CN103952326A - 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株，该菌株命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.9050。本发明提供工程菌株是通过表达质粒pPIC9和pPIC9K，将菊粉外切酶基因和菊粉内切酶基因整合入毕赤酵母GS115基因组上，并从中筛选获得。通过甲醇诱导发酵该菌，可同时表达两种菊粉酶，经发酵制备的菊粉酶酶活性可达4211.8U/ml，并且用于水解菊粉产生单糖的反应时间短，转化效率高，使得用酶法生产高果糖浆具有充分的可行性，足以取代传统的高果糖浆的生产方法，具有巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高水平共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用。
背景技术
菊粉是由β粉2，1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子，末端常含有一个葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一种催化水解菊粉中β-2，1-呋喃果糖苷键的水解酶。根据其对底物的作用方式，可将其分为2类：一类是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能从菊粉末端逐一切下一个果糖单位，产物为果糖及少量葡萄糖。另一类是菊粉内切酶(endoinulinase)，它从菊粉分子内部随机切断某个β-2，1-糖苷键，水解产物为寡聚糖，可以用来生产低聚果糖。
菊粉酶具有广阔的应用前景，主要表现在以下方面。第一，用来制备高果糖浆。高果糖浆作为低能量功能性甜味剂，具有口感好，甜度高(相对甜度是蔗糖的1.2～1.8倍)。果糖的代谢并不依赖胰岛素，而是直接进入人体肠道内被人体所消化利用，所以果糖的升糖指数远远低于传统糖，被称之为“健康糖”。传统制备高果糖浆的方法是以淀粉为原料，利用淀粉酶将其水解成葡萄糖，再在异构酶的作用下将葡萄糖异构成果糖，这种方法生产的高果糖浆中的果糖含量不足50％，而且果糖的分离成本高；菊粉酶法所制高果糖浆，工艺简单，转化率高，果糖含量高，一步生物酶反应，就可直接生产超高果葡糖浆(UHFGS)(果糖含量90％～95％)。可是由于目前菊粉酶的生产成本较高，并没有在工业上广泛运用。高活性的菊粉酶是制备高果糖浆的关键。第二，用来制备生物乙醇。能源危机是目前全世界面临的重大问题之一。目前生物乙醇的生产主要是以玉米淀粉原料，这造成与人用粮食生产争夺土地的危险境地。菊芋被视为生产燃料乙醇最好的原料之一。菊芋生命力顽强，不仅能够生长在不能作为耕地的盐碱地，还能够生长在贫瘠的荒漠地带。菊芋中主要成分是菊粉，通过菊粉酶将其降解为单糖，再被酵母利用来生产乙醇。它的生产成本与玉米燃料乙醇相比具有一定的成本优势，通过提高原料的利用率，增加副产品的利润，菊芋燃料乙醇的优势将更加明显。菊粉酶的酶活力大小直接影响生产成本，是决定上述应用能不能工业化的最关键因素。
无论应用菊粉酶生产高果糖浆还是燃料乙醇，都需要将菊粉分解成单糖。自然界里，产菊粉酶的微生物的种类很多。据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌17个属40余种，酵母菌10个属20余种，细菌12个属10余种。广泛的研究表明，未经改造的产菊粉酶微生物普遍存在着酶活力低，产量不高，难以大规模培养，无法满足工业化应用。因此借助基因工程技术的手段构建工程菌成了当前的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高水平共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用。
本发明所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.9050。
本发明所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤是：
(1)从马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CGMCC2.1440基因组上克隆菊粉外切酶基因INU1，构建到表达质粒pPIC9上获得重组质粒pPIC9-INU1，利用电转仪将该重组质粒电击转化入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115(His4-)中，然后在MD培养基上筛选得到阳性转化子，经PCR鉴定无误的阳性转化子为GS115-INU1；
(2)将阳性转化子GS115-INU1做成感受态细胞，把克隆自无花果曲霉(Aspergillusficuum)CGMCC3.4322的菊粉内切酶基因INU2构建到表达质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K-INU2，然后将该重组质粒电击转入GS115-INU1感受态细胞中，然后在含有遗传霉素G418的培养基中筛选得到阳性转化子，经PCR鉴定无误的阳性转化子为
GS115-INU1-INU2；
(3)对转化子GS115-INU1-INU2进行3L反应器高密度发酵，1％甲醇诱导8～10天，离心除去菌体，对上清液即粗酶液进行SDS-PAGE验证并检测酶活力；
(4)经SDS-PAGE验证无误，并检测有较高酶活力的阳性转化子即为共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株。
本发明所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株在发酵生产菊粉酶中的应用。
其中：所述重组毕赤酵母菌株发酵生产菊粉酶的方法是：将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-INU1-INU2菌株在YPD培养基中摇瓶培养至菌浓OD600值为4-6，以体积比10％的接种量将其接种到装有1.2L BSM基础盐培养基的3L发酵罐中，发酵过程中流加氨水调控pH值，通气量维持在1-3vvm，转速500-900r/min；菌体生长阶段：温度设定为30±2℃，pH为4.5±0.2，溶氧保持在10％以上，培养22-24h后碳源甘油耗尽，溶氧陡然上升，开始补加500±10ml的50％(w/w)的甘油；诱导产酶阶段：当溶氧再次陡然上升时，温度设置为25±1℃，pH为5.5±0.2，开始流加甲醇，并维持甲醇浓度为1％(w/w)，发酵8-10天，直至检测酶活不再升高时发酵结束；在4℃条件下，对发酵结束后发酵液10000g离心10±2min，去沉淀得到的上清液即为菊粉酶酶液。
进一步的，可将菊粉酶酶液作用于底物菊粉，生成的产物进行薄层层析，分析产物的构成。
本发明通过基因工程手段，将酶活力高的菊粉外切酶基因和菊粉内切酶基因共同整合到一株毕赤酵母基因组上，通过甲醇诱导发酵，同时表达两种菊粉酶，一次发酵便可获得高酶活力的混合酶。本发明的工程菌株具有良好的遗传稳定性，所表达出的混合酶液能够高效地分解菊粉成单糖，效果跟单独使用菊粉外切酶一样。与已报到的王建华构建的高效表达外切菊粉酶的巴斯德毕赤酵母重组菌株CGMCC No.0763(酶活力达到577U/ml)，吕红等利用鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U表达体系，构建的一株基因工程菌(酶活力达到2500U/ml)(中国发明专利CN101063089)相比，本发明的重组毕赤酵母菌株发酵上清液即粗酶液菊粉酶活力提高到4200U/ml以上，外分泌酶蛋白达到5g/L以上。
总之，利用本发明的重组毕赤酵母菌诱导发酵能够高产菊粉酶，该菊粉酶是菊粉外切酶和菊粉内切酶的混合酶，作用效果等同于菊粉外切酶，酶切效率大大提高，I/S＜0.45，酶解菊粉的产物为果糖，可以应用于工业中生产高果糖浆。由于该菌株能够高产菊粉酶，大大降低酶的成本，使得用酶法生产高果糖浆具有充分的可行性，足以取代传统的高果糖浆的生产方法。
附图说明
本发明所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2菌株已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.9050。
图1.GS115-INU1转化子发酵上清液的SDS-PAGE结果图。
其中：泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为对照组GS115；泳道3为实验组GS115-INU1。
图2.GS115-INU1-INU2转化子发酵上清液的SDS-PAGE结果图。
其中：泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为GS115-INU1-INU2；泳道3为GS115-INU1；泳道4为GS115。
图3.GS115-INU1-INU2发酵的生长和酶活力曲线图。
图4.GS115-INU1的薄层层析结果图。
其中：1-5泳道分别是5个标准品，依次对应为果糖，蔗糖，蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，6为对照，7为GS115-INU1作用的样品。
图5.GS115-INU1-INU2的薄层层析结果图。
其中：1-5泳道分别是5个标准品，依次对应为果糖，蔗糖，蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，6为对照，7为GS115-INU1-INU2作用的样品。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2002)中所述的条件进行。
本发明的实施例中使用了以下菌株和质粒：
大肠杆菌(E.coli DH5α)：北京全式金生物科技有限公司。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(His4-)，作为外源表达体系：北京全式金生物科技有限公司，或Invitrogen。
马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CGMCC2.1440：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
无花果曲霉(Aspergillus ficuum)CGMCC3.4322：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
pPIC9质粒：表达质粒，具有AOX启动子，组氨酸标签，购买于Invitrogen。
pPIC9K质粒：表达质粒，具有AOX启动子，遗传霉素(G418)抗性，购买于Invitrogen。
实施例1 构建表达菊粉外切酶INU1的重组毕赤酵母GS115-INU1
1.构建重组质粒pPIC9-INU1
1.1 基因组的提取
用酵母基因组DNA提取试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)提取马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CGMCC2.1440的基因组，具体制备方法参考试剂盒的操作手册。
1.2 基因INU1的克隆
将1.1提取的基因组作为PCR反应的模板，根据NCBI上已知的菊粉外切酶基因序列设计1对引物：
INU1-XhoI上游：
GCCCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGAGATGGTGACAGCAAGGCC
(划线部分为XhoI酶切位点)；
INU1-AvrII下游：
GCCCGCCTAGGATGGTGGTGATGGTGGTGAACGAACGTTACCCAATTTAACG
(划线部分为AvrII酶切位点)，
进行PCR反应，克隆INU1。
PCR扩增条件：预变性94℃2min；98℃10sec；退火55℃30sec；延伸72℃2min；35个循环；72℃延伸10min；12℃保温。利用DNA纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)对目的基因产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。目的基因产物INU1条带大小为1660bp。
1.3 重组质粒pPIC9-INU1的构建
用限制性内切酶XhoI和AvrII分别对1.2回收的目的基因产物INU1和质粒载体pPIC9进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的INU1和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将这两个片段进行连接，形成重组质粒载体pPIC9-INU1。具体酶切和连接步骤，参考操作说明书。
1.4 测序分析
将1.3中的连接液转化大肠杆菌(E.coli DH5α)，具体转化步骤参考说明书，获得的阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序分析，INU1的开放阅读框(ORF)包括1599bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码533个氨基酸。
经测序无误的阳性克隆表达质粒为pPIC9-INU1。
2.毕赤酵母工程菌GS115-INU1的构建
2.1 制备线性化质粒pPIC9-INU1
利用限制性内切酶SacI对1.4中表达质粒pPIC9-INU1进行酶切线性化，利用DNA纯化回收试剂盒进行回收，确保回收浓度在200ng/g/以上，保存备用。
2.2 制备毕赤酵母GS115感受态细胞
(1)接种巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115(His4-)单菌落到含有5ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜；
(2)转接培养液到含有50ml液体YPD的大三角瓶中，接种量1％，30℃培养过夜，直到OD600＝1.3～1.5；
(3)在1500g，4℃条件下，离心培养液5min，沉淀用50ml冰浴的双蒸水重悬；
(4)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用25ml冰浴的双蒸水重悬；
(5)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用2ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬；
(6)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用1ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬，使菌悬液体积大约为1.5ml，得到毕赤酵母GS115感受态细胞，每管80μl于-80℃中保存备用。
2.3 电转质粒
(1)将2.2中制备的80μ1感受态细胞和2.1中制备的5～20μg线性化质粒pPIC9-INU1加入到1.5ml预冷的离心管中，混匀；再将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
(2)冰浴装有转化液的转化杯5min；
(3)按照下列参数设置电转仪，进行酵母电转化：
Cuvette Gap0.2cm；Voltage1.5kv；Field Strength7.5kV/cm；Capacitor25uF；Resistor(pμlse control)400；Time constant approximately9.0msec；
(4)脉冲后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1M的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5ml离心管中；
(5)30℃静置培养1～2h；
(6)分别吸取电转液50μl、100μl、150μl，分别涂布在MD培养基上；
(7)30℃培养直至转化子出现。
2.4 转化子的筛选
挑取转化子单菌落溶解在10μl去离子水中，取2μl菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应10min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻10min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板。试验以野生型毕赤酵母GS115作为阴性对照，INU1基因作为阳性对照。菌落PCR条件：菌体模板4.5μl，EX Taq酶12.5μ1，INU1因子通用引物1μ1，3'AOX通用引物1μ1，去离子水6μl，反应条件：预变性94℃10min，变性98℃10sec，退火55℃30sec，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，12℃保温。
验证无误的阳性转化子命名为GS115-INU1。
2.5 发酵和酶活力测定
(1)将2.4验证无误的阳性转化子和毕赤酵母野生菌分别接种到YPD培养基中，30℃、200r/min培养过夜。转接培养物到BMGY培养基中，培养至OD600值4～6，收集菌体。用BMMY培养基重悬菌体，每24h加甲醇至终浓度0.5％。诱导培养5天后，取发酵液，在4℃条件下，10000g离心10min，去沉淀得上清液，并对上清液进行SDS-PAGE验证，目的蛋白大小在80kDa左右。结果如图1。
(2)酶活力定义及测定
依据国际上绝大多数惯例本发明菊粉酶活力单位定义为：反应体系中每毫升每分钟产生1μ位还原糖所需酶量即为1个酶活力单位。菊粉酶INU1酶活力的测定如下，取菌液100μ1与900μ1菊粉浓度为2％的pH4.6、0.1M醋酸缓冲液混合，55℃反应10min，反应液置于沸水中灭活10min，取100μ1的反应液加入到含有1.5ml的DNS和1.4ml无菌水中，沸水中反应5min，反应完毕立即冷却，定容到20ml，比色。此操作以沸水中处理5min的菌液作为对照，每个反应设置3个对照。根据标准曲线求出酶解产物中还原糖含量及其酶活力。
本实施例中筛选到的转化子中，在上述条件下最高酶活力达到70U/ml以上。
(3)通过实验比较，将SDS-PAGE验证无误，并检测到较高酶活力的阳性转化子，确定为重组毕赤酵母GS115-INU1。
实施例2 构建表达菊粉外切酶INU1的重组毕赤酵母GS115-INU1-INU2
1.构建重组质粒pPIC9K-INU2
1.1 基因组的提取
用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(Bioer Technology co.,Ltd.)提取无花果曲霉Aspergillus ficuum CGMCC3.4322的基因组，具体制备方法参考试剂盒的操作手册。
1.2 基因INU2的克隆
将1.1提取的基因组作为PCR反应的模板，根据NCBI上已知的菊粉内切酶基因序列设计1对引物：
INU2-EcoR I上游：
ACGCGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTT(划线部分为EcoR I酶切位点)；
INU2-Not I下游：
ATAGCGGCCGCTCATTCAAGTGA AACACTCC(划线部分为Not I酶切位点)，
进行PCR反应，克隆INU2。PCR扩增条件：预变性94℃2min；98℃10sec；退火55℃30sec；延伸72℃2min；35个循环；72℃延伸10min；12℃保温。利用DNA纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)对目的基因产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。目的基因产物INU2条带大小为1503bp。
1.3 重组质粒pPIC9K-INU2的构建
用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对1.2回收的目的基因产物INU2和质粒载体pPIC9K进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的INU2和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将这两个片段进行连接，形成重组质粒载体pPIC9K-INU2。具体酶切和连接步骤，参考操作说明书。
1.4 测序分析
将1.3中的连接液转化大肠杆菌(E.coli DH5α)，具体转化步骤参考说明书，获得的阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序分析，INU2的开放阅读框(ORF)包括1482bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码494个氨基酸。
经测序无误的阳性克隆表达质粒为pPIC9K-INU2。
2.毕赤酵母工程菌GS115-INU1-INU2的构建
2.1 制备线性化质粒pPIC9K-INU2
利用限制性内切酶SacI/SalI对1.4中表达质粒pPIC9K-INU2进行酶切线性化，利用DNA纯化回收试剂盒进行回收，确保回收浓度在200ng/μg以上，保存备用。
2.2 制备重组毕赤酵母GS115-INU1感受态细胞
(1)接种实施例1已构建好的重组毕赤酵母单菌落GS115-INU1到含有5ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜；
(2)转接培养液到含有50ml液体YPD的大三角瓶中，接种量体积比1％，30℃培养过夜，直到OD600＝1.3～1.5；
(3)在1500g，4℃条件下，离心培养液5min，沉淀用50ml冰浴的双蒸水重悬；
(4)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用25ml冰浴的双蒸水重悬；
(5)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用2ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬；
(6)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用1ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬，
使菌悬液体积大约为1.5ml，得到重组毕赤酵母GS115-INU1感受态细胞，每管80μl于-80℃中保存备用。
2.3电转质粒
(1)将2.2中制备的80μl感受态细胞和2.1中制备的5～20μg线性化质粒pPIC9K-INU2加入到1.5ml预冷的离心管中，混匀，再将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
(2)冰浴装有转化液的转化杯5min；
(3)按照下列参数设置电转仪，进行酵母电转化：
Cuvette Gap0.2cm；Voltage1.5kv；Field Strength7.5kV/cm；Capacitor25uF；Resistor(pμlse control)400；Time constant approximately9.0msec；
(4)脉冲后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1M的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5ml离心管中；
(5)30℃静置培养1～2h；
(6)分别吸取电转液50μl、100μl、150μl，分别涂布在含有0.25mg/ml遗传霉素G418的培养基上；
(7)30℃培养直至转化子出现。
2.4 转化子的筛选
挑取转化子单菌落溶解在10μl去离子水中，取2μl菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应10min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻10min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板。试验以重组毕赤酵母GS115-INU1作为阴性对照，INU2基因作为阳性对照。菌落PCR条件：菌体模板4.5μl，EX Taq酶12.5μl，INU2因子通用引物1μl，3'AOX通用引物1μl，去离子水6μl，反应条件：预变性94℃10min，变性98℃10sec，退火55℃30sec，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，12℃保温。目的条带的大小为1673bp。
经PCR鉴定无误的阳性转化子命名为GS115-INU1-INU2。
2.5 发酵和酶活力测定
(1)将2.4验证无误的阳性转化子和重组毕赤酵母GS115-INU1分别接种到YPD培养基中，30℃、200r/min培养过夜。转接培养物到BMGY培养基中，培养至OD600值4～6，收集菌体。用BMMY培养基重悬菌体，每24h加甲醇至终浓度0.5％。诱导培养5天后，取发酵液，在4℃条件下，10000g离心10min，去沉淀得上清液，并对上清液进行SDS-PAGE验证，目的蛋白有两条，大小分别在80kDa和60kDa左右，而对照组GS115-INU1只有一条大小为80kDa左右的带。结果如图2。
(2)菊粉酶酶活力的测定如实施例1所述，本实施例所筛选到的转化子中，在上述的条件下，测到的酶活力最高达到800U/ml以上。
(3)通过实验比较，将SDS-PAGE验证无误，并检测到较高酶活力的阳性转化子，确定为重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2，即为本发明所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株。该菌株已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.9050。
实施例3 利用本发明所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2菌株高密度发酵大量表达菊粉酶的方法
该方法使用的主要仪器有：
发酵罐Labfors5(3.6L)：购买自伊孚森生物技术有限公司
具体方案如下：
将转化子GS115-INU1-INU2接种到100mlYPD培养基中，摇瓶培养至菌浓OD600值为4-6，以体积比10％的接种量接到装有1.2LBSM基础盐培养基的3L发酵罐中，进行分批补料培养。发酵过程中流加氨水调控pH值，通气量维持在1～3vvm，转速400-900r/min。
菌体生长阶段：温度设定为30℃，pH为4.5，溶氧保持在10％以上，培养22-24h后碳源甘油耗尽(溶氧陡然上升)，开始补加约500ml50％(w/w)的甘油，此过程中每12h取一次样，测菌浓OD600，监测生长状况。
诱导产酶阶段：当溶氧再次陡然上升时，温度设置为25℃，pH为5.5，开始流加甲醇，并维持甲醇浓度为1％(w/w)，直至发酵结束，补加100％甲醇约1L，此阶段发酵过程中每24h取一次样，测定菌浓OD600，并测定菊粉酶酶活力。结果如图3。
从图中可以看出，甘油培养生长72h后，开始加1％甲醇进行诱导发酵，发酵10天后，最高酶活力达到4211.8U/ml，是目前有关菊粉酶报道的文献中最高水平，而且菌株表现稳定的遗传性。
发酵结束后，在4℃条件下，对发酵液10000g离心10min，去沉淀得到的上清液即为菊粉酶酶液。
对菊粉酶酶液添加适当的保护剂，即可制成酶制剂。
实施例4 酶制剂作用菊粉底物分析
1.酶解菊粉
将实施例3中所制备的酶制剂(即含有菊粉外切酶和内切酶的混合酶)和通过实施例3的方法发酵GS115-INU1所制备的酶制剂(即只含有菊粉外切酶)按照1：1000的比例与菊粉浓度为2％的pH4.6、0.1M醋酸缓冲液混合，55℃反应2h，然后反应液置于沸水中灭活10min，用无菌水稀释4倍后作为待测样品。对照组用无菌水代替了酶制剂。
2.薄层层析
取制备好的样品液，在硅胶C薄层板上点样，与标准溶液一同用溶剂展开，再用显色剂喷板，烘干后与标准对照，确定样品液中低聚果糖的种类。结果如图4和图5。
从实验结果可以看出，单独菊粉外切酶(INU1)作用菊粉的效果和混合双酶
(INU1+INU2)作用菊粉的效果一样，最终的产物都只有单糖，对照组没有任何层析出来的点，说明这些单糖都是菊粉酶所作用的结果。
综上，从上述的结果可以看出，转化子所产的混合双酶的酶活力远远大于只产菊粉外切酶的转化子，酶活是后者的10倍以上，而从本实施例4中可以看出，两者对菊粉的最终作用产物相同，都是单糖，因此，该技术既有极大的优越性。在高密度发酵下，混合酶的转化子GS115-INU1-INU2的酶活力达到4211.8U/ml，远远高于同行报道的菊粉外切酶酶活力，在工业上利用酶法生产高果糖浆，具有巨大的应用价值。
Claims (4)
1.一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.9050。
2.权利要求1所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤是：
(1)从马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CGMCC2.1440基因组上克隆菊粉外切酶基因INU1，构建到表达质粒pPIC9上获得重组质粒pPIC9-INU1，利用电转仪将该重组质粒电击转化入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115(His4-)中，然后在MD培养基上筛选得到阳性转化子，经PCR鉴定无误的阳性转化子为GS115-INU1；
(2)将阳性转化子GS115-INU1做成感受态细胞，把克隆自无花果曲霉(Aspergillusficuum)CGMCC3.4322的菊粉内切酶基因INU2构建到表达质粒pPIC9K上获得重组质粒
pPIC9K-INU2，然后将该重组质粒电击转入GS115-INU1感受态细胞中，然后在含有遗传霉素G418的培养基中筛选得到阳性转化子，经PCR鉴定无误的阳性转化子为GS115-INU1-INU2；
(3)对转化子GS115-INU1-INU2进行3L反应器高密度发酵，1％甲醇诱导8～10天，离心除去菌体，对上清液即粗酶液进行SDS-PAGE验证并检测酶活力；
(4)经SDS-PAGE验证无误，并检测有较高酶活力的阳性转化子即为共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株。
3.权利要求1所述共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株在发酵生产菊粉酶中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组毕赤酵母菌株发酵生产菊粉酶的方法是：将巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-INU1-INU2菌株在YPD培养基中摇瓶培养至菌浓OD600值为4-6，以体积比10％的接种量将其接种到装有1.2L BSM基础盐培养基的3L发酵罐中，发酵过程中流加氨水调控pH值，通气量维持在1-3vvm，转速500-900r/min；菌体生长阶段：温度设定为30±2℃，pH为4.5±0.2，溶氧保持在10％以上，培养22-24h后碳源甘油耗尽，溶氧陡然上升，开始补加500±10ml的50％(w/w)的甘油；诱导产酶阶段：当溶氧再次陡然上升时，温度设置为25±1℃，pH为5.5±0.2，开始流加甲醇，并维持甲醇浓度为1％(w/w)，发酵8-10天，直至检测酶活不再升高时发酵结束；在4℃条件下，对发酵结束后发酵液10000g离心10±2min，去沉淀得到的上清液即为菊粉酶酶液。
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