CN1594542A - 黑曲霉菊粉内切酶基因和表达该基因的重组毕赤酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明筛选到产菊粉内切酶的黑曲霉(Aspergillus niger)9891CGMCC NO：0991，从中克隆出菊粉内切酶基因，对目的基因片段进行测序分析，不含信号肽的基因开放读码框长1485bp，编码509个氨基酸，该蛋白计算分子量约为55.9KD，该基因与近年报道的及几例真菌菊粉内切酶基因作同源性分析发现：与黑曲霉(Ohtak.et al，1998)，Aspergillus ficuum(Uhm，t.，et al，1998)菊粉内切酶基因同源性分别为92％和95％。将不带有DNA原基因信号肽编码序列的菊粉内切酶基因插入到毕赤酵母表达载体上，构建重组表达载体，用于转化毕赤酵母得到了重组子，该基因在毕赤酵母中实现了分泌表达，表达产物具有功能性。试管水平初筛结果表明：优秀重组子I3－50比出发菌株内切菊粉酶活性(以蔗糖作为底物)表达量高84倍。将重组酵母进行诱导发酵，对重组酶进行酶学性质分析表明，最适反应pH约5.5，最适反应温度约55℃。

Description

黑曲霉菊粉内切酶基因和表达该基因的重组毕赤酵母菌株

技术领域

本发明涉及DNA技术领域，具体地说，本发明涉及产菊粉内切酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger 9891，以及从中克隆出的新的菊粉内切酶基因，本发明还涉及含有所述基因的重组毕赤酵母，所述重组酵母比出发菌株内切菊粉酶活性(以蔗糖作为底物)表达量高84倍。

背景技术

果寡糖(FOS)是由3-10个果糖单位组成的低聚糖化合物，是动物和人体内微生态平衡的有效调节物质，已广泛证实寡糖对人体和动物体生长发育具有一系列积极作用。包括：1)促进动物增重、提高动物的饲料转化效率、改善动物体的健康状况，提高日增重(Fukuyasu T.和Oshida T.，1988；Nakamura K.，1988)。据报道果寡糖使兔的日增重较对照提高6.4％，饲料消耗下降7.8％(Bastien R.，1990)；2)果寡糖可以大大降低仔猪腹泻率(Fukuyasu T.和Oshida T.，1988)。日粮中添加0.75％果寡糖可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12％，且在断水断粮一天的应激条件下，果寡糖处理的肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照要低4倍(Bailey J.S.等人，1991)；3)果寡糖可以使兔死亡率降低32％(Bastien R.，1990)；4)果寡糖产品均安全无毒副作用，在体内不累积；5)直接促进动物肠道有益菌的生长；6)正向刺激机体免疫活性；7)果寡糖等可预防人的牙病、降血压和预防糖尿病与肥胖症；8)还能够吸附真菌毒素，减少抗生素等化学药物的使用，是生产绿色动物食品重要的添加剂；9)是常规甜味剂的替代品和低热值功能食品的有效碳源。因此，关于低成本生产果寡糖新途径的研究具有重要意义。

国内外生产的果寡糖工艺有两大弊端：(1)产物纯度低，以蔗糖为原料依靠果糖转移酶，催化一个蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上形成带有一个葡萄糖分子或蔗糖分子的蔗果寡糖，产物中蔗糖，葡萄糖和寡糖均有相当比例，寡糖至多为55％(Yun JW et al.，1990；1992，Hidaka H et al.，1988；Jung KH et al.，1989，见如下二反应式)，虽通过离子交换分离可以提高纯度，由于产物寡糖的单糖单位数量并不一致，分离效果差，成本高；(2)上述反应中形成的葡萄糖对果糖转移酶活性有明显抑制作用，至今没有降低果糖转移酶反应体系中葡萄糖含量的有效办法(Yun JW etal.，1993a；b)。因此，研究低成本生产高纯度(＞90％)果寡糖的新途径很有必要。

菊粉酶研究重点一直放在外切型菊粉酶上，对内切型菊粉酶偏少，多数研究因为无法区别而干脆含糊二者之间区别。近年本项目组在外切型菊粉酶的高产育种中取得了突破性进展(王建华等，1998；1999a，b；2000；2001；2002)，同时也进行了内切型菊粉酶的筛选等初步研究工作，在曲霉和酵母中均筛选有产内切菊粉酶原始菌株。

对于既产内切酶又产外切酶的菌种的混合酶的分离一般采用NaCl进行线性梯度洗脱，有些微生物菊粉酶不宜用硫酸铵沉淀，可用丙酮、乙醇沉淀或冷冻干燥。菊粉酶为糖蛋白，含糖量为26％-37％，低聚糖以糖苷键形式与酶蛋白中天门冬酰胺相连，纯菊粉酶在SDS-PAGE和活性电泳中表现出几条谱带是因各组分含糖量不同所致，Endo-H脱糖处理后得到单一电泳谱带。^【16】菊粉内切酶水解菊粉随机切断开菊糖链内部糖苷键，产物主要为低聚果糖。

1996年Onodera小组首次从青霉(Penicillium purprogenum)中克隆到菊粉内切酶(EC 3.2.1.7)基因inuA并测序，发现该酶的结构基因含有1548bp，编码515个氨基酸，其中25AA为信号肽，490AA为成熟酶蛋白，推算的酶蛋白分子量为54000Da，纯化酶MW64kDa，pI3.6，粗酶I/S值高达50，纯化酶I/S值高达4140，结构基因中未发现内含子，成熟酶蛋白至少含有一个分子量为1000的糖基化侧链，该基因的启动子特征序列TATAAAT位于ORF上游区域的786-792碱基片断。该酶只能降解多聚果糖和低聚果糖的β-2，1果糖苷键，并不能降解蔗糖或果聚糖的β-2，6果糖苷键，分析AA序列发现有与活性中心有关的高度保守的β-果糖苷酶模式序列，并认为第43位AA--谷氨酸残基为该酶的活性中心基团。水解菊粉(DP₃₅)FG9、GF7、GF6、GF5、GF4、GF3、GF2的Km和Vmax分别为0.2mmol/L和100、0.24mmol/L和86.5、0.33mmol/L和132、0.85mmol/L和71.2、3.8mmol/L和25.4、2.8mmol/L和28.8、16mmol/L和0.8、84mmol/L和0.2，随着DP降低，Km增大，Vmax下降，水解GF5的Km明显增大，表明该酶活性中心至少有7个结合位点，N端序列为-DDYRPTFHFCPAENWMNEPNGLIKIDSTWH-.在上述两个青霉型内切酶的N端序列中，都存在有β-呋喃果糖苷酶家族的特征结构域-HXXPXXXXMN DPNG-。最适反应pH5，在pH4-10范围内相当稳定，高于55℃稳定性很差，Glu-43和233是菊粉内切酶活性中心功能基团。另外一种青霉内切菊粉酶来自于Penicillium sp.TN-88[24]，Km值为0.2mmol/L，只作用于菊粉而不作用于蔗糖、棉子糖、I/S值无穷大，纯化酶蛋白MW68kDa，N端序列为-DDYRPAFCPAENXMNEPN GLIQIXSTXH-，Mg²⁺可提高菊粉酶活性18％，Ag⁺、Hg²⁺、对高氯汞苯甲酸，溴代琥珀酰胺，碳二亚胺能完全抑制酶活性。最适温度50℃，最适pH5.2。

Aspergillus ficuum^[25]纯化酶有3种，外切酶I，外切酶II和内切酶I，其中内切酶I的MW47.2kDa，降解菊粉所需最低活化能为20.0kJ/mol，降解蔗糖最低活化能为29.8kJ/mol，Km 1mmol/L，几乎不水解蔗糖，Ca²⁺使酶活增加，Hg²⁺、Ag¹⁺、Mn²⁺强烈抑制酶活，表明酶活性中心有-SH基团，吲哚乙酸、EDTA、磷酸吡哆醇对酶活没有显著影响，A.niger^[20]纯化内切酶MW54kDa，只水解菊粉，对蔗糖无作用，最适温度45℃，50℃以上开始失活，80℃时完全失活，最适pH5.3、pH4.0-7.5时酶活为100％，pH3.2时为76％，pH9.0时为51％，pH10.0时几乎完全失活。Arthrobaltersp.^[26]只产内切酶，粗酶液经硫酸铵沉淀和DEAE-cellulose柱显示有两个峰，其中一个峰用0.35M NaCl洗脱，水解菊粉为低聚果糖和果糖，另一个峰用0.2M NaCl洗脱水解菊粉只产低聚果糖。N端AA序列为-ATGDPVLRLTYDQPNGSTTVLDEVGRSNFTV-，和其它微生物菊粉内切酶相比没有序列相似性。酶反应最适pH7.5，温度50℃，在pH5.0-10.5，温度30-40℃较稳定，达最大酶活80％以上。Km1.7mM，Hg²⁺、EDTA强烈抑制酶活，Ca²⁺促进酶活，Mg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、L-甘氨酸对酶活影响不大。该酶水解菊粉主要产物1h后为F5、F6、F7，没有单糖；8h后产物主要为F3、F4、F5，其中F5含量最少。Streptomyces rochei E87内切酶水解菊粉主要产物为F3，粗酶活达1.0U/ml，Ca²⁺能增加酶活，底物浓度为10-50gL^-1时，F3产率为70％。Xanthomonas sp.内切酶粗酶活达11U/ml(1.2mg蛋白质ml-1)最适反应温度45℃，pH6.0，水解菊粉产物主要为DP5、DP6。Cryptococcus C10^【23】在30℃、pH5.5，菊芋干粉5％，NH₄H₂PO₄ 0.5％条件下，酶活可达12U/ml，I/S值为14，Mn²⁺对酶合成具激和作用，而Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺有抑制作用。

内切菊粉酶的基因结构和表达研究

黑曲霉^[27]内切菊粉酶有两种基因inuA和inuB，ORF长度均为1548bp，编码516个AA，前23个为信号肽，不含内含子，二者间有8个AA不同，两种酶蛋白前体MW分别为55,796和55,804Da，pI分别为4.36和4.41，二者G+Cmol％分别为54％和54.3％，有5个可能糖基化位点，成熟酶蛋白含7％碳水化合物，无花果曲霉内切菊粉酶基因inu2^[28]ORF长度为1551bp，编码492AA，MW55，790Da，前22AA为信号肽，与Penicillium purpurogenum内切酶之间序列同源性高达73.3％，将A.ficuum内切菊粉酶基因inu2^【29】在Saccharomyces cerevisiae中表达得到了S.cerevisiaeYSH2.64-2c(PR₄ INU2)基因工程菌，只产内切酶，不产外切酶，但表达水平很低。Penicillium pur.内切菊粉酶基因inuA ORF长度为1548bp，编码515AA，前25AA为信号肽，酶蛋白MW 54kDa，G+Cmol％为47.8％；同源性分析发现：该青霉内切菊粉酶基因与克鲁维马科斯酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉外切酶基因、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)转化酶基因和枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)果聚糖酶基因的同源性分别为27％、29％和39％。说明菊粉内切酶与上述酶基因同源性都较低。Arthrobacter sp.S37^[30]内切菊粉酶基因ORF长2439bp，有一53AA信号肽，成熟酶蛋白为759AA，比其它微生物菊粉酶大135-297AA。和Aspergillus niger、A.ficuum、P.purpurongenum内切酶基因，Kluyreromyces maxianus(Laloux et al 1991)外切酶基因，Bacillus subtilis(Martin et al 1987)左旋糖苷酶基因，Saccharomycescerevisiae(Taussig and Carlson 1983)转化酶基因序列同源性分别为15.3％、15.3％、15.6％、13.8％、16.0％和13.3％。有5个保守序列：-WTNEPHG-，-YHMFYQ-，-WGHMTS-，-RDPYL-，-WEMP-。Glu-323和Glu-519为该酶催化活性位点，其C端特殊摸体-SVIDVF-和-SVEVF-序列相似，可能在酶与高分子量果聚糖结合中起重要作用。

以E.coli为宿主菌、所作表达研究表明，inuA表达酶蛋白产量很低，几乎检测不到；Pseudomonas sp.内切菊粉酶基因inul在E.coli中得到表达，工业化生产不方便。

发明内容

本发明目的之一筛选得到产高产菊粉内切酶的黑曲霉菌株(Aspergillusniger)9891。

本发明另一个目的是提供一种新的菊粉内切酶基因，来自于黑曲霉菌株(Aspergillus niger)9891。

本发明又一个目的是提供一种含有所述基因的重组子毕赤酵母，所述重组子比出发菌株内切菊粉酶活性(以蔗糖作为底物)表达量高84倍。

发明详述

本发明提供了一种产高产菊粉内切酶的黑曲霉菌株(Aspergillus nige)9891，在以菊粉为底物测定的胞外和胞内菊粉酶活性分布随培养时间而呈相反变化，胞外酶活性是下降的(图1)，胞内酶活性是上升的，且绝对值均＜4；但以蔗糖为底物测定的胞外和胞内菊粉酶活性分布都是随培养时间而上升的(图3和图4)，且胞外达到最高活性单位＜5.5，胞内活性高达50IU。

本发明也提供了一种新的菊粉内切酶基因。从产菊粉内切酶黑曲霉菌株9891中克隆菊粉内切酶基因inu9891，它有一个编码495个氨基酸的开放读码框，该蛋白MW为53.4KD；该基因与黑曲霉(Ohtak.et al，1998)和Aspergillus ficuum(Uhm，T.，etal.，1998)菊粉内切酶基因同源性均为94％；与青霉来源菊粉内切酶基因(Onodera S.，Murakami T.，Ito H.et al.，1996)的同源性67％(图6和表2)；与细菌来源菊粉内切酶基因和酵母来源菊粉外切酶基因同源性均很低。

本发明还提供了含有菊粉内切酶基因inu9891的表达载体。在一个优选的实施方案中，将不带有原基因信号肽编码序列的inu9891插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115表达载体pPIC9上，得到重组载体pPIC9-1；

在一个优选的实施方案中，将不带有原基因信号肽编码序列的inu9891插入到嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)PMAD16表达载体pMETαA上，得到重组载体pMETαA-2；

在一个优选的实施方案中，将不带有原基因信号肽编码序列的mu9891插入到嗜甲醇毕赤酵母PMAD16表达载体pMETαC上，得到重组载体pMETαC-2；

本发明还提供了含有菊粉内切酶基因inu9891的工程酵母菌。在一个优选的实施方案中，将pPIC9-1经酶切后转化巴斯德毕赤酵母GS115得到了重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891，该基因在宿主酵母中实现了分泌表达，上发酵罐表达结果重组子最高表达量达到2.15mg/mL(发酵液)，MW59kD，糖基化12％；胞外菊粉内切酶活性达1501U/ml(蔗糖作底物)，比出发菌株高272.7倍；以菊粉作为底物测定的活性达291.1U/ml，比出发菌株高105倍；该水平比2001年最新报道重组酿酒酵母表达的国际最高水平高9.4倍，而发酵时间提前72h；重组酵母分泌酶最适反应pH约5.6，最适反应温度约50℃，与出发菌株酶的特性相同；

工程酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891在7升Eastbio-2000实验发酵罐上表达的产酶高峰时间为诱导60h和48h(EFT78h和90h)，分别为1501.4IU/ml(蔗糖为底物)和291.1IU/ml(菊糖为底物)，生物量分别为184g/L(FW)和194g/L(FW)，最高产酶水平比基因供体菌株高约273和105倍，比2001年报道的产黑曲霉菊粉内切酶的多拷贝重组酿酒酵母表达的国际最高水平(菊糖为底物)27.9IU/ml(Park，S.，et al.，2001)高9.4倍，时间提前3天。

在一个优选的实施方案中，将pMETαA-2转化嗜甲醇毕赤酵母PMAD16得到了重组酵母嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891，该基因在宿主酵母中实现了分泌表达，初筛结果重组子比出发菌株在相同发酵时间表达的菊粉内切酶活性(蔗糖作底物)高83倍和5倍(菊糖作底物)，表达蛋白量0.575mg/mL(发酵液)，MW59kD，糖基化12％；重组酵母分泌酶最适反应pH约5.5，最适反应温度约55℃。

有益效果

与该巴斯德毕赤酵母表达系统典型表达模式比较，工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891具有如下特点：

(1)达到最高产酶水平的诱导时间从该工程菌株典型培养的120--188h缩短到48--60h，缩短50h；全程发酵时间(Elapsed Fermentation Time，EFT)在100h内；

(2)培养基起始pH控制在4.0以上，而不是典型培养时pH控制在1-1.5之间，改进的替代措施：一是将原先补充大量氨水改为用铵盐，二是减少浓硫酸用量。避免了低pH环境对发酵设备的腐蚀，提高了车间环保水平；培养期间控制pH4.0，而典型培养控制pH5，降低了污染几率；

(3)基础培养基和补料培养基碳源改用葡萄糖替换该表达系统的指定碳源甘油；

(4)该表达系统要求在高于400g/L(FW)生物量下获得目标产物最高表达。本成果工程菌株获得最高产酶水平的生物量较低为184g/L(FW)--194g/L(FW)，其优点在于：可以得到较高的酶液总体积和总酶量，较高单个细胞分泌酶量，和较少需要处理的菌体副产品量；尤其是产菊粉内切酶天然菌株往往只有几个活性单位，本成果工程菌株大量廉价表达该酶的实际意义就愈益明显；

(5)本发明解决了一步酶方法生产菊粉寡糖关键技术难题。

预期本项目在菊粉产业发展中有良好推广应用前景，能够产生较大社会经济效益。未来5年全球食品、饮料、医药、饲料等领域对于的潜在市场需求预期数据为：17万吨菊粉寡糖产品，需要菊粉内切酶1700吨，酶产值17亿元，菊粉寡糖75亿元，合计产值92亿元。利润按照30％计算为27.6亿元。

菌株保藏

黑曲霉(Aspergillus niger)9891菌株于2003年8月14日保藏于中国科学院微生物所普通微生物保藏中心，保藏号CGMCC NO：0991。

附图简述

图1显示黑曲霉胞外菊粉内切酶作用于菊粉的活性曲线。

图2显示黑曲霉胞内菊粉内切酶作用菊粉的活性。

图3显示黑曲霉胞外菊粉内切酶作用于蔗糖的活性曲线。

图4显示黑曲霉胞外菊粉内切酶作用于蔗糖的活性曲线。

图5.用不同引物对来自于黑曲霉9891的inu9891 PCR的琼脂糖凝胶电泳

其中：泳道1和2来自于引物P1f和P1r的PCR DNA；

泳道3和5来自于引物P2f和P2r；

泳道6来自于引物P3f和P3r；

泳道7是DNAMW标记物。

图6.来自于Genbank的4种菊粉内切酶DNA序列的同源性比较。

Sequence format is Pearson；And segment sharing homology was chosen and shown in this figure.

Sequence 1：AY160108，1473bp，来自于黑曲霉的菊粉内切酶基因(inu9891)；

Sequence 2：AJ006951，1510bp，来自于Aspergillus ficuum的菊粉内切酶基因(inu2)；

Sequence 3：AB012771，1502bp，来自于黑曲霉的菊粉内切酶基因(inuA)；

Sequence 4：D84360，1502bp，来自于Penicillium purpurogenum菊粉内切酶基因；

图7.带有inu9891的来自于巴斯德毕赤酵母GS115的pPIC9表达载体

图8.从载体pPIC9-1的inu 9891 PCR

其中：编号1为用单个SnaBI线性化的pPIC9-1；

编号2为用BglII消化后的线性化的pPIC9-1。

图9pPIC9和pPIC9-1的线性化。

其中：编号1为BglII消化后的线性化的pPIC9；

编号2为消化后的pPIC9-1。

编号3为BglII消化后的线性化的pPIC9-1；

编号4为DNA标记物。

图10.带有inu9891的来自于嗜甲醇毕赤酵母PMAD16的pMETαA表达载体

图11.重组载体pMETαA和pMETαC的特性

其中：谱带3，7和10作为标记DNA；

谱带1：用PacI双消化pMETαA-2获得的2.2kb+7.3kb；

谱带2：用PacI双消化pMETαC-2获得的2.2kb+7.3kb；

谱带4是pMETaA，

谱带5和6分别是重组pMETαA-2和pMETaC-2；

谱带8由SnaBI单个消化获得的线性pMETaA-2和谱带9是空白pMETaA。

图12.用于嗜甲醇毕赤酵母PMAD16的从pMETαC制备的带有inu9891的表达载体。

图13.从重组表达载体进行的inu9891 PCR

^*No.1，3，5 PCR产物用引物Pfactor f和PAOX1r从重组pPIC9-1得到；

No.6用引物Pfactor f和PAUG1r从重组pMETαA-2得到；

No.7用引物Pfactor f和PAUG1r从pMETαC-2获得；

No.8是DNA MW标记物。

图14.重组巴斯德毕赤酵母GS115/9891和嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891的模板DNA的inu9891 PCR

其中No.1和2来自于巴斯德毕赤酵母GS115/9891；

No.3和4来自于嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891via pMETαA-2；

No.5和6来自于嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891via pMETαC-2；

No.7是标记DNA

图15重组巴斯德毕赤酵母GS115/9891分泌菊粉内切酶的pH概况

图16重组嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891分泌菊粉内切酶的pH概况

图17重组巴斯德毕赤酵母GS115/9891分泌菊粉内切酶的温度概况

图18重组嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891分泌菊粉内切酶的温度概况

图19工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891产酶发酵工艺(7升罐)

图20巴斯德毕赤酵母GS115/9891菊粉内切酶的分泌曲线

图21由菊粉内切酶水解菊粉的情况。

图22重组巴斯德毕赤酵母GS115/9891 I1-04分泌菊粉内切酶的SDS-PAGE电泳图谱

其中No.1，2，3，4号分别为发酵1，2，3，4天的发酵液上清样品，No.5号为蛋白质MW标记物。

下面是实现本发明的优选实施方式。

下面是实施例中使用如下的菌种和质粒：见表1。

                           表1  供试菌种和质粒

菌株/质粒                   特性                           来源

Aspergillus niger 9891     菊粉内切酶的供体               本实验室保存

E.coli DH5α                                SupE44，ΔlacU169，hsdR17，    本实验室保存

                           recA1，gryA966，thi-1，relA1

巴斯德毕赤酵母GS115        his4                           从Invitrogen公司购买

GS115(pPIC9-1)/9891                                       本发明

pPIC9                                                     从Invitrogen公司购买

pPIC9-1                                                   本发明

pPIC9-11                                                  本发明

嗜甲醇毕赤酵PMAD16         Ade2-11 pep4                   从Invitrogen公司购买

PMAD16(pMETαA-2)/9891                                    本发明

PMETαA                                                   从Invitrogen公司购买

pMETαA-2                                                 本发明

pMETαA-21                                                本发明

下面实施例中的酶和试剂：限制酶，pfuDNA聚合酶，T4DNA连接酶，溶菌酶等分别购自Biolabs，Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。菊糖购自Sigma公司，DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品，PCR纯化回收试剂盒和凝胶回收试剂盒为QIAGene产品其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

下面实施例中的培养基：LB培养基见《分子克隆实验指南》3版(中文译本，科学出版社，2002年)，YPAD，BMDY，BMMY，MM，MD培养基见Invitrogen毕赤酵母操作手册。

SDS-PAGE：参照BIO-RAD实验手册进行。

下列实施例中：

酶蛋白脱糖基化处理Endo H系NEB产品(#P0702S)：参照产品说明书的条件进行反应：Endoglycosidase H变性糖蛋白in 1X变性缓冲液(0.5％SDS，1％b-巯基乙醇)at 100℃ for 10minutes。在G5缓冲液[50mM柠檬酸钠(pH5.5，25℃)]at 37℃，培养，之后按照2.2.7程序操作。.

酶活性测定：用重组酵母诱导所产生的粗酶液水解菊糖(含量99％，比利时生产)或者是99％分析纯蔗糖，用DNS法测定反应液中产生的还原糖。酶活力单位定义：在最适反应条件下，每1min生成1υmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(IU)。

                                 实施例1

                     产菊粉内切酶的黑曲霉菌株的筛选

以菊粉为唯一碳源，以菊粉酶活性为定向筛选指标从真菌中定向筛选产菊粉内切酶菌株发现一株产菊粉内切酶活性的黑曲霉(Aspergillus niger)9891 CGMCC NO：0991。以菊粉为底物测定的胞外和胞内菊粉酶活性分布随培养时间而呈相反变化，胞外酶活性是下降的(图1)，胞内酶活性是上升的(图2)，且绝对值均＜4；但以蔗糖为底物测定的胞外和胞内菊粉酶活性分布都是随培养时间而上升的(图3和图4)，且胞外达到最高活性单位＜5.5，胞内活性高达50IU。

                               实施例2

                   黑曲霉菊粉内切酶基因的PCR克隆

一.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)9891总DNA的提取

采用中性裂解法。Czapek培养基中，30℃，200r/min，培养2.5天后过滤收集菌丝，浸入液氮速冻菌丝并研磨成粉末，称取50mg冻干菌丝悬浮于浸提缓冲液(0.5％SDS，200mMol/LTris，25mMol/LEDTA，250mMol/L NaCl pH8.5)离心后，吸取上清加入25ulRNase，37℃处理5-10min，加入等体积酚；酚：氯仿；氯仿：异戊醇分别抽提，离心后吸取水相加入0.54体积异丙醇沉淀，沉淀用70％乙醇洗后真空干燥，溶于50υl无菌水中备用。

二.PCR扩增

扩增条件：94℃5min；94℃ 1min--55℃1min--72℃1min：共35循环；72℃ 10min。用Techgene 0.5型扩增仪扩增。

根据已报道的来源于黑曲霉的菊粉内切酶基因序列设计了4对PCR引物，以黑曲霉9891基因组DNA为模板进行PCR扩增，至少有3对引物能扩增出与设计大小吻合的特异带，其中有2个PCR产物用于后续转化和表达研究：

P1f：5’ACAATT GAATTCTATGCAGTCTAATGATTACCGTG3’；

P1r：5’ACAATT GAATTCTTATCACCGTCTTAATCCCCTTC3’

P2f：5’ACAATT GAATTCTATGCAGTCTAATGATTACCGTG3’；

P2r：5’ACAATT GTCGACTTATCACCGTCTTAATCCCCTTC3’；

P3f：5’ACAATT GAATTCTTATGCAGTCTAATGATTACCGTG3’；

P3r：5’ACAATT GTCGACTTATCACCGTCTTAATCCCCTTC3’

引物P1f和P1r中同时引入EcoRI酶切位点(下划线标示)。以P1f和P1r为引物，以黑曲霉9891基因组DNA为模板克隆出去掉信号肽编码序列的菊粉内切酶基因inu9891(SEQ ID NO：1)。扩增出约1.6kp的DNA片段(图5)。PCR产物送上海Genecore公司做序列测定，测定结果见SEQ ID NO：1。(确认序列的PCR产物将与pPIC9连接，构建表达载体1。用于转化巴斯德毕赤酵母GS115)

引物P2f和P2r中分别引入EcoRI和SalI酶切位点(下划线标示)。以P2f和P2r为引物，以黑曲霉9891基因组DNA为模板克隆出去掉信号肽编码序列的菊粉内切酶基因(SEQ ID NO：2)。扩增出约1.6kp的DNA片段(图5)。PCR产物送上海Genecore公司做序列测定，测定结果见SEQ ID NO：2。(确认序列的PCR产物将与pMETαA连接，构建表达载体2。用于转化嗜甲醇毕赤酵母PMAD16)

引物P3f和P3r中分别引入EcoRI和SalI酶切位点(下划线标示)。以P3f和P3r为引物，以黑曲霉9891基因组DNA为模板克隆出去掉信号肽编码序列的菊粉内切酶基因(SEQ ID NO：3)。扩增出约1.6kp的DNA片段(图5)。PCR产物送上海Genecore公司做序列测定，测定结果见SEQ ID NO：3。(确认序列的PCR产物将与pMETαC连接，构建表达载体3。用于转化嗜甲醇毕赤酵母PMAD16)

总结3个PCR产物，发现所钓取的目标基因inu 9891的DNA及其编码的氨基酸产物特征如下(图5和SEQ ID NO：4)：

(1)inu 9891PCR产物(图5)约1.6kb。分析测序结果资料(序列1，2，3，4)：去除N端23AA信号肽序列inu 9891的最大ORF 1485bp，编码 495AA，蛋白MW5 3.44kDa。inu9891碱基频率A24％，C27％，G28％，T22％，G+Cmol％54.73％，密码子第三碱基G+C59.7％；

(2)同源性分析发现：与A.niger(Ohta K.，et al.，1998)，A.ficuum(Uhm，T.，etal.，1998)inu同源性约94％；与青霉来源菊粉内切酶基因(Onodera S.，Murakami T.，Ito H.et al.，1996)的同源性67％(图6和表2)；而与细菌来源菊粉内切酶基因和酵母来源菊粉外切酶基因同源性均很低；分析认为该基因为新的真菌菊粉内切酶基因；

表2.4种菊粉内切酶基因序列同源性分析结果

Sequences pair    Aligned score(％)    Sequences pair   Aligned score(％)

Sequences(1:2)          94             Sequences(2:3)          99

Sequences(1:3)          94             Sequences(2:4)          66

Sequences(1:4)          65             Sequences(3:4)          66

(3)保守序列

5个beta-呋喃糖苷酶保守序列全部存在在inu 9891编码的AA序列中：- WMNEPNG-位于N端18--24AA。其他4个保守序列分别位于32-37AA( WHLFFO)，50-55AA( WGHATS)，153-158AA( RDPKVF)和211-213AA( EVP)；C端447-451AA保守序列- SVDLF-，其他inu相同区域序列- SVEVF-。Glu--21和Glu-211为2个催化活性基团。

(4)糖基化位点分析

以巴斯德毕赤酵母GS115和嗜甲醇毕赤酵母PMAD16分泌修饰特征分析发现有：4个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)：39-41AA，87-89AA，188-190AA，350-352AA。

                              实施例3

用于转化巴斯德毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)的酵母重组表达载体pPIC9-1构建

将上述获得的不带有原信号肽编码序列的inu9891(SEQ ID NO：I)两端经EcoRI酶切后回收转化片段。此片段与EcoRI酶切的pPIC9载体(Invitrogen公司)连接得到pPIC9-1(图7)。DNA片段用QIAgene公司PCR Purification Kit和GelExtraction Kit回收，酶切，连接和转化等实验程序共同参照《分子克隆实验指南》3版(中文译本，科学出版社，2002年)和所购买相关试剂的说明进行。

琼脂糖电泳显示pPIC9-1经过SnaBI线性化处理后片段约9.7kb大小(图8)，与设计大小吻合。因pPIC9中在2392bp和5622bp有BglII限制性酶切位点，而在菊粉内切酶基因上无此切点，所以该重组质粒经BglII酶切后电泳出现约3.2kb和约6.5kb(pPIC9-11)两片段(图8和9)，inu9891和后续表达元件位于6.5kb的pPIC9-11大片段上，而抗性标记因子位于3.2kb小片段上，后续工作无须此标记而又无其他表达元件，因此在此丢弃此片段并不影响以后的工作；从图8和9可以看出，重组质粒长度符合理论值。序列测定结果(SEQ ID NO：5)表明，整个开放阅读框系列完全正确。

酵母重组表达载体pPIC9-1的鉴定

以重组质粒为模板，以包含插入片段在内的原始质粒的特异性引物P factorf和PAOX1r做PCR从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。引物序列为：Pfactorf：5’TACTATTGCCA GCATT GCTGC3’；PAOX1r：5’CAAATGGCATTCTGACATCC3’，所得PCR产物序列(图13)长1737bp。AA序列上分析有4个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意AA)，与出发菌株黑曲霉9891原始基因序列以及其他特征一致。总的结论验证结论是：inu ENDO插入位点、方向和序列正确(图8，9，SEQ ID NO：5)；pPIC9-1→BglII→pPIC9-11→ 3.2kb和6.5kb，与设计吻合(图9)；总的结论验证结论是：inu ENDO插入位点、方向和序列正确。

                          实施例4

用于转化 嗜甲醇毕赤酵母 PMDA16的酵母重组表达载体pMETαA-2的构建

将不带有原信号肽编码序列的inu9891(前述SEQ ID NO：2)经EcoRI和SalI采用双酶切后回收转化片段。此片段于EcoRI和SalI双酶切的pMETαA载体〖Invitrogen公司〗连接，得到pMETαA-2(图10)，DNA片段用QIAgene公司PCR PurificationKit和Gel Extraction Kit回收，酶切，连接和转化等实验程序共同参照《分子克隆实验指南》3版(中文译本，科学出版社，2002年)和所购买相关试剂的说明进行。

电泳显示约9.7kb大小(图11)，与设计大小吻合。因pMETαA中在13bp和5830bp有PacI限制性酶切位点，而在菊粉内切酶基因上无切点，所以该质粒经PacI酶切后，可出现约2.2kb和约7.3kb两片段，inu9891和后续表达元件位于大片段上，而抗性标记因子位于小片段上，后续工作无须此标记而又无其他表达元件，因此在此丢弃此片段并不影响以后的工作；如从图11可以看出，重组质粒长度符合理论值。序列测定结果(SEQ ID NO：6)表明，整个开放阅读框系列完全正确。

酵母重组表达载体pMETαA-2的鉴定

以重组质粒为模板，以包含插入片段在内的原始质粒的特异性引物Pfactorf和PAUG1r做PCR从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。所得PCR产物序列(见图13和SEQ ID NO：6)长1787bp。AA序列上分析有4个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X Pfactorf：5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC3’PAUG1r：5’GAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3’.为任意AA)，与出发菌株黑曲霉9891原始基因序列以及其他特征一致。总的结论验证结论是：inu ENDO插入位点、方向和序列正确(图11，13，SEQ ID NO：6)；Pac I→pMETαA-2→ 2.2kb和 7.5kb(pMETαA-21)，与设计吻合。总的验证结论是：inu ENDO插入位点、方向和序列正确。

                           实施例5

用于转化嗜甲醇毕赤酵母PMDA16的酵母重组表达载体pMETαC-2的构建

将不带有原信号肽编码序列的inu9891(SEQ ID NO：3)经EcoRI和SalI采用双酶切后回收转化片段。此片段于EcoRI和SalI双酶切的pMETαC载体(Invitrogen公司)连接，得到pMETαC-2(图12)，DNA片段用QIAgene公司PCR Purification Kit和Gel Extraction Kit回收，酶切，连接和转化等实验程序共同参照《分子克隆实验指南》3版(中文译本，科学出版社，2002年)和所购买相关试剂的说明进行。

电泳显示约9.7kb大小(图11)，与设计大小吻合。因pMETαC中在13bp和5830bp有PacI限制性酶切位点，而在菊粉内切酶基因上无切点，所以该质粒经PacI酶切后可出现约2.2kb和约7.3kb两片段，inu9891和后续表达元件位于大片段上，而抗性标记因子位于小片段上，后续工作无须此标记而又无其他表达元件，因此在此丢弃。此片段并不影响以后的工作；从图11可以看出，重组质粒长度符合理论值。序列测定结果(SEQ ID NO：7)表明，整个开放阅读框系列完全正确

酵母重组表达载体pMETαC-2的鉴定

以重组质粒为模板，以包含插入片段在内的原始质粒的特异性引物Pfactorf和PAUG1r做PCR从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。所得PCR产物序列(见图11，13和SEQ ID NO：7)长1792bp。AA序列上分析有4个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意AA)，与出发菌株黑曲霉9891原始基因序列以及其他特征一致。总之，inu 9891插入位点、方向和序列正确(图11，13，序列7)，PacI→pMETαC-2→ 2.2kb和7.5kb(pMETαC-21)，与设计吻合；验证结论是：inu ENDO插入位点、方向和序列正确.引物序列为：Pfactorf：5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC3’；PAUG1r：5’GAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3’.

                                实施例6

表达载体pPIC9-1转化宿主酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115和重组酵母筛选

酵母菌株巴斯德毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)，于50ml上YPAD中30℃培养A600＝0.6-1.0，1500g离心收集菌体，用40mlLKD Buffer 30℃保温15min后，离心去上清，用50ml预冷STM Buffer洗二次，离心后菌体用1ml预冷STM Buffer悬浮，取100ul加入1-3ug经PacI线性化重组pPIC9-1，冰浴5min，用电转化仪电击，电击结束后立即加入1ml上YPAD，30℃培养1小时后，离心，沉淀悬浮于200ul1XYNB中，取100ul平铺于固体MD平板上，30℃培养3-4d直到平板上出现转化子，用牙签挑取白色转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2d，在MD生长而在MM上生长不正常或不生长转化子为阳性克隆子。

(不带有原信号肽编码序列的菊粉内切酶基因经EcoRI酶切后以正确的阅读框架克隆到表达载体pPIC9上的酵母α-factor信号肽编码序列之后，得到重组质粒pPIC9-1.)

由于受体酵母巴斯德毕赤酵母GS115组氨酸缺陷型(his4)，而重组载体上带有HIS4基因而无酵母复制起始子，在不加组氨酸的培养基上缺少HIS4基因的菌株无法生长，而HIS4基因整合到酵母染色体上的重组酵母能够生长。另外，外源基因同源重组到酵母染色体上后会破坏受体酵母的酒精氧化酶基因，使它不能利用甲醇作为碳源正常生长，这样，重组子(mut-)在以甲醇作为唯一碳源的MM培养基上就不生长或缓慢生长，而在以葡萄糖为碳源的MD培养基上能正常生长，通过以上双重选择标记非常容易辨认和筛选重组子

                          实施例7

表达载体pMETαA-2转化宿主嗜甲醇毕赤酵母PMAD16和重组酵母筛选

酵母菌株嗜甲醇毕赤酵母PMAD16(Invitrogen公司)，于50ml上YPAD中30℃培养A600＝0.6-1.0，1500g离心收集菌体，用40mlLKD Buffer 30℃保温15min后，离心去上清，用50ml预冷STM Buffer洗二次，离心后菌体用1ml预冷STM Buffer悬浮，取100υl加入1-3υg经PacI线性化重组pMETαA-2，冰浴5min，用电转化仪电击，电击结束后立即加入1mlYPAD，30℃培养1小时后，离心，沉淀悬浮于200υl1XYNB中，取100υl平铺于固体MD平板上，30℃培养3-4天直到平板上出现转化子，用牙签挑取白色转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2d，在MD生长而在MM上生长不正常或不生长转化子为阳性克隆子。

(不带有原信号肽编码序列的菊粉内切酶基因经EcoRI和SalI双酶切后以正确的阅读框架克隆到表达载体pMETαA上的酵母α-factor信号肽编码序列之后，得到重组质粒pMETαA-2.)

重组子筛选原理和方法如下：

由于受体酵母嗜甲醇毕赤酵母PMAD16为腺嘌呤缺陷型(Ade-)，而重组载体上带有ADE2基因而无酵母复制起始子，在不加腺嘌呤的培养基上缺少ADE2基因的菌株呈红色或粉红色菌落，而ADE2基因整合到酵母染色体上的重组酵母呈白色菌落。另外，外源基因同源重组到酵母染色体上后会破坏受体酵母的酒精氧化酶基因，使它不能利用甲醇作为碳源正常生长，这样，重组子(mut-)在以甲醇作为唯一碳源的MM培养基上就不生长或缓慢生长，而在以葡萄糖为碳源的MD培养基上能正常生长，通过以上双重标记性状仅依靠肉眼就非常容易辨认和筛选重组子。

                            实施例8

          菊粉内切酶基因重组酵母分子水平的鉴定

分别以重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891和嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891基因组作为模板，均以inu9891特异性引物P1f：’ACAATTGAATTCATGCAGTCTAATGATTACCGTC3’；P1r：5’ACTCGAGAATTCTTATCACCGTCTTAATCCCCTTC 3’做PCR，测序结果(图14)：与原始供体基因序列完全一样。

                           实施例9

                  重组酵母的培养和诱导表达

重组酵母于25mlBMDY培养基中，于30℃剧烈振荡培养16-18h后至饱和状态(A600＝10-20)，离心收集菌体，加入2.5mlBMMY培养基30℃继续培养(每24h添加甲醇至终浓度为0.5％)。

发酵罐水平诱导表达研究：

(1)斜面培养基(g/l)：10g酵母提取物(Oxoid产品)，20g胰蛋白胨(Oxoid产品)，10g葡萄糖；装量3ml/15ml试管。121℃灭菌20分钟，冷却备用。

(2)三角瓶种子培养基I(g/l)：溶解10g酵母提取物(Oxoid产品)和20g胰蛋白胨(Oxoid产品)在700ml水中，121℃灭菌20分钟，冷却到20℃左右依次加入100ml过滤除菌的1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)，100ml过滤除菌的13.4％YNB，100ml过滤除菌的10％甘油，2ml过滤除菌的0.02％生物素，100ml过滤除菌的20％葡萄糖；装量50ml/250ml三角瓶。121℃灭菌20分钟，冷却备用。

(3)三角瓶种子培养基II(g/l)：10g酵母提取物(Oxoid产品)，20g胰蛋白胨(Oxoid产品)，10g葡萄糖；装量50ml/250ml三角瓶。121℃灭菌20分钟，冷却备用。

(4)7升发酵罐(DF Bio-2000)基础盐培养基I(每升)：26.7ml 85％H₃PO₄，0.93gCaSO₄.2H₂O，18.2gK₂SO₄，14.9gMgSO₄.7H₂O，4.13gKOH，40g甘油.培养基初始pH1-1.5，用30％氨水调节至pH5左右，每升使用氨水的量大约为30-40ml左右；对于7升罐配该基础培养基3升。

(5)7升发酵罐(DF Bio-2000)基础盐培养基II(每升)：50gNH₄H₂PO₄，0.40gCaSO₄.2H₂O，20.0gK₂SO₄，15.0gMgSO₄.7H₂O，1.50gKOH，45g葡萄糖.培养基初始pH4.2-4.3；接种时无须再调节培养基pH值；对于7升罐配该基础培养基3升。

(6)微量元素培养基溶液PMT1(每升)：6gCuSO₄.5H₂O，0.08gKI，3gMnSO₄.H₂O，0.2gNaMoO₄.2H₂O，0.2gH₃BO₃，0.5gCaSO₄.2H₂O，20gZnCl₂，65gFeSO₄.7H₂O，0.2gBiotin，5mlH₂SO₄，过滤除菌，保存于4-10℃冰箱，专门用于补加到基础盐培养基和其它补料成分之中。基础培养基加4.8mL/L，补料使用时加12mL/L；

(7)微量元素培养基溶液PMT1-1(每升)：6gCuSO₄.5H₂O，0.08gKI，3gMnSO₄.H₂O，0.2gNaMoO₄.2H₂O，0.2gH₃BO₃，20gZnCl₂，0.50gCoCl₂，65gFeSO₄.7H₂O，0.2gBiotin，2mlH₂SO₄，过滤除菌，保存于4-10℃冰箱，专门用于补加到基础盐培养基和其它补料成分之中。基础培养基加4.8mL/L，补料使用时加12mL/L；

(8)50％甘油，121℃灭菌20分钟，备用；

(9)25％葡萄糖，105℃灭菌20分钟，备用；

(10)50％甘油，121℃灭菌20分钟，冷却后等量加100％甲醇；

(11)25％葡萄糖，105℃灭菌20分钟，冷却后加1/8V的100％甲醇；

(12)100％甲醇，做产酶诱导培养基使用；

(13)主要发酵参数：见工艺流程图。

(14)主要发酵工艺：

上7升自动控制发酵罐(Eastbio-2000)表达基因工程酵母。.

种子液准备：解冻甘油种子(1环)，制备斜面种子，30℃，72小时，将其接种到摇瓶种子液250ml，30℃，260--280r/min，24小时，

1，第1生长阶段：3.0L基础盐培养基配制，放置7L发酵罐，pH4.25，30℃，450--800r/min，24小时，pO₂＞＝30％；

2，第2生长阶段：

发酵罐，约在EPT14-28h，pO₂缓慢下降之后突然上升，启动补葡萄糖，30℃，4--6h，pO₂＞30％通气：6-9l/min；转速：800r/min，pH4.3

3，生长与诱导混合培养阶段I：

葡萄糖(25％)+甲醇(100％)混合料补加，6h，→发酵罐

通气：6-9l/min；转速：800r/min，30℃，↓调控pH4.3，pO₂＞30％

4，100％甲醇诱导阶段：

补料流量：由本阶段第1h1ml/h/l逐渐增加到第3hml/h/l，保持稳定到发酵结束。EPT 84，100h，pH4.3，通气：6-9l/min；转速：800r/min，↓30℃，调控pH4.3，pO₂＞30％

5，发酵产物分离与后处理阶段：发酵酶液与菌体离心分离酶制剂后处理。

                               实施例10

          摇瓶水平上，菊粉内切酶基因重组酵母功能性检测

1.摇瓶水平上。基因重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891功能性检测

在试管水平上，对50多个转化子进行表达初筛，得到活性最高的前6个菌株，产酶活性比摇瓶水平上出发菌株产酶水平高6.1倍(以蔗糖作底物)-13.5倍(以蔗糖作底物)(表3)，提高幅度显著。依据该表达系统的高耗氧和对生物量依赖性高的特性，预期上发酵罐加大通风量后表达水平将进一步提高。

表3.工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891表达( 试管水平)异源蛋白质功能性测定

Recombiant No    Activity，U/ml                +/--Donor strain at the peak time，％

                 3％Sucrose       3％Inulin       3％Sucrose      3％Inulin

1) I1-04         47.09            16.3            9.0             5.9

2) I1-18         35.56            ---             6.8             ---

3) I1-27         64.66            19.7            12.4            7.2

4) I1-30         37.71            ---             7.2             ---

5) I2-32         40.95            ---             7.8             ---

6) I3-38         75.97            16.9            14.5            6.2

Original strain  5.23             2.75            1.0             1.0

2.摇瓶水平上，基因重组酵母嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891功能性检测

在试管水平上，对300多个转化子进行表达初筛，得到活性最高的前12个菌株，产酶活性比比摇瓶水平上的出发菌株的产酶水平高5倍(菊糖作底物)--84倍(蔗糖作底物)(表4)，提高幅度显著。依据该表达系统的高耗氧和对生物量依赖性高的特性，预期上发酵罐加大通风量后表达水平将进一步提高。至于转化子和出发菌株分泌酶的性质则显示差异不大(表5)。

表4.工程菌株嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891表达( 试管水平)酶活性测定

Recombiant No       Activity，U/ml    +/--Donor strain at the same time，％

                 3％Sucrose  3％Inulin    3％Sucrose          3％Inulin

1)  I3-50        213.4       6.3          84.4                3.2

2)  I3-26        203.7       ---          80.5                ---

3)  I3-37        188.2       9.7          74.3                5.5

4)  I3-14        187.2       ---          73.9                ---

5)  I3-43        182.0       ---          71.8                ---

6)  I3-41        173.2       6.9          68.3                3.6

7)  I3-35        172.9       10.5         68.2                6.0

8)  I2-07        166.6       10.0         65.6                5.7

9)  0-11         161.3       ---          63.5                ---

10) 0-17         151.1       ---          59.4                ---

11) 0-9          109.2       ---          42.7                ---

12) 0-16         103.7       ---          40.5                ---

Original strain  2.5         1.5          1.0                 1.0

表5.出发菌株黑曲霉9891与重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891和嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891表达酶的性质比较

                     A.niger 9891    GS115/9891    PMAD16/9891

最适温度，℃             55              50           55

最适pH                   5.5             5.5          5.5

MW，kDa                  53.4            59           59

脱糖基化MW，kD           --              54           54

糖基化位点               --              4

                          实施例11

发酵罐(7升)水平上，菊粉内切酶基因重组酵母功能性检测

一.菊粉内切酶基因重组酵母表达产物的酶学性质研究

(1)菊粉内切酶SDS-PAGE

工程菌株巴斯德毕赤酵母/9891 I1-04号在产酶高峰达到的酶蛋白质分泌量：根据G-250反应显色液在595nm比色测定结果该重组织酵母分泌的蛋白质量为2.15mg/mL(发酵液)(照片1)，粗酶发酵液中杂蛋白相对较少，MW约59kD，脱糖基化处理后的菊粉内切酶蛋白SDS-PAGE电泳图谱(照片2)显示MW 5.3kD，糖基化增加酶蛋白MW约12％.(照片1，2)

工程菌株嗜甲醇毕赤酵母/9891 I3-50号在产酶高峰达到的酶蛋白质分泌量：根据G-250反应显色液在595nm比色测定结果该重组织酵母分泌的蛋白质量为0.575mg/mL(发酵液)(照片3)，粗酶发酵液中杂蛋白相对较少，MW约59kD，脱糖基化处理后的菊粉内切酶蛋白SDS-PAGE电泳图谱(照片2)显示MW5.3kD，糖基化增加酶蛋白MW约12％，与巴斯德毕赤酵母/9891 I1-04特性相同(照片2).

(2)酶反应活性的pH适应性范围

工程菌株巴斯德毕赤酵母I1-04号分泌酶反应的pH适宜性范围如图15，最适宜pH为5.6，在pH小于5或者大于6的范围内均不好；工程菌株嗜甲醇毕赤酵母I3-50号分泌酶反应的pH适宜性范围如图16，最适宜pH为5.5，在pH小于4.5或者大于5.5的范围内均不好。

(3)酶反应活性的温度适应性范围(以3％菊粉为底物，10ul酶液，稀释3倍，图17，18)

工程菌株巴斯德毕赤酵母I1-04号分泌酶反应的温度适宜性范围如图15，最适宜温度为50℃，在温度低于40℃或者高于60℃的范围内均不好；工程菌株嗜甲醇毕赤酵母I3-50号分泌酶反应的最适宜温度为55℃，在温度低于40℃或者高于60℃的范围内均不好。总的讲，工程菌株巴斯德毕赤酵母I1-04号和工程菌株嗜甲醇毕赤酵母I3-50号所分泌酶的基本性质与出发菌株无明显差异(表5，图15--18)。

二.工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891产酶曲线

工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891产酶发酵的主要工艺见图19.在7LEastbio-2000实验发酵罐上表达巴斯德毕赤酵母GS115/9891的产酶高峰时间为诱导60h和48h(EFT78h和90h)，分别为1501.4IU/ml(蔗糖为底物)和291.1IU/ml(菊糖为底物)，生物量分别为184g/L(FW)和194g/L(FW)，最高产酶水平比基因供体菌株高约273和105倍，比2001年报道的产黑曲霉菊粉内切酶的多拷贝重组酿酒酵母表达的国际最高水平(菊糖为底物)27.9IU/ml(Park，S.，et al.，2001)高9.4倍，时间提前3d；巴斯德毕赤酵母典型表达系统具有过长诱导时间(EFT144-188h)和过高细胞密度(＞400g/L(FW))的表达特征，这同时也是该表达系统的两大制约因素，过长EFT意味着过高表观发酵成本(发酵物料和物耗成本)和更大染菌风险；高密度细胞培养(＞400g/L(FW))条件下能够获得的酶液实际不到发酵液总容积50％，它至少掩盖着三个弊端----一是高生物量与低容量液体是密切关联的，而分泌表达的产物主要存在于液体之中，生物量越大说明能够得到得到的液体产物越少，二是生物量越大说明单个细胞分泌表达水平越低，三是生物量越高表明菌液分离难度越大成本越高。因此，能够在EFT 100h之内、生物量在200g/L(FW)以下达到表达高峰所带来的技术进步和效益是显而易见的(表6，图20)。

表6.工程菌株巴斯德毕赤酵母GS115/9891产酶曲线

培养    生物量，Biomass(g/l，FW       诱导时间    酶活性Activity(U/ml)

时间    after centrifugation，via     Induction   蔗糖作底物    菊糖作底物

t/h     5000g，10minutes)             time，h

0      10                             0            --

48     80                             12           1124.5        277.4

60     157                            24           1171.9        282.2

72     184                            36           1375.8        285.5

84     194                            48           1327.3        291.1

96     220                            60           1501.4        273.1

108    282                            72           1497.2        287.6

120    290                            84           1485.6        279.8

三.重组酵母发酵产菊粉内切酶水解菊粉生产菊粉寡糖的初步结果

图21显示重组酵母发酵产菊粉内切酶水解菊粉生产菊粉寡糖初步结果的离子色谱图谱。显然，酶对菊粉的水解能够有效减少长链菊粉分子，和相应增加短链菊粉分子。

                                序列表

SEQ ID NO：1(for pPIC9-1)：PCR inu9891 DNA 1560 bp to ligate pPIC9 from Aspergillus niger 9891with primer P1f and P1r sharing both EcoRI ends；

组成373 A；412 C；433 G；342 T；2 OTHER

百分数：24％ A；26％ C；28％ G；22％ T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：482.86    dsDNA：963.0

   1    ACAATT GAAT TCATGCAGTC TAATGATTAC CGTCCTTCAT ACCACTTCAC ACCGGACCAG

  61    TACTGGATGA ACGAGCCAAA CGGCCTGATT AAGATCGGAT CCACCTGGCA CCTGTTCTTT

 121    CAACACAATC CGACGGCCAA TGTATGGGGC AACATATGCT GGGGGCACGC TACGAGCACC

 181    GATCTGATGC ACTGGGCACA CAAACCCACT GCCATTGCGG ATGAGAACGG AGTCGAAGCG

 241    TTTACCGGTA CAGCCTATTA TGATCCAAAC AATGCCTCTG GCCTTGGGGA TTCGGCAAAC

 301    CCACCCTACC TGGCCTGGTT CACAGGTTAT ACCGTTTCAA GCCAAACACA GGACCAGCGC

 361    CTGGCTTTCA GTGTCGATAA CGGGGCGACG TGGACCAAAT TTCAAGGCAA CCCCATCATA

 421    TCAACAAGCC AGGAAGCACC ACATGATATA ACGGGCGGCC TCGAGAGTCG GGATCCAAAG

 481    GTATTCTTCC ATCGCCAATC GGGGAACTGG ATCATGGTTC TCGCCCATGG CGGGCAGGAC

 541    AAGCTGTCTT TCTGGACGTC TGCAGACACC ATAAACTGGA CATGGCAGAG TGACCTGAAG

 601    TCCACCTCGA TCAACGGCCT ATCGTCCGAT ATTACAGGGT GGGAAGTCCC CGACATGTTT

 661    GAACTCCCGG TTGAAGGCAC TGAGGAGACC ACGTGGGTGG TGATGATGAC GCCGGCTGAA

 721    GGATCCCCTG CCGGTGGTAA CGGGGTCTTA GCTATCACCG GTTCTTTTGA CGGGAAAAGT

 781    TTTACGGCAG ATCCCGTCGA TGCTTCGACC ATGTGGCTGG ACAATGGGCG TGATTTCGAT

 841    GGCGCTCTGA GCTGGGTGAA CGTGCCTGCG TCCGATGGAC GGCGGATTAT CGCCGCCGTC

 901    ATGAATAGCT ACGGTTCCAA CCCGCCTACA ACCACCTGGA AAGGGATGCT CTCCTTTCCC

 961    CGGACGCTGT CGCTCAAGAA AGTTGGGACG CAGCAGCACT TTGTTCAACA GCCGATCACA

1021    GAGTTGGACA CAATTAGTAC CAGTCTGCAA ACACTAGAAA ACCAGACCAT TACCCCTGGC

1081    CAAACATTGC TATCATCGAT TCGGGGAACT GTCCTCGATG TTCGAGTTGC TTTCTACCCT

1141    GATGCTGGCT CGGTTCTGTC CCTCGCCGTC CGAAAGGGTC GTTCGGAGCA AACAGTCATT

1201    AAGGACACCC AGTCAGATGC CACATTGTCG GTTGATCGAA CAGAGAGTGG AGATACCTCG

1261    TATGACCCGG CCGCAGGTGG CGTCCATACC GCCAAGTTGG AAGAGGACGA CACCGGACTG

1321    GTTTCCATCC GGGTGTTGGT GGATACGTGT TCTGTAGACC TTTTTGGCGG ACAAGGAGAA

1381    GCCGTCATTT CCGACCTCAT CTTCCCGAGT GACAGTTCTG ATGGCCTGGC CTTGGAGGTA

1441    ACTGGCGGAA ATGCAGTGCT GCAGTCGGTG GACGTGCGGA GTCTTTCACT TGAA TGAAGG

1501    AGGCGTGGGA GGCTGCCAGA CGGGG GAAGG GGATTAAGAC GGTGATAAGA ATTCAATTGT

SEQ ID NO：2(for pMETαA-2)：PCR inu9891 DNA 1560 bp to ligate pMETαA from Aspergillus

niger9891 with primer P2f and P2r with primer EcoRI and Sal

组成371  A；414  C；435  G；340  T；2 OTHER

百分数：24％  A；27％  C；28％  G；22％  T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：482.86    dsDNA：963.0

1        ACAATTGAAT TCATGCAGTC TAATGATTAC CGTCCTTCAT ACCACTTCAC ACCGGACCAG

61      TACTGGATGA ACGAGCCAAA CGGCCTGATT AAGATCGGAT CCACCTGGCA CCTGTTCTTT

121     CAACACAATC CGACGGCCAA TGTATGGGGC AACATATGCT GGGGGCACGC TACGAGCACC

181     GATCTGATGC ACTGGGCACA CAAACCCACT GCCATTGCGG ATGAGAACGG AGTCGAAGCG

241     TTTACCGGTA CAGCCTATTA TGATCCAAAC AATGCCTCTG GCCTTGGGGA TTCGGCAAAC

301     CCACCCTACC TGGCCTGGTT CACAGGTTAT ACCGTTTCAA GCCAAACACA GGACCAGCGC

361     CTGGCTTTCA GTGTCGATAA CGGGGCGACG TGGACCAAAT TTCAAGGCAA CCCCATCATA

421     TCAACAAGCC AGGAAGCACC ACATGATATA ACGGGCGGCC TCGAGAGTCG GGATCCAAAG

481     GTATTCTTCC ATCGCCAATC GGGGAACTGG ATCATGGTTC TCGCCCATGG CGGGCAGGAC

541     AAGCTGTCTT TCTGGACGTC TGCAGACACC ATAAACTGGA CATGGCAGAG TGACCTGAAG

601     TCCACCTCGA TCAACGGCCT ATCGTCCGAT ATTACAGGGT GGGAAGTCCC CGACATGTTT

661     GAACTCCCGG TTGAAGGCAC TGAGGAGACC ACGTGGGTGG TGATGATGAC GCCGGCTGAA

721     GGATCCCCTG CCGGTGGTAA CGGGGTCTTA GCTATCACCG GTTCTTTTGA CGGGAAAAGT

781     TTTACGGCAG ATCCCGTCGA TGCTTCGACC ATGTGGCTGG ACAATGGGCG TGATTTCGAT

841     GGCGCTCTGA GCTGGGTGAA CGTGCCTGCG TCCGATGGAC GGCGGATTAT CGCCGCCGTC

901     ATGAATAGCT ACGGTTCCAA CCCGCCTACA ACCACCTGGA AAGGGATGCT CTCCTTTCCC

961     CGGACGCTGT CGCTCAAGAA AGTTGGGACG CAGCAGCACT TTGTTCAACA GCCGATCACA

1021    GAGTTGGACA CAATTAGTAC CAGTCTGCAA ACACTAGAAA ACCAGACCAT TACCCCTGGC

1081    CAAACATTGC TATCATCGAT TCGGGGAACT GTCCTCGATG TTCGAGTTGC TTTCTACCCT

1141    GATGCTGGCT CGGTTCTGTC CCTCGCCGTC CGAAAGGGTC GTTCGGAGCA AACAGTCATT

1201    AAGGACACCC AGTCAGATGC CACATTGTCG GTTGATCGAA CAGAGAGTGG AGATACCTCG

1261    TATGACCCGG CCGCAGGTGG CGTCCATACC GCCAAGTTGG AAGAGGACGA CACCGGACTG

1321    GTTTCCATCC GGGTGTTGGT GGATACGTGT TCTGTAGACC TTTTTGGCGG ACAAGGAGAA

1381    GCCGTCATTT CCGACCTCAT CTTCCCGAGT GACAGTTCTG ATGGCCTGGC CTTGGAGGTA

1441    ACTGGCGGAA ATGCAGTGCT GCAGTCGGTG GACGTGCGGA GTCTTTCACT TGAATGAAGG

1501    AGGCGTGGGA GGCTGCCAGA CGGGGGAAGG GGATTAAGAC GGTGATAAGT CGACTCGAGT

1502    AGGCGTGGGA GGCTGCCAGA CGGGGGAAGG GGATTAAGAC GG TGATAAGT CGACTCGAGT

SEQ ID NO：3(for pMETαC-2)：PCR inu9891 DNA 1561bp to ligate pMETαC from Aspergillus

niger 9891 with primer P3fand P3r with primer EcoRI and Sal；

组成371  A；414  C；435  G；341  T；2 OTHER

百分数：  24％  A；26％  C；28％  G；22％  T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：483.17  dsDNA：963.7

1        ACAATTGAAT TCT ATGCAGT CTAATGATTA CCGTCCTTCA TACCACTTCA CACCGGACCA

61      GTACTGGATG AACGAGCCAA ACGGCCTGAT TAAGATCGGA TCCACCTGGC ACCTGTTCTT

121     TCAACACAAT CCGACGGCCA ATGTATGGGG CAACATATGC TGGGGGCACG CTACGAGCAC

181     CGATCTGATG CACTGGGCAC ACAAACCCAC TGCCATTGCG GATGAGAACG GAGTCGAAGC

241     GTTTACCGGT ACAGCCTATT ATGATCCAAA CAATGCCTCT GGCCTTGGGG ATTCGGCAAA

301     CCCACCCTAC CTGGCCTGGT TCACAGGTTA TACCGTTTCA AGCCAAACAC AGGACCAGCG

361     CCTGGCTTTC AGTGTCGATA ACGGGGCGAC GTGGACCAAA TTTCAAGGCA ACCCCATCAT

421     ATCAACAAGC CAGGAAGCAC CACATGATAT AACGGGCGGC CTCGAGAGTC GGGATCCAAA

481     GGTATTCTTC CATCGCCAAT CGGGGAACTG GATCATGGTT CTCGCCCATG GCGGGCAGGA

541     CAAGCTGTCT TTCTGGACGT CTGCAGACAC CATAAACTGG ACATGGCAGA GTGACCTGAA

601     GTCCACCTCG ATCAACGGCC TATCGTCCGA TATTACAGGG TGGGAAGTCC CCGACATGTT

661     TGAACTCCCG GTTGAAGGCA CTGAGGAGAC CACGTGGGTG GTGATGATGA CGCCGGCTGA

721     AGGATCCCCT GCCGGTGGTA ACGGGGTCTT AGCTATCACC GGTTCTTTTG ACGGGAAAAG

781     TTTTACGGCA GATCCCGTCG ATGCTTCGAC CATGTGGCTG GACAATGGGC GTGATTTCGA

841     TGGCGCTCTG AGCTGGGTGA ACGTGCCTGC GTCCGATGGA CGGCGGATTA TCGCCGCCGT

901     CATGAATAGC TACGGTTCCA ACCCGCCTAC AACCACCTGG AAAGGGATGC TCTCCTTTCC

961     CCGGACGCTG TCGCTCAAGA AAGTTGGGAC GCAGCAGCAC TTTGTTCAAC AGCCGATCAC

1021    AGAGTTGGAC ACAATTAGTA CCAGTCTGCA AACACTAGAA AACCAGACCA TTACCCCTGG

1081    CCAAACATTG CTATCATCGA TTCGGGGAAC TGTCCTCGAT GTTCGAGTTG CTTTCTACCC

1141    TGATGCTGGC TCGGTTCTGT CCCTCGCCGT CCGAAAGGGT CGTTCGGAGC AAACAGTCAT

1201    TAAGGACACC CAGTCAGATG CCACATTGTC GGTTGATCGA ACAGAGAGTG GAGATACCTC

1261    GTATGACCCG GCCGCAGGTG GCGTCCATAC CGCCAAGTTG GAAGAGGACG ACACCGGACT

1321    GGTTTCCATC CGGGTGTTGG TGGATACGTG TTCTGTAGAC CTTTTTGGCG GACAAGGAGA

1381    AGCCGTCATT TCCGACCTCA TCTTCCCGAG TGACAGTTCT GATGGCCTGG CCTTGGAGGT

1441    AACTGGCGGA AATGCAGTGC TGCAGTCGGT GGACGTGCGG AGTCTTTCAC TTGAATGAAG

1501    GAGGCGTGGG AGGCTGCCAG ACGGGGGAAG GGGATTAAGA CGG TGATAAG TCGACTCGAG

1561     T

SEQ ID NO：4.靶DNA inu 9891的三个PCR片段和其氨基酸的特性

(Max ORF：1-1482，494 AA，MW＝5.34kD)

1          ATGCAGTCTAATGATTACCGTCCTTCATACCACTTCACACCGGACCAGTACTGGATGAAC

1           M  Q  S  N  D  Y  R  P  S  Y  H  F  T  P  D  Q  Y   W  M  N

61         GAGCCAAACGGCCTGATTAAGATCGGATCCACCTGGCACCTGTTCTTTCAACACAATCCG

21           E  P  N  G  L  I  K  I  G  S  T   W  H  L  F  F  Q  H   N  P

121        ACGGCCAATGTATGGGGCAACATATGCTGGGGGCACGCTACGAGCACCGATCTGATGCAC

41           T  A  N  V  W  G  N  I  C  W  G  H  A  T  S  T  D  L  M  H

181        TGGGCACACAAACCCACTGCCATTGCGGATGAGAACGGAGTCGAAGCGTTTACCGGTACA

61          W  A  H  K  P  T  A  I  A  D  E  N  G  V  E  A  F  T  G  T

241        GCCTATTATGATCCAAACAATGCCTCTGGCCTTGGGGATTCGGCAAACCCACCCTACCTG

81          A  Y  Y  D  P  N   N  A  S  G  L  G  D  S  A  N  P  P  Y  L

301        GCCTGGTTCACAGGTTATACCGTTTCAAGCCAAACACAGGACCAG CGCCTGGCTTTCAGT

101         A  W  F  T  G  Y  T  V  S  S  Q  T  Q  D  Q  R  L  A  F  S

361        GTCGATAACGGGGCGACGTGGACCAAATTTCAAGGCAACCCCATCATATCAACAAGCCAG

121         V  D  N  G  A  T  W  T  K  F  Q  G  N  P  I  I  S  T  S  Q

421        GAAGCACCACATGATATAACGGGCGGCCTCGAGAGT CGGGATCCAAAGGTATTCTTCCAT

141         E  A  P  H  D  I  T  G  G  L  E  S   R  D  P  K  V  F  F  H

481         CGCCAATCGGGGAACTGGATCATGGTTCTCGCCCATGGCGGGCAGGACAAGCTGTCTTTC

161         R  Q  S  G  N  W  I  M  V  L  A  H  G  G  Q  D  K  L  S  F

541        TGGACGTCTGCAGACACCATAAACTGGACATGGCAGAGTGACCTGAAGTCCACCTCGATC

181         W  T  S  A  D  T  I   N  W  T  W  Q  S  D  L  K  S  T  S  I

601        AACGGCCTATCGTCCGATATTACAGGGTGGGAAGTCCCCGACATGTTTGAACTCCCGGTT

201         N  G  L  S  S  D  I  T  G  W   E  V  P  D  M  F  E  L  P  V

661        GAAGGCACTGAGGAGACCACGTGGGTGGTGATGATGACGCCGGCTGAAGGATCCCCTGCC

221         E  G  T  E  E  T  T  W  V  V  M  M  T  P  A  E  G  S  P  A

721        GGTGGTAACGGGGTCTTAGCTATCACCGGTTCTTTTGACGGGAAAAGTTTTACGGCAGAT

241         G  G  N  G  V  L  A  I  T  G  S  F  D  G  K  S  F  T  A  D

781        CCCGTCGATGCTTCGACCATGTGGCTGGACAATGGGCGTGATTTCGATGGCGCTCTGAGC

261         P  V  D  A  S  T  M  W  L  D  N  G  R  D  F  D  G  A  L  S

841        TGGGTGAACGTGCCTGCGTCCGATGGA CGGCGGATTATCGCCGCCGTCATGAATAGCTAC

281         W  V  N  V  P  A  S  D  G  R  R  I  I  A  A  V  M  N  S  Y

901        GGTTCCAACCCGCCTACAACCACCTGGAAAGGGATGCTCTCCTTTCCC CGGACGCTGTCG

301         G  S  N  P  P  T  T  T  W  K  G  M  L  S  F  P  R  T  L  S

961        CTCAAGAAAGTTGGGACGCAGCAGCACTTTGTTCAACAGCCGATCACAGAGTTGGACACA

321         L  K  K  V  G  T  Q  Q  H  F  V  Q  Q  P  I  T  E  L  D  T

1021       ATTAGTACCAGTCTGCAAACACTAGAAAACCAGACCATTACCCCTGGCCAAACATTGCTA

341         I  S  T  S  L  Q  T  L  E   N  Q  T  I  T  P  G  Q  T  L  L

1081       TCATCGATT CGGGGAACTGTCCTCGATGTTCGAGTTGCTTTCTACCCTGATGCTGGCTCG

361         S  S  I  R  G  T  V  L  D  V  R  V  A  F  Y  P  D  A  G  S

1141       GTTCTGTCCCTCGCCGTCCGAAAGGGTCGTTCGGAGCAAACAGTCATTAAGGACACCCAG

381         V  L  S  L  A  V  R  K  G  R  S  E  Q  T  V  I  K  D  T  Q

1201       TCAGATGCCACATTGTCGGTTGATCGAACAGAGAGTGGAGATACCTCGTATGACCCGGCC

401         S  D  A  T  L  S  V  D  R  T  E  S  G  D  T  S  Y  D  P  A

1261       GCAGGTGGCGTCCATACCGCCAAGTTGGAAGAGGACGACACCGGACTGGTTTCCATC GGG

421         A  G  G  V  H  T  A  K  L  E  E  D  D  T  G  L  V  S  I  R

1321       GTGTTGGTGGATACGTGTTCTGTAGACCTTTTTGGCGGACAAGGAGAAGCCGTCATTTCC

441         V  L  V  D  T  C   S  V  D  L  F  G  G  Q  G  E  A  V  I  S

1381       GACCTCATCTTCCCGAGTGACAGTTCTGATGGCCTGGCCTTGGAGGTAACTGGCGGAAAT

461         D  L  I  F  P  S  D  S  S  D  G  L  A  L  E  V  T  G  G  N

1441       GCAGTGCTGCAGTCGGTGGACGTG CGGAGTCTTTCACTTGAATGAAGGAGGCGTGGGAGG

481         A  V  L  Q  S  V  D  V  R  S  L  S  L  E  *  R  R  R  G  R

1501       CTGCCAGACGGGGGAAGGGGATTAAGACGGTGA

501         L  P  D  G  G  R  G  L  R  R  *

SEQ ID NO：5：重组pPIC9-1/9891 DNA seq.：1737bp，引物Pfa-factor和Pr3’AOX1；

组成420  A；450  C；481  G；386  T；4 OTHER

百分数：24％  A；26％  C；28％  G；22％  T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：538.34；dsDNA：1073.4

1        TACTATTGCC AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGGGTATCT CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA

61      AGCTTACGTA  GAATTCATGC AGTCTAATGA TTACCGTCCT TCATACCACT TCACACCGGA

121     CCAGTACTGG ATGAACGAGC CAAACGGCCT GATTAAGATC GGATCCACCT GGCACCTGTT

181     CTTTCAACAC AATCCGACGG CCAATGTATG GGGCAACATA TGCTGGGGGC ACGCTACGAG

241     CACCGATCTG ATGCACTGGG CACACAAACC CACTGCCATT GCGGATGAGA ACGGAGTCGA

301     AGCGTTTACC GGTACAGCCT ATTATGATCC AAACAATGCC TCTGGCCTTG GGGATTCGGC

361     AAACCCACCC TACCTGGCCT GGTTCACAGG TTATACCGTT TCAAGCCAAA CACAGGACCA

421     GCGCCTGGCT TTCAGTGTCG ATAACGGGGC GACGTGGACC AAATTTCAAG GCAACCCCAT

481     CATATCAACA AGCCAGGAAG CACCACATGA TATAACGGGC GGCCTCGAGA GTCGGGATCC

541     AAAGGTATTC TTCCATCGCC AATCGGGGAA CTGGATCATG GTTCTCGCCC ATGGCGGGCA

601     GGACAAGCTG TCTTTCTGGA CGTCTGCAGA CACCATAAAC TGGACATGGC AGAGTGACCT

661     GAAGTCCACC TCGATCAACG GCCTATCGTC CGATATTACA GGGTGGGAAG TCCCCGACAT

721     GTTTGAACTC CCGGTTGAAG GCACTGAGGA GACCACGTGG GTGGTGATGA TGACGCCGGC

781     TGAAGGATCC CCTGCCGGTG GTAACGGGGT CTTAGCTATC ACCGGTTCTT TTGACGGGAA

841     AAGTTTTACG GCAGATCCCG TCGATGCTTC GACCATGTGG CTGGACAATG GGCGTGATTT

901     CGATGGCGCT CTGAGCTGGG TGAACGTGCC TGCGTCCGAT GGACGGCGGA TTATCGCCGC

961     CGTCATGAAT AGCTACGGTT CCAACCCGCC TACAACCACC TGGAAAGGGA TGCTCTCCTT

1021    TCCCCGGACG CTGTCGCTCA AGAAAGTTGG GACGCAGCAG CACTTTGTTC AACAGCCGAT

1081    CACAGAGTTG GACACAATTA GTACCAGTCT GCAAACACTA GAAAACCAGA CCATTACCCC

1141    TGGCCAAACA TTGCTATCAT CGATTCGGGG AACTGTCCTC GATGTTCGAG TTGCTTTCTA

1201    CCCTGATGCT GGCTCGGTTC TGTCCCTCGC CGTCCGAAAG GGTCGTTCGG AGCAAACAGT

1261    CATTAAGGAC ACCCAGTCAG ATGCCACATT GTCGGTTGAT CGAACAGAGA GTGGAGATAC

1321    CTCGTATGAC CCGGCCGCAG GTGGCGTCCA TACCGCCAAG TTGGAAGAGG ACGACACCGG

1381    ACTGGTTTCC ATCCGGGTGT TGGTGGATAC GTGTTCTGTA GACCTTTTTG GCGGACAAGG

1441    AGAAGCCGTC ATTTCCGACC TCATCTTCCC GAGTGACAGT TCTGATGGCC TGGCCTTGGA

1501    GGTAACTGGC GGAAATGCAG TGCTGCAGTC GGTGGACGTG CGGAGTCTTT CACTTGAA TG

1561    AAGGAGGCGT GGGAGGCTGC CAGACGGGGG AAGGGGATTA AGACGG TGAT TAGAATTCCC

1621    TAGGGCGGCC GCGAATTAAT TCGCCTTAGA CATGACTGTT CCTCAGTTCA AGTTGGGCAC

1681    TTACGAGAAG ACCGGTCTTG CTAGATTCTA ATCAAGA GGA TGTCAGAATG CCATTTG

SEQ ID NO：6：1787bp；

用EcoRI和SalI消化pMETaA-2，引物Pfafactor和PrAUGl的PCR

组成423  A；469  C；483  G；403  T；0 OTHER

百分数：24％  A；26％  C；27％  G；23％  T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：549.36    dsDNA：1096.2

1        TACTATTGCC AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGGGTATCT CTCGAGAAGA GAGAGGCTGA

61      AGCTG AATTC ATGCAGTCTA ATGATTACCG TCCTTCATAC CACTTCACAC CGGACCAGTA

121     CTGGATGAAC GAGCCAAACG GCCTGATTAA GATCGGATCC ACCTGGCACC TGTTCTTTCA

181     ACACAATCCG ACGGCCAATG TATGGGGCAA CATATGCTGG GGGCACGCTA CGAGCACCGA

241     TCTGATGCAC TGGGCACACA AACCCACTGC CATTGCGGAT GAGAACGGAG TCGAAGCGTT

301     TACCGGTACA GCCTATTATG ATCCAAACAA TGCCTCTGGC CTTGGGGATT CGGCAAACCC

361     ACCCTACCTG GCCTGGTTCA CAGGTTATAC CGTTTCAAGC CAAACACAGG ACCAGCGCCT

421     GGCTTTCAGT GTCGATAACG GGGCGACGTG GACCAAATTT CAAGGCAACC CCATCATATC

481     AACAAGCCAG GAAGCACCAC ATGATATAAC GGGCGGCCTC GAGAGTCGGG ATCCAAAGGT

541     ATTCTTCCAT CGCCAATCGG GGAACTGGAT CATGGTTCTC GCCCATGGCG GGCAGGACAA

601     GCTGTCTTTC TGGACGTCTG CAGACACCAT AAACTGGACA TGGCAGAGTG ACCTGAAGTC

661     CACCTCGATC AACGGCCTAT CGTCCGATAT TACAGGGTGG GAAGTCCCCG ACATGTTTGA

721     ACTCCCGGTT GAAGGCACTG AGGAGACCAC GTGGGTGGTG ATGATGACGC CGGCTGAAGG

781     ATCCCCTGCC GGTGGTAACG GGGTCTTAGC TATCACCGGT TCTTTTGACG GGAAAAGTTT

841     TACGGCAGAT CCCGTCGATG CTTCGACCAT GTGGCTGGAC AATGGGCGTG ATTTCGATGG

901     CGCTCTGAGC TGGGTGAACG TGCCTGCGTC CGATGGACGG CGGATTATCG CCGCCGTCAT

961     GAATAGCTAC GGTTCCAACC CGCCTACAAC CACCTGGAAA GGGATGCTCT CCTTTCCCCG

1021    GACGCTGTCG CTCAAGAAAG TTGGGACGCA GCAGCACTTT GTTCAACAGC CGATCACAGA

1081    GTTGGACACA ATTAGTACCA GTCTGCAAAC ACTAGAAAAC CAGACCATTA CCCCTGGCCA

1141    AACATTGCTA TCATCGATTC GGGGAACTGT CCTCGATGTT CGAGTTGCTT TCTACCCTGA

1201    TGCTGGCTCG GTTCTGTCCC TCGCCGTCCG AAAGGGTCGT TCGGAGCAAA CAGTCATTAA

1261    GGACACCCAG TCAGATGCCA CATTGTCGGT TGATCGAACA GAGAGTGGAG ATACCTCGTA

1321    TGACCCGGCC GCAGGTGGCG TCCATACCGC CAAGTTGGAA GAGGACGACA CCGGACTGGT

1381    TTCCATCCGG GTGTTGGTGG ATACGTGTTC TGTAGACCTT TTTGGCGGAC AAGGAGAAGC

1441    CGTCATTTCC GACCTCATCT TCCCGAGTGA CAGTTCTGAT GGCCTGGCCT TGGAGGTAAC

1501    TGGCGGAAAT GCAGTGCTGC AGTCGGTGGA CGTGCGGAGT CTTTCACTTG AATGAAGGAG

1561    GCGTGGGAGG CTGCCAGACG GGGGAAGGGG ATTAAGACGG  TGATAAGTCG ACCCGCCGGG

1621    CCGCCAGCTT ACTAGTAGGT AAGCCTATCC CTAACCCTCT CCTCGGTCTC GATTCTACGC

1681    GTACCGGTCA TCATCACCAT CACCATTGAT CTAGTATACA ATTCTAGGGC TGCCTGTTTG

1741    GATATTTTTA TAATTTTGAG AGTTT GCCAA CTAATGTTTT TCTCTTC

SEQ ID NO：7：来自于重组pMETaC-2的PCR菊粉内切酶DNA：1792bp；

组成  425  A；470  C；484  G；405  T；2 OTHER

百分数：24％  A；26％  C；27％  G；23％  T；0％OTHER

分子量(kDa)：ssDNA：551.83    dsDNA：1101.1

1         TACTATTGCC AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGGGTATCT CTCGAGAAGA GAGAGGCTGA

61       AGCATCGAT G AATTCT ATGC AGTCTAATGA TTACCGTCCT TCATACCACT TCACACCGGA

121      CCAGTACTGG ATGAACGAGC CAAACGGCCT GATTAAGATC GGATCCACCT GGCACCTGTT

181      CTTTCAACAC AATCCGACGG CCAATGTATG GGGCAACATA TGCTGGGGGC ACGCTACGAG

241      CACCGATCTG ATGCACTGGG CACACAAACC CACTGCCATT GCGGATGAGA ACGGAGTCGA

301      AGCGTTTACC GGTACAGCCT ATTATGATCC AAACAATGCC TCTGGCCTTG GGGATTCGGC

361      AAACCCACCC TACCTGGCCT GGTTCACAGG TTATACCGTT TCAAGCCAAA CACAGGACCA

421      GCGCCTGGCT TTCAGTGTCG ATAACGGGGC GACGTGGACC AAATTTCAAG GCAACCCCAT

481      CATATCAACA AGCCAGGAAG CACCACATGA TATAACGGGC GGCCTCGAGA GTCGGGATCC

541      AAAGGTATTC TTCCATCGCC AATCGGGGAA CTGGATCATG GTTCTCGCCC ATGGCGGGCA

601      GGACAAGCTG TCTTTCTGGA CGTCTGCAGA CACCATAAAC TGGACATGGC AGAGTGACCT

661      GAAGTCCACC TCGATCAACG GCCTATCGTC CGATATTACA GGGTGGGAAG TCCCCGACAT

721      GTTTGAACTC CCGGTTGAAG GCACTGAGGA GACCACGTGG GTGGTGATGA TGACGCCGGC

781      TGAAGGATCC CCTGCCGGTG GTAACGGGGT CTTAGCTATC ACCGGTTCTT TTGACGGGAA

841      AAGTTTTACG GCAGATCCCG TCGATGCTTC GACCATGTGG CTGGACAATG GGCGTGATTT

901      CGATGGCGCT CTGAGCTGGG TGAACGTGCC TGCGTCCGAT GGACGGCGGA TTATCGCCGC

961      CGTCATGAAT AGCTACGGTT CCAACCCGCC TACAACCACC TGGAAAGGGA TGCTCTCCTT

1021     TCCCCGGACG CTGTCGCTCA AGAAAGTTGG GACGCAGCAG CACTTTGTTC AACAGCCGAT

1081     CACAGAGTTG GACACAATTA GTACCAGTCT GCAAACACTA GAAAACCAGA CCATTACCCC

1141     TGGCCAAACA TTGCTATCAT CGATTCGGGG AACTGTCCTC GATGTTCGAG TTGCTTTCTA

1201     CCCTGATGCT GGCTCGGTTC TGTCCCTCGC CGTCCGAAAG GGTCGTTCGG AGCAAACAGT

1261     CATTAAGGAC ACCCAGTCAG ATGCCACATT GTCGGTTGAT CGAACAGAGA GTGGAGATAC

1321     CTCGTATGAC CCGGCCGCAG GTGGCGTCCA TACCGCCAAG TTGGAAGAGG ACGACACCGG

1381     ACTGGTTTCC ATCCGGGTGT TGGTGGATAC GTGTTCTGTA GACCTTTTTG GCGGACAAGG

1441     AGAAGCCGTC ATTTCCGACC TCATCTTCCC GAGTGACAGT TCTGATGGCC TGGCCTTGGA

1501     GGTAACTGGC GGAAATGCAG TGCTGCAGTC GGTGGACGTG CGGAGTCTTT CACTTGAATG

1561     AAGGAGGCGT GGGAGGCTGC CAGACGGGGG AAGGGGATTA AGACGG TGAT AAGTCGACCC

1621     GCCGGGCCGC CAGCTTACTA GTAGGTAAGC CTATCCCTAA CCCTCTCCTC GGTCTCGATT

1681     CTACGCGTAC CGGTCATCAT CACCATCACC ATTGATCTAG TATACAATTC TAGGGCTGCC

1741     TGTTTGGATA TTTTTATAAT TTTGAGAGTT T GCCAACTAA TGTTTTTCTCT TC

Claims (14)

1.一种高产菊粉内切酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)9891 CGMCCNO：0991。

2.一种新的菊粉内切酶基因，从产菊粉内切酶黑曲霉菌株(Aspergillusniger)9891中克隆得到的菊粉内切酶基因inu9891。

3.一种新的菊粉内切酶基因，其序列选自于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

4.一种表达载体，含有不带有原基因信号肽编码序列的权利要求2所述的基因。

5.根据权利要求4所述的载体，其中权利要求2所述的基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115表达载体pPIC9上，得到重组载体pPIC9-1。

6.根据权利要求4所述的载体，其中权利要求2所述的基因插入到嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)PMAD16表达载体pMETαA上，得到重组载体pMETαA-2。

7.根据权利要求4所述的载体，其中权利要求2所述的基因插入到嗜甲醇毕赤酵母PMAD16表达载体pMETαC上，得到重组载体pMETαC-2。

8.含有权利要求2所述的基因的工程菌。

9.根据权利要求8所述的工程菌，它是将权利要求5所述的载体转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891。

10.根据权利要求8所述的工程菌，它是将权利要求6所述的载体转化嗜甲醇毕赤酵母PMAD16得到的重组酵母嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891。

11.一种生产胞外菊粉内切酶的方法，包括将权利要求8所述的工程菌在

培养基中培养，分泌出胞外菊粉内切酶。

12.根据权利要求11所述的方法，其中工程菌是权利要求9中的重组酵母巴斯德毕赤酵母GS115/9891。

13.根据权利要求11所述的方法，其中工程菌是权利要求10中的重组酵母嗜甲醇毕赤酵母PMAD16/9891。

14.根据权利要求11-13任一项所述的方法，其中所述的培养是在YPAD中，于30℃剧烈振荡培养16-18小时后至饱和状态(A600＝10-20)，离心收集菌体，加入BMMY培养基30℃继续培养(每24小时添加甲醇至终浓度为0.5％)。

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