CN115838710A - 一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶及其编码基因。该外切左聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该左聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的外切左聚糖酶可以水解左聚糖、菊粉，其最终产物为果糖，在高果糖浆生产等果糖基资源利用领域具有良好的应用潜力。

Description

一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶基因的表达及其应用。

背景技术

果聚糖(fructan)是β-D-呋喃果糖的多聚体，是由非还原性末端的蔗糖与多个果糖残基组成的水溶性多糖。根据糖苷键连接方式的不同主要分为两种类型：左聚糖和菊粉。左聚糖(levan)主链以β-2，6-糖苷键连接，通常来源于微生物，绝大多数的细菌果聚糖都是levan型果聚糖；菊粉(inulin)主链以β-2，1-糖苷键连接，通常来源于植物，在菊芋的块茎中含量丰富，因此可以从自然界植物中分离得到菊糖型果聚糖。左聚糖和菊粉为可再生非粮生物质资源，在生产高果糖浆、低聚果糖等食品领域具有广阔的市场。

左聚糖酶(levanase，EC 3.2.1.65)，根据作用底物方式的不同，可分为外切型左聚糖酶和内切型左聚糖酶两大类。外切左聚糖酶大多能同时降解β-2，6-糖苷键连接的左聚糖和菊粉的β-2，1-糖苷键，从两种底物中释放游离果糖，在左聚糖和菊粉商业化生产超高果糖浆上具有很大潜力。内切左聚糖酶特异性的水解左聚糖生成聚合度为2-10的低聚果糖，低聚果糖具有众多益生作用，如促进矿物质的吸收、改善脂质代谢、抗肿瘤和降低血脂等。外切左聚糖酶和内切左聚糖酶都属于糖苷水解酶32家族(Glycosyl hydrolasesfamily 32)，该家族还包括外切菊粉酶、内切菊粉酶和蔗糖酶等。

外切左聚糖酶一步水解反应即可生产高纯度的果糖，具有很高的商业价值。果糖有许多优良特性，如高甜度、低热值、风味好、不易造成龋齿，糖尿病患者也可利用，不但可以增加食品的甜度，还可以进一步改善食品的性能、丰富食物的口感、提高食品的档次。又因高果糖浆渗透压高、吸湿保湿性好、甜味纯正，是一种可替代蔗糖的甜味剂，广泛应用于食品及饮料行业，具有广阔的市场需求。

天然酶具有产量低，稳定性差、活性低等特点，往往难以满足工业生产的需求，同时也难以得到高纯度的酶。本发明通过基因重组手段实现了左聚糖酶的高效表达和酶学性质表征，为左聚糖酶制剂的工业发酵生产以及高果糖浆的开发利用打下了基础。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是提供一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶，其的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的再一目的是提供编码上述外切左聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体pET28a-rMle3A。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

技术方案：

本发明提供了可降解果聚糖的外切左聚糖酶，是由SEQ ID NO.1序列组成的蛋白。

本发明提供了编码上述外切左聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了含有上述编码外切左聚糖酶基因的重组载体。

具体的，该重组载体以pET系列作为载体，将权利要求2所述基因去除信号肽序列，插入NdeI和HindIII作为两个酶切位点间所得。所述的信号肽序列为MKNCLPRNRFRTIAAATTVAVAATFGATAVAPAHA。

更具体的，上述重组载体的制备方法：

步骤1，以微杆菌XL1总DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR回收片段；

步骤2，将其与pET28a质粒分别用NdeI和HindIII进行双酶切反应，目的基因与线性质粒载体用solution I连接，得到连接产物；

步骤3，上述连接产物经培养后，得到重组载体pET28a-rMle3A。

本发明还提供了含上述编码外切左聚糖酶基因的重组菌株。

所述重组菌株的制备方法，是将上述重组载体的制备方法中步骤2所得到的连接产物转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行重组表达。

本发明还提供了上述外切左聚糖酶在降解果聚糖中的应用，可以用于水解左聚糖、菊粉、蔗糖。

具体的，左聚糖、菊粉的最终水解产物为果糖。具体的，可用于高果糖浆及结晶果糖的生产。

更具体的，本发明所述外切左聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：

以微杆菌XL1(分类命名：微杆菌 Microbacterium sp.；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年4月21日，保藏编号：CCTCCNO.M2021423)总DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因，其上下游引物分别为5’-GGAATTCC ATATGGACCCCGGGCCCGCGACAG-3’(下划线：NdeI酶切位点)和5’-CCCAAGCTTCGGCCGGCGCACCGTCACCGTC-3’(下划线：HindIII酶切位点)。PCR扩增完成后，将PCR回收片段和pET28a质粒分别用NdeI和HindIII进行双酶切反应，电泳回收线性质粒载体和目的条带，用solution I连接，构建得到表达载体pET28a-rMle3A，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行重组表达。通过IPTG诱导表达，并对IPTG浓度和诱导温度进行了优化，结果表明，当IPTG浓度为0.05mM、诱导温度为16℃时重组Mle3A酶(以下称为rMle3A)表达量最高。用AKTA蛋白纯化系统和His Trap HP层析柱进行纯化，得到大小约为127KDa的纯酶rMle3A(图3)。

本发明的外切左聚糖酶Mle3A总共含1208个氨基酸，理论分子量大小约为127.7kDa，其中N-端的1-35个氨基酸为信号肽。对去除信号肽后的成熟蛋白的分子量和等电位点进行计算，结果分别为124.2kDa和PI 4.5。

有益效果：酶学性质分析表明：该酶的最适反应温度为50℃，在55℃下孵育1h，可保持至少80％的酶活；最适反应pH为5。金属离子Mg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺可显著提高rMle3A酶的酶活，而Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对rMle3A酶的活性有较强的抑制作用。EDTA对酶活有较强的抑制作用，β-巯基乙醇和表面活性剂Triton X100对酶活性影响不大，表面活性剂Tween 80、SDS可明显提高rMle3A酶的活性。

动力学常数测定结果显示rMle3A酶对左聚糖、菊粉、蔗糖底物的K_m值分别为0.34mg/mL、4.3mg/mL、37.5mg/mL。rMle3A酶对左聚糖、菊粉、蔗糖的比酶活分别为153U/mg、108U/mg和349U/mg。

薄层层析结果显示:rMle3A纯酶水解左聚糖和菊粉的最终产物为果糖。本发明的外切左聚糖酶可用于食品及医药领域中果糖的生产，在高果糖浆生产等果糖基资源利用领域也有良好的应用潜力。

附图说明

图1为IPTG浓度对rMle3A表达的影响图；

图2为温度对rMle3A表达的影响图；

图3为在大肠杆菌中表达的rMle3A的SDS-PAGE分析图，

其中，M:蛋白Marker；1：纯化前的粗酶液；2：Ni柱纯化重组rMle3A；

图4rMle3A纯酶的最适反应温度折线图；

图5rMle3A纯酶的热稳定性折线图；

图6rMle3A纯酶的最适反应pH折线图；

图7rMle3A纯酶水解菊粉和左聚糖产物的薄层层析分析结果图，

其中从1到7依次为菊粉、左聚糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、作用于菊粉水解产物、作用于左聚糖水解产物。

具体实施方式

下面是实施例对本发明方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

主要材料与试剂

1，菌株及质粒：微杆菌XL1和表达载体pET28a(+)为本实验室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自南京斯博慕生物科技有限公司；

2，试剂盒、工具酶：细菌基因组提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工；限制性内切酶NdeI和HindIII购自赛默飞；DNA分子量标准品和Solution购自Takara；左聚糖由本实验室分离的微杆菌XL1利用蔗糖合成；菊粉(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司；SDS(分析纯)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母粉和胰蛋白胨(分析纯)购自英国Oxoid公司；其他试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司。

3，LB培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然。固体培养基在此基础上加入15g/L琼脂。

实施例1：外切左聚糖酶Mle3A基因的克隆

以微杆菌XL1(中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO.M2021423)总DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因，其上下游引物分别为5’-GGAATTCCATATGGACCCCGGGCCCGCGACAG-3’(下划线部分：NdeI酶切位点)和5’-CCCAAGCTTCGGCCGGCGCACCGTCACCGTC-3’(下划线：HindIII酶切位点)。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的片段(预期大小为3627bp)，切胶后，用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，送至苏州金唯智测序。

实施例2：外切左聚糖酶Mle3A表达载体的构建

PCR回收片段和pET28a质粒分别用NdeI和HindIII进行双酶切反应。双酶切反应体系(PCR回收片段)：Buffer(10x)5μL，DNA 15μL，NdeI 2μL，HindIII 2μL，灭菌去离子水26μL；双酶切反应体系(pET28a)：Buffer(10x)5μL，pET28a 10μL，NdeI 2μL，HindIII 2μL，灭菌去离子水31μL；混匀后，37℃反应2h，1％琼脂糖凝胶回收目的基因和线性质粒载体。将胶回收后的目的基因与线性质粒载体用solution I连接，酶连反应体系：酶切PCR片段1.5μL，酶切pET28a 1μL，solution I 2.5μL；反应液混匀后，置于16℃恒温孵育器中反应30min。

将连接产物加入到30μL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴静置25min；42℃水浴热激45s，立即在冰上放置2min；加入500μL不含抗生素的LB液体培养基后，混匀置于37℃、180r/min振荡培养60min，5000r/min离心1min收菌，留取100μL左右上清，吹打重悬菌体后涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板上，37℃培养箱过夜培养。挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养12h，使用酚氯仿法进行质粒的快速提取与鉴定，挑选出阳性克隆子，保菌并送至苏州金唯智测序；将测序正确的克隆子抽提质粒，1％琼脂糖凝胶电泳验证。

实施例3转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)及诱导表达条件优化

将测序正确的重组质粒按照实施例2的方法转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，从LB卡那霉素平板上挑取单菌落，接种于含卡那霉素(50μg/mL)的20mL LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养过夜，然后以4％的接种量接种至50mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养6-8h，使菌液OD_600nm至0.6-0.8之间。加入终浓度为(0、0.05、0.1、0.5、1mM)的IPTG诱导，在20℃、180r/min下诱导表达24h。4℃、8000r/min离心15min收集菌体，用PBS洗涤菌体3次，最后用适量PBS重悬菌体。超声破碎菌体，超声结束后，8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。酶活测定结果表明：当IPTG浓度为0.05-1mM时，rMle3A均有活性，浓度为0.05mM时其活性最高，说明当IPTG浓度为0.05mM时rMle3A表达量最高(图1)。

在最佳IPTG浓度基础上，对诱导温度进行优化。分别在不同温度(16，20，24，30，35℃)下诱导24h，收集菌体，细胞破碎后测定酶活力。酶活测定结果表明：当诱导温度为16-35℃时，rMle3A均有活性，诱导温度为16℃时其活性最高(图2)。

实施例4rMle3A的纯化

0.22μm滤膜过滤粗酶液后，使用AKTA蛋白纯化系统和His Trap HP层析柱对rMle3A纯化，首先用磷酸盐缓冲液(20mM，30mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4)平衡柱子，上样后用磷酸盐缓冲液(20mM，500mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4)按照0-100％进行梯度洗脱，流速为2mL/min。SDS-PAGE电泳检测纯化后的样品，结果显示大小约为127KDa的单一条带(图3)，蛋白条带为带标签的外切左聚糖酶，该外切左聚糖酶由SEQ ID NO.1序列组成。

实施例5rMle3A的酶学性质

(1)酶活测定：取50μL适当稀释的酶液，加入150μL 20g/L菊粉溶液，反应10min，在反应体系中加入200μL DNS终止反应，沸水加热5min，加入3mL去离子水，摇匀后测定在540nm下的吸光度值，以先加DNS后加酶液为对照组，其他操作同实验组。对照果糖标准曲线计算还原糖的含量。酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量，即为一个酶活力单位(U)。

(2)最适反应温度：取50μL适当稀释的纯化酶液，加入150μL 20g/L菊粉溶液，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃的水浴条件下反应10min后，测定酶活。以所测酶活的最大值为100％，计算相对酶活力。热稳定性：将适当稀释的纯化酶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃的水浴中孵育1h，取出冰浴冷却后，加入底物于50℃下反应10min，以未加热孵育的酶样测得酶活力为100％，计算相对酶活力。结果表明：rMle3A最适反应温度为50℃，在20-65℃内都具有酶活(图4)；在55℃下孵育1h，可保持至少80％的酶活，在孵育温度为60℃时，酶的活性几乎完全损失(图5)。

(3)最适反应pH：配制50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0～6.0)和50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0～9.0)，将酶液和底物分别与不同pH的缓冲液混匀,测定酶活。以所测酶活的最大值为100％，计算相对酶活力。结果表明：rMle3A最适反应pH为5(图6)。

(4)金属离子及其他化学试剂对酶活力的影响：酶反应体系中添加不同金属离子及其他化学试剂后，以菊粉为底物在最适反应条件下测定酶活力，对照为添加同等体积的灭菌去离子水测定的rMle3A酶活，设定为100％。测定结果见表1。

表1金属离子及其他化学试剂对酶活力的影响

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金属离子Mg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺可显著提高rMle3A的酶活，其中Mn²⁺对酶活提升效果最为明显，测定酶活力为200.2％，而Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对酶的活性有明显抑制作用。EDTA对酶活有较强的抑制作用，说明rMle3A酶属于金属酶类，β-巯基乙醇和表面活性剂Triton X100对酶活性影响不大，表面活性剂Tween 80、SDS可明显提高rMle3A酶的活性。

(5)rMle3A的动力学常数测定：取适量酶液与不同浓度底物反应，计算不同浓度底物下的酶反应速率。左聚糖和菊粉为底物时底物浓度范围为0.5-5 0mg/mL，蔗糖为底物时底物浓度范围为5-50mg/mL，在最适反应条件下测定重组酶rMle3A的动力学常数。根据双倒数法(Lineweaver-Burk)，以底物浓度倒数为横坐标，初始反应速率的倒数为纵坐标作图，直线的截距为1/V_max，斜率为K_m/V_max，计算出对不同底物的K_m、V_max的数值，通过最大反应速率V_max和蛋白分子量M_w可计算出转换数(K_cat)，K_cat/K_m的比值代表酶的催化效率。结果如表2所示，对比结果说明，rMle3A与底物左聚糖的亲和力最大，其次是菊粉。重组酶rMle3A对左聚糖具有最高的K_cat/K_m值，表明其对左聚糖的催化效率最高。

表2rMle3A对左聚糖、菊粉、蔗糖底物的动力学常数

(6)酶反应底物专一性测定：分别以浓度为2％的菊粉、左聚糖、蔗糖、普鲁兰、木聚糖、右旋糖酐为酶反应底物，在最适反应条件下测定酶活。测定结果(表3)显示，rMle3A纯酶能够水解菊粉、左聚糖、蔗糖，不能水解普鲁兰、木聚糖、右旋糖酐。

表3 rMle3A的底物专一性

底物	酶活力(U/mg)
		蔗糖	349
左聚糖	153
		菊粉	108
普鲁兰	0
		木聚糖	0
右旋糖酐	0

实施例6 rMle3A水解左聚糖和菊粉的产物分析

分别取100μL酶液与500μL 10g/L的左聚糖和菊粉溶液混合。在最适反应条件下水解10h，产物分析采用薄层层析法(TLC)。

(1)配置展开剂(正丁醇50mL，乙酸40mL，水10mL，混匀)，取适量倒入层析杠，静置5min。

(2)用铅笔在距离硅胶板底部1.5cm划线取点样点，第一和最后一个点距硅胶板边缘1cm，点和点之间相距0.7cm。用移液器吸取1μL样品(标品和水解产物)点样至点样点，用吹风机吹干。

(3)放入储有展层剂的层析杠中，上行展开，待展开剂上行到距离硅胶板上沿1cm处，取出用吹风机吹干。

(4)配置显色剂(二苯胺2g、苯胺2mL、85％磷酸10mL、丙酮100mL，混匀)，在硅胶板上均匀喷洒显色剂。

(5)用吹风机吹干后将硅胶板置于80℃烘箱中加热10min，观察结果。

结果见图7，序号1到7依次为菊粉、左聚糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、作用于菊粉水解产物、作用于左聚糖水解产物。结果显示，经过与rMle3A10h的反应，菊粉和左聚糖几乎100％被水解成果糖。因此Mle3A在高果糖浆生产等果糖基资源利用领域具有良好的应用潜力。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请。

Claims (10)

1.一种可降解果聚糖的外切左聚糖酶，是由SEQ ID NO.1序列组成的蛋白。

2.编码权利要求1所述的外切左聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述的编码外切左聚糖酶基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，以pET系列作为载体，将权利要求2所述基因去除信号肽序列，插入NdeI和HindIII作为两个酶切位点间所得。

5.权利要求4所述的重组载体的制备方法：

步骤1，以微杆菌XL1总DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR回收片段；

步骤2，将其与pET28a质粒分别用NdeI和HindIII进行双酶切反应，目的基因与线性质粒载体用solution I连接，得到连接产物；

步骤3，上述连接产物经培养后，得到重组载体pET28a-rMle3A。

6.含有权利要求1或2所述的编码外切左聚糖酶基因的重组菌株。

7.权利要求6所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，将权利要求5中所述的连接产物转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行重组表达。

8.权利要求1或2在降解果聚糖中的应用，其特征在于，用于水解左聚糖、菊粉、蔗糖。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，左聚糖、菊粉的最终水解产物为果糖。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于高果糖浆及结晶果糖的生产。

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