe Ile Glu Gly Tyr Ser Thr Asp Gly Ser Leu

515 520 525

Val Tyr Ala Pro Tyr Thr Asn Arg Pro Arg Val Ser His Ala His Gly

530 535 540

Trp Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Leu Thr Ile Tyr Thr Ala Gly Leu

545 550 555 560

Arg Val Thr Gly Pro Ala Gly Ala Thr Trp Leu Tyr Lys Pro Gln Pro

565 570 575

Gly Asn Leu Thr Gln Val Glu Ala Gly Phe Ser Thr Arg Leu Gly Ser

580 585 590

Phe Ala Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Gly Arg Tyr Gln Glu Leu Ser

595 600 605

Phe Thr Thr Pro Asn Gly Thr Thr Gly Ser Val Glu Leu Gly Asp Val

610 615 620

Ser Gly Gln Leu Val Ser Glu Gly Gly Val Lys Val Gln Leu Val Gly

625 630 635 640

Gly Lys Ala Ser Gly Leu Gln Gly Gly Lys Trp Arg Leu Asn Val

645 650 655

Claims

1.一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶在专一性转化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用，其特征在于，所述突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，表达制备所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶的方法为：表达载体为pPIC9k-S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导终浓度为0.5 %，诱导温度为30℃。