CN111944865B

CN111944865B - 一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用

Info

Publication number: CN111944865B
Application number: CN202010897913.3A
Authority: CN
Inventors: 肖敏; 季璇; 徐莉; 张婷婷
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN111944865A

Abstract

本发明涉及一种细菌来源的α‑L‑鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷中的应用。本发明中的α‑L‑鼠李糖苷酶FjRha的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因从约氏黄杆菌的基因组中克隆得到。该α‑L‑鼠李糖苷酶FjRha可以专一性水解人工底物和含有α‑1,6鼠李糖苷键的天然底物，可以高效特异性催化橙皮苷制备橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，在酶用量8U/mL，pH 7.0，37℃条件下催化3g/L的橙皮苷生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的转化率高达95％以上，该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用

技术领域

本发明涉及一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用，属于糖工程技术领域。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)，能够特异性水解糖苷、糖脂和其他天然产物的末端α-L-鼠李糖，在自然界中分布广泛，微生物是该酶的主要来源。α-L-鼠李糖苷酶可以有效地水解许多天然糖苷类物质，例如人参皂苷、柚皮苷、橙皮苷和芦丁等的末端鼠李糖苷键，作为生物催化剂，可用于使果汁脱苦、葡萄酒增香，或生物转化芦丁等黄酮类化合物生产具有更高应用价值的产品，是食品、医药等领域重要的糖苷水解酶类。

有关α-L-鼠李糖苷酶催化应用的研究，主要集中在真菌来源的酶类，对细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶研究较少。中国专利文献CN104312996A(申请号CN201410504753.6)、CN104762281A(申请号CN201510102927.0)、CN106191084A(申请号CN201610589986.X)CN107287223A(申请号CN201740468317.1)、CN108467858A(申请号CN201810110773.3)等分别公开了采用真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶用于水解鼠李糖苷化合物的生物催化。真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶，往往在原核的异源表达系统中产量低，主要通过原始菌株发酵或者酵母异源表达系统表达获得，如上述专利所述。但这些方法获得的α-L-鼠李糖苷酶通常与来源于宿主的其他糖苷酶，例如葡萄糖苷酶，密切共存；或者α-L-鼠李糖苷酶本身水解键型不专一，兼具水解其他糖苷键的活性，使用这种α-L-鼠李糖苷酶，会对催化底物上其他糖苷键非特异性水解，产生大量副产物，降低底物的利用度，增加有效产物的分离难度。因此迫切需要开发水解键型专一，并且适用于原核表达系统高效表达的细菌来源的鼠李糖苷酶，用于天然产物的水解修饰。

橙皮素-7-O-葡萄糖苷(Hesperetin-7-O-glucoside，H7G)是一类重要的产品，其主要作为底物用于酶催化生产新橙皮苷(Neohesperidin)，新橙皮苷再通过催化加氢生成新橙皮苷二氢查尔酮。橙皮素-7-O-葡萄糖苷也直接可通过催化加氢生成橙皮素二氢查尔酮-7-O-葡萄糖苷。新橙皮苷二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮-7-O-葡萄糖苷都是具有巨大应用潜力的食品添加剂，甜味很高且持续时间长，稳定性好，热量低，且不会影响人体的血脂和血糖水平，因此可广泛用于医药、食品和饲料工业。

生物催化法制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷，因其步骤简单，条件温和，环境友好，具有很高的经济价值。生物催化法以橙皮苷(Hesperidin)为起始底物，通过橙皮苷酶或者鼠李糖苷酶水解除去橙皮苷的α-1,6鼠李糖苷键连接的末端鼠李糖，生成重要产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷。但是利用现有的橙皮苷酶或者鼠李糖苷酶催化，通常会由于酶的非专一性水解，水解掉除鼠李糖外的葡萄糖，生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的混合物，致使目的产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷的产率很低，且难以和副产物橙皮素进行分离，不适合规模化应用。橙皮苷、新橙皮苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷的分子结构如下所示。他们均具有双氢黄酮结构，其中橙皮苷中L-鼠李糖以α-1,6糖苷键连接在葡萄糖基上，新橙皮苷中L-鼠李糖以ɑ-1,2糖苷键连接在葡萄糖基上，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的葡萄糖基上没有鼠李糖。

为高效获得橙皮素-7-O-葡萄糖苷，Rodriguez等在2015年提出一种固定化酶的方法将真菌(土曲霉)来源的α-L-鼠李糖苷酶固定在基质上，利用橙皮苷的水解反应制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷，产率为93％(Céliz G,Rodriguez J,Soria F,Daz M.Synthesis ofhesperetin7-O-glucoside from flavonoids extracted from Citrus waste usingboth free and immobilizedα-L-rhamnosidases[J].Biocatalysis&AgriculturalBiotechnology,2015,4(3):335-41.)。但目前尚未有来源于细菌的α-L-鼠李糖苷酶用于制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷的高产率的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，尤其是现有来源于细菌的可高效表达的鼠李糖苷酶研究的不足，以及现有鼠李糖苷酶水解键型不专一的问题，本发明提供了一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶FjRha在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)。

根据本发明优选的，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha专一性水解α-1,6鼠李糖苷键。

根据本发明优选的，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha按照以下方法获得：以约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)基因组DNA为模板，设计引物P1和P2，PCR扩增获得α-L-鼠李糖苷酶FjRha的编码基因序列，将PCR扩增产物和表达载体pET28a分别用Nhe I和EcoR I双酶切，纯化、连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌，在LB培养基中培养至对数生长期，然后经IPTG诱导表达，收集菌体，破壁纯化后得α-L-鼠李糖苷酶FjRha；所述IPTG的终浓度为0.1-0.5mM；诱导温度为16℃；诱导时间为10-30h；所述引物的序列为：

P1：5’-AATTGCTAGCAATTGTTCCAGAGTTTGTTTT-3’,下划线表示Nhe I酶切位点，

P2：5’-GCCGGAATTCCTAAACCGCTTTTCCATTT-3’,下划线表示EcoR酶切I位点。

根据本发明优选的，所述高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用是以橙皮苷为底物，具体步骤如下：

以橙皮苷为反应底物，在α-L-鼠李糖苷酶FjRha1的生物催化作用下，于温度20-50℃，pH6.0～10.0条件下反应5-25小时，得唯一产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷。

优选的，所述橙皮苷的浓度为0.5-5g/L，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha的用量为1-10U/mL。

优选的，所述温度为40℃，所述pH为7.0。

有益效果：

本发明首次克隆并重组表达了来源于约氏黄杆菌的α-L-鼠李糖苷酶FjRha，该酶能专一性水解α-1,6鼠李糖苷键。α-L-鼠李糖苷酶FjRha的水解键型专一，在以橙皮苷为底物制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷时不会产生副产物橙皮素，可以高效特异性催化橙皮苷制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷；由于在生产时不会产生副产物，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的分离简单，适宜大规模生产。本发明中在α-L-鼠李糖苷酶FjRha用量为8U/mL，pH 7.0，37℃条件下催化3g/L的橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的转化率高达95％以上，该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景，为橙皮素-7-O-葡萄糖苷的工业化制备提供了重要的工具酶。

附图说明

图1为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的蛋白质SDS-PAGE电泳图；图中M泳道为蛋白质分子量Marker；1泳道为pET28a/FjRha表达菌株粗酶液，2泳道为纯化过程中的流穿液，3泳道为纯化后的酶液。

图2为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶学性质研究；其中图a为反应体系pH对酶活和酶稳定性的影响；图b为反应体系温度对酶活和酶稳定性的影响，纵坐标为相对酶活。

图3为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的TLC图谱；图中1为橙皮素-7-O-葡萄糖苷标品，2为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的反应液。

图4为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的HPLC图谱；图中a为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的反应液的HPLC图谱，b为底物橙皮苷标准品HPLC图谱。

图5为重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷反应液的MS图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护的范围并不仅限于此。下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为市售生物、化学实验用材料。

实施例1：α-L-鼠李糖苷酶FjRha基因的克隆、表达及纯化

以来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(http://www.cgmcc.net/)的约氏黄杆菌(CGMCC No.1.8922)的基因组DNA为模板，根据NCBI数据库中约氏黄杆菌基因组中预测的鼠李糖苷酶(GenBank accession No.ABQ07113.1)的基因序列设计上、下游引物P1和P2，进行PCR扩增，PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测、纯化，并通过PCR回收试剂盒进行回收，得到约氏黄杆菌α-L-鼠李糖苷酶FjRha的基因片段；

其中，上、下游引物P1和P2的序列如下：

P2：5’-GCCGGAATTCCTAAACCGCTTTTCCATTT-3’,下划线表示EcoR酶切I位点；

PCR扩增的条件是：预变性98℃4min；高温变性98℃30s，低温退火57℃1min，适温延伸72℃2min，循环30次；最后72℃延伸10min。

Nhe I和EcoR I限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段，T4连接酶16℃下连接4h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含50mg/L氨苄的LB平板，37℃恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养8-10h，提取质粒进行序列测定，α-L-鼠李糖苷酶FjRha的编码基因大小为2187bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，得重组质粒pET28a/FjRha。

取重组质粒pET28a/FjRha 1μL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布于含50mg/L氨苄的LB平板，37℃恒温培养过夜，筛选阳性克隆。将阳性克隆接种于20mL含50mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃培养10h，按照1％的接种量接种于1L含50mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃培养3h，当OD₆₀₀达到0.6时(对数生长期)，加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导，100rpm摇床培养，16℃诱导20h。

将诱导后的培养液8000g离心10min后收集菌体，用40mL Binding buffer重悬，用超声破壁仪破壁后，12000g离心取上清。以5mL Ni-NTA凝胶装柱，40mL Binding Buffer平衡柱子后，将处理好的上清经过0.22μm的滤膜过滤后上样。用40mL Binding Buffer洗柱，再取60mL Washing Buffer洗柱，最后用20mL Elution buffer洗脱并分步收集洗脱液，以Nanodrop2000(Thermo)测定蛋白浓度并经SDS-PAGE检测，如图1，SDS-PAGE显示纯化出的蛋白的分子量在83kDa左右，与预测分子量83.6kDa一致。收集的蛋白洗脱液用pH＝8的50mM的Tris-HCl超滤除盐，得重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha。

纯化中所用缓冲液组成如下：

Binding Buffer:pH 7.5 50mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl；

Washing Buffer:pH 7.5 50mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，50mM咪唑；

Elution Buffer:pH 7.5 50mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，250mM咪唑。

实施例2：重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶学性质

2.1酶活测定

取20μL酶液，加入2mM的pNP-Rha溶液60μL(pH 6.5，50mM磷酸钠缓冲液配制)，37℃下反应10min，加入120μL的5mM的碳酸钠溶液终止反应，OD₄₀₅nm检测吸光度。测得重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha酶液的酶活为1U/mg酶蛋白。

酶活定义为：每分钟水解pNP-Rha释放1μmol的对硝基苯酚为1个酶活单位(U)。

2.2酶水解底物特异性测定

以pNP-Rha、橙皮苷、柚皮苷和芦丁为底物，检测重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha对人工底物pNP-Rha和含有不同鼠李糖苷键天然底物的水解活性。

底物水解特异性反应是在pH 7.0的50mM磷酸钠溶液中进行的，各个底物的终浓度为5mM，加入0.2Uα-L-鼠李糖苷酶FjRha在37℃下反应27h，反应完成后取1μL反应液在TLC板上点样，TLC板进行展层显色，底物特异性见表1。

表1.α-L-鼠李糖苷酶FjRha水解底物特异性测定

由表1可知，重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha不仅可水解人工底物硝基苯鼠李糖pNP-Rha，还能够水解芦丁和橙皮苷中的α-1,6鼠李糖苷键，但不能水解柚皮苷中的α-1,2鼠李糖苷键，因此，该α-L-鼠李糖苷酶FjRha为专一性水解α-1,6鼠李糖苷键的鼠李糖苷酶，并具有较广泛的天然底物识别能力。

2.3pH对酶活和酶稳定性的影响

最适pH测定方法：在不同pH(3.0-12.0)的广泛缓冲液下，按照2.1酶活测定方法测定重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％，其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制最适pH曲线。

pH的稳定性的测定方法：将重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha放在不同pH(3.0-12.0)的广泛缓冲液下，4℃过夜后，按照2.1酶活测定方法测定重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％，其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制pH稳定性曲线。

pH对酶活和酶稳定性的影响测定结果如图2a，pH 6.0～9.0有较高活性，相对酶活均高于70％，最适pH为7.0；在不同pH的缓冲液中4℃过夜之后，pH 6.0～10.0之间酶活稳定，相对酶活均高于60％。

其中，广泛缓冲液组分如下：磷酸二氢钾3.893g、巴比妥5.266g、硼酸1.769g、柠檬酸6.008g，以NaOH调至所需pH，加去离子水定容至1L。

2.4温度对酶活和酶稳定性的影响

最适温度测定方法：在不同温度(20-70℃)下按照2.1酶活测定方法测定重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％，其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制最适温度曲线。

温度稳定性测定方法：在不同温度(20-70℃)下将重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha酶液保温30min，然后按照2.1酶活测定方法测定重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％，其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制温度稳定性曲线。

温度对酶活和酶稳定性的影响测定结果如图2b，在20～50℃时酶的相对活力最高，最适温度为40℃；在50℃以下保温30min后酶活也相对稳定，相对酶活均高于70％。

实施例3：重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha催化橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷

在10mL，50mM Tris-HCl缓冲液中，橙皮苷终浓度5mM(3g/L)，8U/mL重组α-L-鼠李糖苷酶FjRha，pH 7.0，在37℃，摇震100rpm下反应20h，得反应液。

3.1橙皮素7-O-葡萄糖苷的TLC分析

取1μL上述反应液，在TLC硅胶板的原点点样，展层体系(三氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝3:3:1:0.2，体积比)对硅胶上的样品进行层析，层析完之后进行吹干，显色剂为茴香醛-硫酸溶液，染色后吹干，酒精灯加热显色。TLC分析结果如图3所示，在反应液中出现了和橙皮素7-O-葡萄糖苷迁移率和颜色反应一致的产物点，初步判断为生成了橙皮素7-O-葡萄糖苷。

3.2橙皮素7-O-葡萄糖苷HPLC分析

取100μL上述反应液煮沸5min，12000g离心30min取上清，过0.22μm的滤膜后进行HPLC分析，用Agilent 1200HPLC系统，依利特ODS-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈和水，液相条件如下：0～2min：5％乙腈；2～15min：5～15％乙腈；15～16min：15～80％乙腈，柱温30℃，流速为1mL/min，紫外检测器288nm下进行检测。HPLC检测结果如图4所示，保留时间为12.5min的液相峰为橙皮苷，保留时间13min的液相峰为橙皮素-7-O-葡萄糖苷，进一步确认反应液中生成了橙皮素7-O-葡萄糖苷，且反应液中生成的产物单一，没有其他副产物生成，有利于后期橙皮素7-O-葡萄糖苷的分离纯化。

另外，根据HPLC检测结果，按照以下公式，计算橙皮素-7-O-葡萄糖苷转化率：

橙皮素-7-O-葡萄糖苷转化率(％)＝(生成的橙皮素-7-O-葡萄糖苷的摩尔数/加入的橙皮苷的摩尔数)×100％

计算得出，在反应20个小时后，橙皮苷生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷的转化率最高达到95％以上。

3.3橙皮素7-O-葡萄糖苷质谱分析

取上述剩余的反应液利用乙酸乙酯萃取3次，每次10mL，取乙酸乙酯层，合并萃取液，旋转蒸发浓缩。将乙酸乙酯萃取后浓缩的产物过0.22μm滤膜，12000g离心30min后取上清用Shimadzu IT-TOF在阳离子模式进行质谱检测。检测结果如图5所示，产物在阳离子模式的ESI-MS检测下显示有一个质荷比为465.1299的[M+H]⁺离子峰，与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的理论分子量464.13相对应，进一步确认了反应液中的产物为橙皮素7-O-葡萄糖苷。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 2187

<212> DNA

<213> Flavobacterium johnsoniae

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tcgttatcat cagcacaaga aaaaccaaaa gaagcgacat ggatctggta tccaggagat 120

ttcgaagttt ggttaagcaa taaaatgcaa gtaagacgca cagaacgtga agctgtgttt 180

ccgccacttt ggcaatatta tagtccgtat gctttggtca cttttcagac agaagtagat 240

attccaaaac cagacgaagt gaaaatcttt tcagaaggcc cttttcaatt acttttagat 300

ggcgttcaga tttacggaca gccaaaatca atcgcagttc ctgccggaaa acacaaaatt 360

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cacggcttaa aaggaaaagg aaaacttgct ctttattatg gagaatctcg cgaagaagcg 720

ttggattctg ccaaatgcga aactttagat catttatctt tcgacggaaa acaatctgaa 780

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ggcgcaagtc cgatttattt attaggaaaa tattatttag gtgtaaaacc aaccgctcca 1920

ggttattcag aatatgaaat taaaccaaat ttaggaggat taaagtggat ggaaggaaaa 1980

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gcaggcgaag gagaaggaaa attaattttt gaaagtgcca gcaaacctaa aacaaactct 2100

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<212> PRT

<213> Flavobacterium johnsoniae

<400> 2

Met Leu Asn Arg Phe Ser Ile Phe Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Ser

1 5 10 15

Leu Phe Cys Cys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Glu Lys Pro Lys Glu Ala

20 25 30

Thr Trp Ile Trp Tyr Pro Gly Asp Phe Glu Val Trp Leu Ser Asn Lys

35 40 45

Met Gln Val Arg Arg Thr Glu Arg Glu Ala Val Phe Pro Pro Leu Trp

50 55 60

Gln Tyr Tyr Ser Pro Tyr Ala Leu Val Thr Phe Gln Thr Glu Val Asp

65 70 75 80

Ile Pro Lys Pro Asp Glu Val Lys Ile Phe Ser Glu Gly Pro Phe Gln

85 90 95

Leu Leu Leu Asp Gly Val Gln Ile Tyr Gly Gln Pro Lys Ser Ile Ala

100 105 110

Val Pro Ala Gly Lys His Lys Ile Ser Phe Lys Val Tyr Asn Gln Glu

115 120 125

Val Leu Pro Ala Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Asp Ala

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Glu Asp Lys Leu Trp Ile Asp Glu Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gln Gln Ser Gly Thr Pro Trp Val Pro Val Gly Ser Trp Asn

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Phe Asn Ser Pro Glu Asn Lys Pro Ser Gly Phe Lys Leu Thr Thr Lys

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Pro Leu Ser Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala Gly Ile Gly Gln Leu Val

195 200 205

Asp Phe Gly Lys Glu Thr Phe Gly Tyr Ile Lys Ile His Gly Leu Lys

210 215 220

Gly Lys Gly Lys Leu Ala Leu Tyr Tyr Gly Glu Ser Arg Glu Glu Ala

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Leu Asp Ser Ala Lys Cys Glu Thr Leu Asp His Leu Ser Phe Asp Gly

245 250 255

Lys Gln Ser Glu Thr Tyr Thr His Asp Gly Ser Lys Ala Phe Arg Tyr

260 265 270

Val Gln Val Gln Ala Asp Ala Gly Ile Lys Tyr Asp Ser Ile Ser Met

275 280 285

Leu Tyr Glu Tyr Leu Pro Leu Asp Tyr Arg Gly Ala Phe Lys Ser Ser

290 295 300

Asp Glu Gln Leu Asn Lys Ile Trp Asp Val Ser Ala Tyr Thr Met His

305 310 315 320

Leu Thr Ser Arg Glu Phe Phe Ile Asp Gly Ile Lys Arg Asp Arg Trp

325 330 335

Val Trp Ser Gly Asp Ala Tyr Gln Ser Tyr Leu Met Asn Tyr Tyr Leu

340 345 350

Phe Phe Asp Ser Ala Ser Val Glu Arg Thr Leu Leu Ala Leu Arg Gly

355 360 365

Lys Asp Pro Val Thr Ala His Val Asn Ile Ile Met Asp Tyr Ser Leu

370 375 380

Tyr Trp Phe Val Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr Leu His Thr Gly Asp Thr

385 390 395 400

Lys Phe Ile Lys Thr Phe Tyr Pro Arg Met Lys Ser Leu Met Asp Phe

405 410 415

Cys Leu Glu Arg Arg Asn Lys Asn Gly Phe Leu Glu Pro Leu Glu Gly

420 425 430

Asp Trp Val Phe Ile Asp Trp Ala Asp Gly Leu Pro Lys Thr Gly Glu

435 440 445

Val Ser Phe Glu Gln Met Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Ala Met Ala

450 455 460

Val Ser Ala Glu Ile Ala Gly Lys Ser Glu Asp Gln Lys Gln Tyr Gln

465 470 475 480

Lys Leu Gly Thr Asp Leu Lys Thr Lys Leu Phe Asp Val Phe Trp Asp

485 490 495

Lys Lys Glu Asn Val Met Lys His Gln Arg Ile Asp Gly Lys Ile Gln

500 505 510

Asn Ile Val Thr Arg Tyr Ala Asn Met Phe Gly Ile Phe Phe Asn Tyr

515 520 525

Phe Thr Glu Glu Gln Lys Gln Ser Val Lys Asn Lys Val Leu Leu Asn

530 535 540

Lys Asp Val Leu Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Met Arg Phe Tyr Glu Leu

545 550 555 560

Glu Ala Leu Cys Ala Met Gly Glu Gln Asp Tyr Val Leu Lys Glu Met

565 570 575

Lys Asn Tyr Trp Gly Gly Met Leu Asn Glu Gly Ala Thr Ser Phe Trp

580 585 590

Glu Glu Tyr Asn Pro Asn Lys Lys Gly Thr Glu His Leu Thr Met Tyr

595 600 605

Gly Arg Pro Tyr Gly Lys Ser Leu Cys His Ala Trp Gly Ala Ser Pro

610 615 620

Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Lys Pro Thr Ala Pro

625 630 635 640

Gly Tyr Ser Glu Tyr Glu Ile Lys Pro Asn Leu Gly Gly Leu Lys Trp

645 650 655

Met Glu Gly Lys Val Pro Thr Pro Asn Gly Glu Val Ala Val Tyr Cys

660 665 670

Ser Thr Lys Glu Ile Lys Val Lys Ala Gly Glu Gly Glu Gly Lys Leu

675 680 685

Ile Phe Glu Ser Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn Ser Gly Thr Ile Thr

690 695 700

Glu Leu Ala Lys Asn Lys Tyr Gln Leu Ile Val Lys Pro Asn Val Glu

705 710 715 720

Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Ala Leu

725

Claims

1.一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶FjRha在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用，所述生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷是以橙皮苷为底物；所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha来源于约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）；所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha的编码核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha专一性水解α-1,6鼠李糖苷键。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha按照以下方法获得：以约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）基因组DNA为模板，设计引物P1和P2，PCR扩增获得α-L-鼠李糖苷酶FjRha的编码基因序列，将PCR扩增产物和表达载体pET28a分别用Nhe I和EcoR I双酶切，纯化、连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌，在LB培养基中培养至对数生长期，然后经IPTG诱导表达，收集菌体，破壁纯化后得α-L-鼠李糖苷酶FjRha。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IPTG的终浓度为0.1-0.5 mM；诱导温度为16℃；诱导时间为10-30 h。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的序列为：

P1：5’-AATTGCTAGCAATTGTTCCAGAGTTTGTTTT-3’,下划线表示Nhe I酶切位点，

P2：5’-GCCGGAATTCCTAAACCGCTTTTCCATTT-3’,下划线表示EcoR 酶切I位点。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，是以橙皮苷为底物，具体步骤如下：

以橙皮苷为反应底物，在α-L-鼠李糖苷酶FjRha1的生物催化作用下，于温度20-50 ̊C，pH6.0~10.0条件下反应5-25小时，得唯一产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述橙皮苷的浓度为0.5-5 g/L，所述α-L-鼠李糖苷酶FjRha的用量为1-10 U/ mL。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述温度为40℃，所述pH为7.0。