CN113584001B - 一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种alpha‑L‑鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。具体涉及一种新型alpha‑L‑鼠李糖苷酶的氨基酸序列、编码上述氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重组载体和重组宿主、利用上述重组宿主制备alpha‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及所述alpha‑L‑鼠李糖苷酶在宝霍苷I生产中的应用。本发明所提供的alpha‑L‑鼠李糖苷酶具有催化效率高、热稳定性好、特异性高等优点。朝藿定C经葡萄糖苷酶快速催化水解后，再利用本发明中所提供的alpha‑L‑鼠李糖苷酶进一步催化水解其C3位置外侧鼠李糖苷键生成宝霍苷I，底物转化率高达99.5%、转化效率高、无副产物、步骤简单、反应时间短、污染小、适合工业化生产。

Description

一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。
背景技术
淫羊藿又名仙灵脾、刚前，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。目前淫羊藿品种多达40个，包括柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿和朝鲜淫羊藿等。 淫羊藿药材中主要含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等主要黄酮苷，其中淫羊藿苷占比10%左右；朝藿定A和B合计占比10%；而朝藿定C（图1）是淫羊藿中含量最高的黄酮皂苷，约占70%，其C3位置和C7位置分别带有两个鼠李糖基和一个葡萄糖基。
宝藿苷I（图1），又名淫羊藿次苷II（Icariside II），具有抗肿瘤、治疗骨质疏松、调节免疫力等功效，市场应用前景广阔。天然植物中宝霍苷I的含量很少（低于0.2%），因而宝霍苷I 的制备通常采用水解黄酮苷实现，如可通过水解去掉淫羊藿苷C7位置葡萄糖苷键获得宝霍苷I，其结构式如图1。由于酸解法具有环境污染大，特异性低等缺点而很少被应用于宝霍苷I的制备。
目前宝霍苷I 的制备多采用酶催化法，具有条件温和，特异性高，环境污染小等优点。宝霍苷I的制备最初采用葡萄糖苷酶或产葡萄糖苷酶的微生物来转化淫羊藿苷（图1）得到宝霍苷I（中国专利申请号：200780034447.9），后来又报道有其他葡萄糖苷酶、纤维素酶或葡聚糖酶也可以实现宝霍苷I的生产（中国专利申请号：201110186207.9、201880038006.4、201710333064.7、201110428197.5），相关报道的糖苷酶水解断裂的是淫羊藿苷C7位置的葡萄糖苷键，且酶催化的效率有限。此外，中国专利（中国专利申请号:201810110773.3）公开了一种鼠李糖苷酶水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键，弥补了使用alpha-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C鼠李糖与鼠李糖之间的alpha-1,2糖苷键的空白，但是摩尔转化率只有90.5%。因此一种高活性，高催化效率的糖苷酶对于宝藿苷I的制备至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型alpha-L-鼠李糖苷酶、编码所述糖苷酶的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞以及所述alpha-L-鼠李糖苷酶在宝霍苷I生产中的应用。提供本发明是根据现有鼠李糖苷酶催化效率低、底物转化率低以及反应时间长等不足作出创新和改进。
为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种alpha-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQ IDNO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有alpha-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质，该蛋白质优选为与SEQ ID NO.1有60%以上的相似度，更优选为80%或90%以上。
一种核苷酸序列，编码所述的alpha-L-鼠李糖苷酶，或者为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。其中编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
一种重组载体，包含编码所述的alpha-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列，或者包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
一种宿主细胞，包含所述的重组载体，或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
一种alpha-L-鼠李糖苷酶的制备方法，采用所述的宿主细胞生产，或者采用篮状菌发酵生产。
所述的alpha-L-鼠李糖苷酶应用于特异性水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键、淫羊藿素双鼠李糖苷C3外侧鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、新橙皮苷鼠李糖苷键和柚皮苷鼠李糖键。
所述的alpha-L-鼠李糖苷酶应用于制备宝霍苷I。
本发明的发明人从篮状菌（TalaromycesStollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 3.16013，保藏日期：2020.8.28）中成功挖掘出具有高效水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键的alpha-L-鼠李糖苷酶。
糖苷酶基因挖掘是基于基因组测序以及蛋白质鉴定技术，其具体过程为：1、通过二代测序技术（illumina Hiseq）将篮状菌的全基因组进行测序，并对获得的核苷酸序列进行拼接和注释基因功能；2、通过篮状菌固体发酵获得粗酶液，并将所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、DEAE柱纯化（DEAE-Berpharose FF，北京博尔西）以及分子筛层析SuperdexTM 200Increase 10/300 GL，GE Healthcare）得到纯化的天然alpha-L-鼠李糖苷酶；3、通过基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF）对纯化的alpha-L-鼠李糖苷酶进行鉴定，并根据质谱鉴定出的肽段与基因组注释信息进行比对，从而确定alpha-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列信息。
应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据偏好性优化合适特定物种表达的密码子；因此，本发明的鼠李糖苷酶核苷酸序列还包括由 SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和／或增加得到编码具有alpha-L-鼠李糖苷酶活性的核苷酸序列。
本发明提供的重组载体，包含所述alpha-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列；优选地，所述重组载体为pPIC9k-CHD-R3 （CHD-R3表示本发明的alpha-L-鼠李糖苷酶代号，下同。）
本发明提供的宿主细胞，包含含有alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列的重组载体，或基因组中整合有alpha-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌以及乳酸菌等；所述真核细胞为酵母细胞、丝状真菌细胞、植物细胞、动物细胞等；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母。
本发明提供的alpha-L-鼠李糖苷酶的制备方法，包括在上述的宿主细胞中生产。
或者由篮状菌（Talaromyces stollii）发酵生产。
本发明提供的alpha-L-鼠李糖苷酶，可以特异性水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键、淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、新橙皮苷鼠李糖苷键和柚皮苷鼠李糖键等。其对朝藿定C、淫羊藿素双鼠李糖苷、芦丁、新橙皮苷和柚皮苷的比酶活分别为80~120 U/mg、80~125 U/mg、20~50 U/mg、30~60 U/mg和30~55 U/mg；其中酶活定义（U）为：每小时催化水解1 μmol底物所需要的酶量。
本发明的发明人还选取了与SEQ ID NO.1具有 69.20%、88.76%和92.78%序列相似度的糖苷酶进行了异源发酵表达以及催化功能研究，结果发现以上三种重组酶均显示出对朝藿定C、芦丁、新橙皮苷以及柚皮苷的鼠李糖苷键的特异性催化水解。
本发明提供的alpha-L-鼠李糖苷酶在制备宝霍苷I中的应用，其具体步骤如下。
第一步催化：以朝藿定C为底物，加入葡萄糖苷酶水解朝藿定C上的葡萄糖苷键，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷。
第二步催化：上述第一步催化结束后向体系中加入alpha-L-鼠李糖苷酶，催化水解淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，得到宝霍苷I。
所述第一步催化中的催化条件为35~45 ℃、pH为6.0~8.5，催化时间为2~10 min；优选地，催化条件为45 ℃、pH为7.5，催化时间为5 min。
所述第二步催化中的催化条件为为40~60 ℃、pH为4.0~6.0，催化时间为20~60min；优选地，催化条件为50 ℃、pH为5.0，催化时间为40 min。
本发明的有益效果：
本发明所提供的alpha-L-鼠李糖苷酶催化效率高、特异性高。在葡萄糖苷酶和本发明所提供的alpha-L-鼠李糖苷酶的分步催化下，底物朝藿定C几乎完全转化为宝霍苷I，转化率高达99.5%，且过程简单、时间短、污染小，是一种温和环保高效的宝霍苷I生产技术，适合工业化生产。
附图说明
图1是相关底物和产物结构图。
图2是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3蛋白纯化电泳图。
图3是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3质谱与序列比对结果。
图4是重组alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3纯化电泳图。
图5是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3 pH影响和pH稳定性。
图6是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3温度影响和温度稳定性。
图7是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化朝藿定C液相图。
图8是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化朝藿定C路径图。
图9是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化淫羊藿素双鼠李糖苷液相图。
图10是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化淫羊藿素双鼠李糖苷路径图。
图11是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化芦丁液相图。
图12是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化芦丁路径图。
图13是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化新橙皮苷液相图。
图14是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化新橙皮苷路径图。
图15是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化柚皮苷液相图。
图16是alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3转化柚皮苷路径图。
图17是葡萄糖苷酶和alpha-L-鼠李糖苷酶转化朝藿定C生产宝藿苷I路径图。
图中：CHD-R3表示本发明实施例中alpha-L-鼠李糖苷酶代号，实施例中同。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的以及有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。下面实施例是对本发明所做的进一步解释和说明，不应当作为对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当修改基因序列、改变重组载体、更换重组细胞、改变培养基条件、改变产酶方式、改变催化条件、改进转化工艺路线。所有类似的改动对于本技术领域人员来说是显而易见的，它们都有被视为包括在本发明内。本发明的实施例中所用材料、试剂若未做特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1
制备alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3并对其酶学性质进行研究：
1、篮状菌基因组测序以及基因功能注释
使用Solarbio公司的真菌基因组提取试剂盒对篮状菌（TalaromycesStollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.3.16013，保藏日期：2020.8.28）的基因组进行提取，随后使用Illumina SolexaGenomeAnalyzer二代测序仪对提取的基因组进行分析，获得篮状菌基因组的原始数据。使用FASTQC对所述测序产生的原始数据进行质量评估，并通过Trimmomatic对Illumina测序数据进行质量剪切，得到相对准确的有效数据，结果表明测得的原始数据质量良好，可以进行下一步的拼接注释。
使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，并使用PrInSeS-G进行序列矫正，修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。采用NCBI的Blast功能将基因蛋白序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息。
、alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的纯化
以篮状菌（TalaromycesStollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 3.16013，保藏日期：2020.8.28）为菌种，采用固体发酵模式进行发酵产酶，其中发酵培养基为：7 g麸皮、3 g黄姜粉以及营养盐离子（硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.2%，pH 5.5），发酵温度为30 ℃，时间为5天，中间两次翻曲。发酵结束后，加入pH为7.5的PBS缓冲溶液在40 ℃下洗酶1 h，后通过过滤得到粗酶液。
向粗酶液中加入硫酸铵至75%饱和度，4 ℃过夜沉淀，离心去掉上清得到粗酶沉淀。向上述粗酶沉淀中加入pH 6.0的磷酸缓冲液重新溶解蛋白，通过过滤去掉不溶物。使用10 KDa的超滤管（Millipore）对蛋白粗酶液进行浓缩脱盐，得到DEAE柱（DEAE-BerpharoseFF）纯化的上样液。
使用DEAE柱对上述蛋白上样液进行纯化，使用NaCl (0.0~1.0 M)线性洗脱，收集的活性组分样品再通过超滤膜浓缩脱盐。
最后使用分子筛（SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare）对蛋白进行进一步的纯化，洗脱剂为pH 7.0磷酸缓冲液（50 mM）。收集活性蛋白组分得到纯化糖苷酶，并对纯化酶进行蛋白电泳分析，其中alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的分子量约为110 KDa（图2）。
3、alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3氨基酸序列的鉴定
将纯蛋白对应的SDS-PAGE条带切下，利用胰蛋白酶对目标蛋白进行消解后，通过ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪对目标蛋白的肽段进行质谱分析，并将得到的数据与上述基因组注释信息进行比对，从而鉴定出alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的氨基酸序列（图3）。
其中alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过分析，上述alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的理论分子量为73139.4 Da，预测等电点pI为4.27。
4、重组载体pPIC9k- CHD-R3的构建以及转化
根据鉴定的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3氨基酸序列信息，通过基因合成的方式获得alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列（SEQ ID NO. 2）。
合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5'端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以合成的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列为模板进行PCR扩增。
使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体pPIC9k- CHD-R3。
5、 alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的表达以及纯化
使用SalI限制性内切酶对重组载体进行线性化，然后将线性化的重组载体电转化到活化的毕赤酵母中，从而糖苷酶基因即可整合到毕赤酵母的基因组中，得到产酶宿主细胞。
将所述宿主细胞接入BMMG培养基中30 ℃培养12 h，然后将富集的菌体洗净接入BMMY培养基中30 ℃培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导产酶。培养5天后，将发酵液液过滤，并使用镍柱纯化得到纯化的重组alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，其分子量约为140 KDa（图4）。
上述重组蛋白的分子量与理论分子量相差较大的原因主要是蛋白表达过程中被过度糖基化。
、alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3酶学性质的研究
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3酶活的测定：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，在pH 4.5和温度50 ℃条件下反应5 min，反应结束加入碳酸钠后静置5 min，并在400 nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活；alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3酶活定义（U）：每1 min反应得到1 μmol对硝基苯所需的酶量。
最适温度的研究：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，改变温度范围5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃，在pH 4.5条件下反应5 min，反应结束加入碳酸钠后静置5min，并在400nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活。
热稳定性的研究：将alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3置于10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃中放置1h，后测定残余酶活。
最适pH的考察：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，改变pH范围2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11，在50 ℃条件下反应5 min，反应结束加入碳酸钠后静置5 min，并在400 nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活。
pH稳定性研究：将alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3置于pH为2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11中放置3 h，后测定残余酶活。酶学性质研究的结果见图5和图6。
7、alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的底物谱研究
分别以朝藿定C、淫羊藿素双鼠李糖苷、芦丁、新橙皮苷和柚皮苷为底物，底物浓度为1mg/mL，然后添加10 μL alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3 （0.4mg/mL），在50 ℃，pH 4.5条件下反应，并定时取样液相检测，其转化结果以及转化路径图分别如图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15、和图16所示。
实施例2
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3二重突变体（G159F/S316N）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Gly159和Ser316分别突变为Phe159和Asn316，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示。合成序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列为模板进行PCR扩增。
使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体pPIC9k- CHD-R3-1。
使用SalI限制性内切酶对重组载体进行线性化，然后将线性化的重组载体电转化到活化的毕赤酵母中，从而糖苷酶基因即可整合到毕赤酵母的基因组中，得到产酶宿主细胞。
将所述宿主细胞接入BMMG培养基中30 ℃培养12 h，然后将富集的菌体洗净接入BMMY培养基中30 ℃培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导产酶。培养5天后，将发酵液液过滤，并使用镍柱纯化得到纯化的重组alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3二重突变体蛋白（G159F/S316N）。
实施例3
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3三重突变体（A58S/Y91I/ G159N）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Ala58，Tyr91，和Gly159分别突变为Ser58，Ile91，和Asn159，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示。合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸序列为模板进行PCR扩增。
使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体pPIC9k- CHD-R3-2。
使用SalI限制性内切酶对重组载体进行线性化，然后将线性化的重组载体电转化到活化的毕赤酵母中，从而糖苷酶基因即可整合到毕赤酵母的基因组中，得到产酶宿主细胞。
将所述宿主细胞接入BMMG培养基中30 ℃培养12 h，然后将富集的菌体洗净接入BMMY培养基中30 ℃培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导产酶。培养5天后，将发酵液液过滤，并使用镍柱纯化得到纯化的重组alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3三重突变体蛋白（A58S/Y91I/G159N）。
实施例4
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用
采用实施例1制备的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3生产宝霍苷I。
第一步催化：向1 mL磷酸缓冲液（100 mM）中加入10 mg朝藿定C并充分溶解，后加入20 uL浓度为1 mg/mL的葡萄糖苷酶，在45 ℃和pH为 7.5的条件下催化反应为5 min，此时朝藿定C上的葡萄糖苷键被完全水解断裂，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷；反应结束后，调节体系的pH至5.0。
第二步催化：在第一步催化反应结束后向体系中加入20 uL浓度为1 mg/mL的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，催化条件为50 ℃、pH为5.0，催化时间为20 min，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3特异性催化水解的是淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，产物为宝霍苷I，转化率达到99.5%以上，转化路径图如图17所示。
实施例5
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用
采用实施例1制备的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3生产宝霍苷I。
第一步催化：向1 mL磷酸缓冲液（100 mM）中加入10 mg朝藿定C并充分溶解，后加入20 uL浓度为1 mg/mL的葡萄糖苷酶，在40 ℃和pH为 7.5的条件下催化反应为8 min，此时朝藿定C上的葡萄糖苷键被完全水解断裂，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷；反应结束后，调节体系的pH至4.5。
第二步催化：在第一步催化反应结束后向体系中加入20 uL浓度为1 mg/mL的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，催化条件为50 ℃、pH为4.5，催化时间为40 min，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3特异性催化水解的是淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，产物为宝霍苷I，转化率达到99.5%以上，转化路径图如图17所示。
实施例6
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用
采用实施例1制备的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3生产宝霍苷I。
第一步催化：向1 mL磷酸缓冲液（100 mM）中加入10 mg朝藿定C并充分溶解，后加入20 uL浓度为1 mg/mL的葡萄糖苷酶，在40 ℃和pH为 7.0的条件下催化反应为10min，此时朝藿定C上的葡萄糖苷键被完全水解断裂，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷；反应结束后，调节体系的pH至4.5。
第二步催化：在第一步催化反应结束后向体系中加入20 uL浓度为1 mg/mL的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3，催化条件为45 ℃、pH为4.5，催化时间为40 min，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3特异性催化水解的是淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，产物为宝霍苷I，转化率达到99.5%以上，转化路径图如图17所示。
本发明公开了一种新型alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3及其氨基酸序列、编码氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物制备alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的方法以及alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3和葡萄糖苷酶在分步水解朝藿定C制备宝霍苷I中的应用。本发明所提供的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3活性高，特异性好、对底物催化效率高。在葡萄糖苷酶和alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3的分步催化下，朝藿定C几乎完全转化为宝霍苷I，转化率高达99.5%，且过程简单、时间短、污染小，是一种温和环保高效的宝霍苷I生产技术，适合工业化生产。
实施例7
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（G159F/S316N）在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用
采用实施例2制备的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（G159F/S316N）生产宝霍苷I。
第一步催化：向1 mL磷酸缓冲液（100 mM）中加入10 mg朝藿定C并充分溶解，后加入20 uL浓度为1 mg/mL的葡萄糖苷酶，在45 ℃和pH为 7.5的条件下催化反应为5 min，此时朝藿定C上的葡萄糖苷键被完全水解断裂，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷；反应结束后，调节体系的pH至5.0。
第二步催化：在第一步催化反应结束后向体系中加入20 uL浓度为1 mg/mL的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（G159F/S316N），催化条件为50 ℃、pH为5.0，催化时间为20min，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（G159F/S316N）特异性催化水解的是淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，产物为宝霍苷I，转化率达到99.5%以上，转化路径图如图17所示。
实施例8
alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（A58S/Y91I/ G159N）在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用
采用实施例3制备的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（A58S/Y91I/ G159N）生产宝霍苷I。
第一步催化：向1 mL磷酸缓冲液（100 mM）中加入10 mg朝藿定C并充分溶解，后加入20 uL浓度为1 mg/mL的葡萄糖苷酶，在45 ℃和pH为 7.5的条件下催化反应为5 min，此时朝藿定C上的葡萄糖苷键被完全水解断裂，产物为淫羊藿素双鼠李糖苷；反应结束后，调节体系的pH至5.0。
第二步催化：在第一步催化反应结束后向体系中加入20 uL浓度为1 mg/mL的alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（A58S/Y91I/ G159N），催化条件为50 ℃、pH为5.0，催化时间为20 min，alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3（A58S/Y91I/ G159N）特异性催化水解的是淫羊藿素双鼠李糖苷外侧鼠李糖苷键，产物为宝霍苷I，转化率达到99.5%以上，转化路径图如图17所示。
上述参照具体实施方式是对alpha-L-鼠李糖苷酶CHD-R3及其应用所进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例；因此，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，在不脱离本发明总体构思下的变化和修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种alpha-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的alpha-L-鼠李糖苷酶。
2.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的alpha-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列，多核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的多核苷酸的序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述的宿主细胞非动物或植物品种。
5.权利要求1所述的alpha-L-鼠李糖苷酶的应用，其特征在于：应用于特异性水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键、淫羊藿素双鼠李糖苷C3外侧鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、新橙皮苷鼠李糖苷键和柚皮苷鼠李糖键。
6.权利要求1所述的alpha-L-鼠李糖苷酶在转化朝藿定C制备宝霍苷I中的应用。
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