CN107022588B - 利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品工程技术领域，尤其涉及利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖。以本发明提供方法制备低聚果糖中，单糖的含量较低，而寡聚果糖的含量可达总糖的80％。显著高于现有技术制得的寡聚果糖的含量。不仅提高了寡聚果糖的提取效率，还避免了繁复的纯化工艺带来的能源浪费。
Description
技术领域
本发明涉及食品工程技术领域，尤其涉及利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖。
背景技术
菊芋或者菊苣的地下块茎富含菊粉。菊粉是一类果糖通过β-2，1键连接，末端带有一个葡萄糖分子的多聚果糖。菊粉经菊粉内切酶水解，可得到低聚果糖。低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，FOS）是由果糖分子通过b-(2-1)糖苷键链接而成的短或中长链寡糖并且已经被确定为益生元。其进入人体后不能被唾液和消化酶分解，直接通过胃和小肠到达大肠，被大肠内的有益菌主要是双歧杆菌所利用，使双歧杆菌得到大量繁殖，同时产生短链脂肪酸（SCFA）如乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等。抑制肠内沙门氏菌等腐败菌的生长，从而起到防止便秘、降低血脂和胆固醇、促进矿物质的吸收和肠内有毒废物的排除、提高免疫力等一系列作用。而且其本身由于极难被人体吸收，不会使血糖值升高，每克低聚果糖中仅含6.3KJ的热量，故属于低热量难消化、低龋齿性的可溶性膳食纤维。
低聚果糖作为组成组分被发现微量存在于水果，蔬菜，大麦，大蒜，蜂蜜，洋葱，菊苣等等。在最近的几十年中，人们对于低聚果糖的研究越来越多。低聚果糖的产业化生产不到20年历史，但以其低热值及优越的生理功能成为近十年来国际食品市场上广泛流行的功能性食品基料，应用范围多达500余种食品。
目前国内低聚果糖的生产企业例如上市企业-山东保龄宝和量子高科全部采用蔗糖作为原料并且加入果糖基转移酶来生产。由于工艺特性的限制，其初级低聚果糖产品的纯度只能达到50%左右，含有一半左右的葡萄糖、蔗糖和少量果糖，限制了控糖人群的应用。若需得到较高纯度的低聚果糖，则需应用膜分离法或工业色谱柱技术来分离，极大的提高了企业固定投入和生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖，本发明提供的方法制备获得的低聚果糖得率较高，单糖含量较低。
本发明提供了一种低聚果糖的制备方法，以菊粉内切酶酶解含有多聚果糖的材料；
所述菊粉内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述多聚果糖为以β-2,1键连接的多聚果糖；
所述酶解的温度为55℃~65℃，50 r/min~70 r/min搅拌，酶解2h~4h。
本发明一些实施例中，酶解的温度为60℃，时间为3h，搅拌速率为60r/min。
本发明一些实施例中，菊粉内切酶的用量为1U/mL。
菊粉内切酶单位1U表示每分钟水解产生1μmol果糖所需的酶量
本发明一些实施例中，所述含有多聚果糖的材料为菊芋或菊苣；所述菊芋制成菊芋粉、菊芋汁、菊芋浆或菊芋渣；所述菊苣制成菊苣粉。
由于菊粉的结构中，仅在末端带有一个葡萄糖分子，因此以菊粉为原料制备低聚多糖产物纯度较高，制备过程中产生葡萄糖单糖的几率较低。而果糖的代谢途径与胰岛素无关，人体摄入不会引起血糖及胰岛素水平波动。研究表明，低聚果糖能够作为益生元促进双歧杆菌的增殖。
菊芋粉或菊苣粉的制备方法为新鲜菊芋或菊苣烘干，粉碎制成。
一些具体实施例中，菊芋粉或菊苣粉酶解前以水稀释至质量分数为10%，然后95℃搅拌0.5h。
以菊芋粉或菊苣粉为原料，菊粉内切酶的用量为1U/mL。酶解条件为pH7.0,60℃酶解3h。
以菊芋粉或菊苣粉为原料，经菊粉内切酶酶解所得产物离心去除沉淀后，稀释10倍经HPLC检测，总糖浓度约为5μg/μL，总糖得率为8.8%~9%，总糖中60%~65%为寡聚果糖。所述寡聚果糖包括：三糖、四糖、五糖、六糖。
一些具体实施例中，菊芋汁由菊芋压榨后，取汁制得，酶解前与水混合，体积比为1：1。
以菊芋汁为原料，菊粉内切酶的用量为0.5~5 U/mL。酶解条件为pH7.0，60℃酶解3h。
以菊芋汁为原料，经菊粉内切酶酶解所得产物离心去除沉淀后，稀释10倍经HPLC检测，总糖质量分数为7.1%，总糖得率可达为12.78%。总糖中80%为寡聚果糖，寡聚果糖包括：三糖，四糖，五糖，六糖。
一些具体实施例中，菊芋渣为菊芋压榨、取汁后的渣，酶解前与水混合90℃煮0.5h；所述与水混合的质量体积比为1g:（1~2）mL。
其中，菊芋渣与水的质量体积比为1g：1mL、1g：1.5mL或1g：2mL。
以菊芋渣为原料，菊粉内切酶的用量为1U/mL。酶解条件为pH7.5~8.0，55~65℃酶解2~4h。一些具体实施例中，以菊芋汁为原料，菊粉内切酶的用量为1 U/mL。酶解条件为pH8.0，60℃酶解3h。
菊芋渣以水煮后，酶解前还经过过滤取滤液的步骤。结果表明，以菊芋渣为原料，经菊粉内切酶酶解所得产物离心去除沉淀后，稀释10倍经HPLC检测，总糖质量分数为4.5%~6.4%，总糖得率为5.4%~10.1%。总糖中73%~81%为寡聚果糖，寡聚果糖包括：三糖，四糖，五糖，六糖。
一些具体实施例中，菊芋浆由菊芋破碎制得，酶解前与1~2倍体积的水混合85℃煮0.5h，离心分离获得上清液A和沉淀；将所述沉淀与等体积水混合，再次离心分离得到上清液B；将上清液A与上清液B混合，然后进行酶解。
以菊芋浆为原料，菊粉内切酶的用量为1U/mL。酶解条件为pH6.5，60℃酶解3h。
以菊芋浆为原料，经菊粉内切酶酶解所得产物离心去除沉淀后，稀释10倍经HPLC检测，总糖质量分数为10.8%，总糖得率为7 %。总糖中70%为寡聚果糖，寡聚果糖包括：三糖，四糖，五糖，六糖。
本发明采用的菊粉内切酶为发酵液或发酵液经纯化、冻干后获得粉末或颗粒。
本发明实施例中，菊粉内切酶为表达SEQ ID NO:2所示核苷酸序列DNA分子的工程菌的发酵液，所述工程菌的起始菌株为毕赤酵母GS115；DNA分子的表达载体骨架为pPIC9K。
本发明采用的工程菌由申请号为201611167593.6的中国发明专利提供，其中，编码菊粉内切酶的DNA分子来自黑曲霉基因Inu2（AJ006951），根据宿主细胞进行改造，更适合酵母菌的表达，从而获得活性更高的菊粉内切酶，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列长为1485bp。
本发明提供的表达载体中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子的插入位点为EcoRI与Not I酶切位点之间。以pPIC9K为载体能够将SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子插入毕赤酵母GS115的his4区，从而使SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子能够顺利的表达为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的菊粉内切酶。
所述转化毕赤酵母GS115前，表达载体经线性化，所述线性化的酶SalI。转化采用LiCl法。转化后，采用MD/-His固体培养基筛选阳性转化子；每升MD/-His固体培养基中包括葡萄糖20 g，YNB 13.4 g，生物素0.4 mg；琼脂20g；筛选培养的温度为28℃。倒置培养。
菊粉内切酶（发酵液）的制备方法为：将上述工程菌经活化、培养、诱导。
所述活化采用BMGY培养基或BMDY培养基。
发酵的培养基为BMDY培养基或BMMY培养基；发酵的诱导剂为甲醇。
每升BMGY培养基中含酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，YNB 13.4 g，甘油10 g，生物素0.4 mg。
每升BMMY培养基中含酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，YNB 13.4 g，甲醇10g，生物素0.4 mg。
每升BMDY培养基中含酵母提取物15 g，蛋白胨30 g，YNB 13.4 g，葡萄糖40 g，生物素0.4 mg，硫酸铵2 g。
本发明实施例中，发酵包括培养和诱导的步骤；
培养的温度为28℃，搅拌速度为150rpm~300rpm；
诱导的温度为28℃，搅拌速度为200rpm~450rpm。
所述发酵过程pH值为6.0。
当采用BMDY培养基作为发酵培养基时，所述发酵24h后开始诱导。即培养的时间为24h。24h后添加诱导剂甲醇。
随着甲醇的添加，发酵72h~120h，菊粉内切酶的活力达到最高。即诱导48h~96h后，菊粉内切酶的活力达到最高。优选的，诱导72h后菊粉内切酶的活力最高。
甲醇的添加采用流加的方式，每24h加入甲醇至甲醇的体积占发酵培养基的1%。
当采用BMMY培养基作为发酵培养基时，因BMMY培养基中即含有甲醇，从培养开始便开始诱导，28℃，共发酵7天。
菊粉内切酶（冻干粉）的制备方法为将发酵上清液透析后经DEAE-Sepharose阴离子柱进行离子交换，用含0.3M/L 的NaCl Buffer对目的蛋白进行洗脱，再经Sephadex G-75柱层析收集活性单峰，对洗脱液透析后进行冷冻干燥。
以本发明提供的制备方法制备的低聚果糖。
以菊芋汁、菊芋粉、菊苣粉、菊芋渣、菊芋浆为原料，经酶解后寡聚果糖存在于酶解液中。所述酶解液经10kDa微孔膜过滤取滤液后，获得滤出液A；所述滤出液A经5kDa微孔膜过滤，取滤出液B，经浓缩后，获得寡聚果糖溶液。喷干或冻干后获得寡聚果糖。
以本发明提供方法制备低聚果糖中，单糖的含量较低，而寡聚果糖的含量可达总糖的80%。显著高于现有技术制得的寡聚果糖的含量。不仅提高了寡聚果糖的提取效率，还避免了繁复的纯化工艺带来的能源浪费。
具体实施方式
本发明提供了利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
人工合成SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，两端两头含有EcoRI和NotI酶切位点。其中，EcoRI位于5’端，Not I位于3’端。另在3’端连接8个bp的保护碱基，序列为CCCCAAAA。全基因合成后的片段构建在pGH质粒中，大小为1507bp，载体为Amp抗性。然后转化DH5α感受态细胞；得到的转化子以PCR检测是否能扩增出1.5kb的条带；然后提取质粒DNA，酶切验证质粒是否含有1.5kb片段插入；最后，选取克隆的质粒DNA进行序列测定，结果显示所选取的克隆中内切酶基因的DNA序列完全正确。至此，得到了含有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的质粒pGH/Inu2。
抽提全基因合成的质粒后，用限制性内切酶EcoRI和NotI做双酶切，回收1499bp的Inu2片段，并连入pPIC9K质粒，构建成pPIC9K/Inu2质粒。测序正确后，用Sal I限制性内切酶单切载体做线性化，并用LiCl法转化毕赤酵母感受态细胞GS115。后涂布于MD/-His平板（每升含葡萄糖20 g，YNB 13.4 g，生物素 0.4 mg，琼脂 20 g），28℃培养至长出转化子。从MD/-His平板上挑取生长较好的毕赤酵母转化子的菌体少许，在含有3mg/ml G418的YPD划线培养3天。生长良好的克隆即为多拷贝整合了目的基因的菌种，也即候选的菌种。
选取一个单克隆接入BMDY培养液中，28℃，200 rpm摇菌过夜后作为种子液，然后按照1:100的体积比转接入6L的BMDY中，28℃，600 rpm发酵24h，而后每24 h加入1%甲醇，发酵66 h获得含有菊粉内切酶的上清液，酶活力为1655 U/ml。
实施例2
新鲜菊芋洗净削皮切片，烘干，粉碎后成为菊芋粉。
称取菊芋粉，加入10倍质量的水，95℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.0 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表1:
表1：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量（稀释前） | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 5.88mg/ml | 11.76 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 13.99mg/ml | 27.98 |
| 三糖 | 8.67mg/ml | 17.34 |
| 四糖 | 8.74mg/ml | 17.48 |
| 五糖 | 8.44mg/ml | 16.88 |
| 六糖 | 4.28mg/ml | 8.56 |
如表1，采用菊芋粉作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为9% ，其中寡聚果糖占60%。
实施例3
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋汁，加入等质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.5 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表2:
表2：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 3.55mg/ml | 6.21 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 7.43mg/ml | 13.00 |
| 三糖 | 13.90mg/ml | 24.34 |
| 四糖 | 13.59mg/ml | 23.78 |
| 五糖 | 12.08mg/ml | 21.15 |
| 六糖 | 6.58mg/ml | 11.52 |
如表2，采用菊芋汁作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为12.78%，其中寡聚果糖占80%。
实施例4
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋渣，加入等质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.5 60℃反应4小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表3:
表3：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 2.52mg/ml | 9.13 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 3.85mg/ml | 16.32 |
| 三糖 | 5.52mg/ml | 23.34 |
| 四糖 | 5.07mg/ml | 21.46 |
| 五糖 | 4.49mg/ml | 19.03 |
| 六糖 | 2.53mg/ml | 10.72 |
如表3，采用菊芋渣作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为5.4%，其中寡聚果糖占73%。
实施例5
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋渣，加入1.5倍质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 8.0 60℃反应2小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表4:
表4：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 2.75mg/ml | 7.15 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 4.92mg/ml | 12.80 |
| 三糖 | 9.76mg/ml | 25.38 |
| 四糖 | 8.74mg/ml | 22.73 |
| 五糖 | 8.90mg/ml | 23.16 |
| 六糖 | 3.37mg/ml | 8.78 |
如表4，采用菊芋渣作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为9.3%，其中寡聚果糖占81%。
实施例6
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋渣，加入2倍质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 8.0 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表5:
表5：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 2.82mg/ml | 8.18 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 4.17mg/ml | 12.10 |
| 三糖 | 8.09mg/ml | 23.48 |
| 四糖 | 8.11mg/ml | 23.53 |
| 五糖 | 8.40mg/ml | 24.36 |
| 六糖 | 2.87mg/ml | 8.35 |
如表5，采用菊芋渣作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为10.1%，其中寡聚果糖占79%。
实施例7
向500g菊芋浆中加入500g水，85℃煮30 min，期间搅拌多次，离心后得到上清666g，沉淀333g，上清液占比2/3。将沉淀加入1倍体积的水后得到上清液330 g，将两次处理获得的上清液合并。
按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 6.5 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5 ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表6:
表6：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 1.92mg/ml | 9.06 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 4.74mg/ml | 22.38 |
| 三糖 | 4.56mg/ml | 21.54 |
| 四糖 | 4.40mg/ml | 20.78 |
| 五糖 | 4.46mg/ml | 21.05 |
| 六糖 | 1.10mg/ml | 5.19 |
如表6，采用菊芋浆作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为 7%，其中寡聚果糖占70%。
实施例8
新鲜菊苣洗净削皮切片，烘干，粉碎后成为菊苣粉。
称取菊苣粉，加入10倍质量的水，95℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为1 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.0 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表7:
表7产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 6.21mg/ml | 12.43 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 11.28mg/ml | 22.58 |
| 三糖 | 9.06mg/ml | 18.14 |
| 四糖 | 10.20mg/ml | 20.43 |
| 五糖 | 8.63mg/ml | 17.28 |
| 六糖 | 4.56mg/ml | 9.14 |
如表7，采用菊苣粉作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为8.8% ，其中寡聚果糖占65%。
实施例9
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋汁，加入等质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为5 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.0 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表8：
表8：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 4.98mg/ml | 8.42 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 10.77mg/ml | 18.20 |
| 三糖 | 18.52mg/ml | 31.32 |
| 四糖 | 15.09mg/ml | 25.51 |
| 五糖 | 6.01mg/ml | 10.15 |
| 六糖 | 3.79mg/ml | 6.40 |
如表8，采用菊芋汁作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为 12.5%，其中寡聚果糖占75%。
实施例10
将菊芋的块茎用滚筒榨汁机中压榨，得到渣的总量为1792g，汁的总量为3411g；汁的占比为65.6%。
称取菊芋汁，加入等质量的水，90℃加热并搅拌半小时，离心取上清后，按照终浓度为0.5 u/ml加入实施例1制备的菊粉内切酶的上清液，pH 7.0 60℃反应3小时（期间需要搅拌，60r/min），等冷却后, 将以上酶解产物高速离心去沉淀后，稀释10倍（总糖浓度约为5ug/ul），利用HPLC分别检测标准品和稀释后产物中各种糖的含量，结果如表9：
表9：产物中各种糖的含量
| 糖的种类 | 含量 | 占总糖质量分数（%） |
| 果糖 | 2.96mg/ml | 5.18 |
| 葡萄糖+蔗糖 | 6.57mg/ml | 11.50 |
| 三糖 | 5.35mg/ml | 9.38 |
| 四糖 | 7.18mg/ml | 12.57 |
| 五糖 | 8.19mg/ml | 14.35 |
| 六糖 | 8.90mg/ml | 15.59 |
| 多聚果糖 | 17.96mg/ml | 31.43 |
如表9，采用菊芋汁作为原料制备寡聚果糖，总糖的得率为12 %，其中寡聚果糖占50%。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 丰宁平安高科实业有限公司
<120> 利用内切菊粉酶以菊苣或菊芋为原料生产低聚果糖
<130> MP1624490
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Ser Asn Asp Tyr Arg Pro Ser Tyr His Phe Thr Pro Asp Gln Tyr
1 5 10 15
Trp Met Asn Glu Pro Asn Gly Leu Ile Lys Ile Gly Ser Thr Trp His
20 25 30
Leu Phe Phe Gln His Asn Pro Thr Ala Asn Val Trp Gly Asn Ile Cys
35 40 45
Trp Gly His Ala Thr Ser Thr Asp Leu Met His Trp Ala His Lys Pro
50 55 60
Thr Ala Ile Ala Asp Glu Asn Gly Val Glu Ala Phe Thr Gly Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Tyr Asp Pro Asn Asn Thr Ser Gly Leu Gly Asp Ser Ala Asn Pro
85 90 95
Pro Tyr Leu Ala Trp Phe Thr Gly Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Thr Gln
100 105 110
Asp Gln Arg Leu Ala Phe Ser Val Asp Asn Gly Ala Thr Trp Thr Lys
115 120 125
Phe Gln Gly Asn Pro Ile Ile Ser Thr Ser Gln Glu Ala Pro His Asp
130 135 140
Ile Thr Gly Gly Leu Glu Ser Arg Asp Pro Lys Val Phe Phe His Arg
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Trp Ile Met Val Leu Ala His Gly Gly Gln Asp Lys
165 170 175
Leu Ser Phe Trp Thr Ser Ala Asp Thr Ile Asn Trp Thr Trp Gln Ser
180 185 190
Asp Leu Lys Ser Thr Ser Ile Asn Gly Leu Ser Ser Asp Ile Thr Gly
195 200 205
Trp Glu Val Pro Asp Met Phe Glu Leu Pro Val Glu Gly Thr Glu Glu
210 215 220
Thr Thr Trp Val Val Met Met Thr Pro Ala Glu Gly Ser Pro Ala Gly
225 230 235 240
Gly Asn Gly Val Leu Ala Ile Thr Gly Ser Phe Asp Gly Lys Ser Phe
245 250 255
Thr Ala Asp Pro Val Asp Ala Ser Thr Met Trp Leu Asp Asn Gly Arg
260 265 270
Asp Phe Asp Gly Ala Leu Ser Trp Val Asn Val Pro Ala Ser Asp Gly
275 280 285
Arg Arg Ile Ile Ala Ala Val Met Asn Ser Tyr Gly Ser Asn Pro Pro
290 295 300
Thr Thr Thr Trp Lys Gly Met Leu Ser Phe Pro Arg Thr Leu Ser Leu
305 310 315 320
Lys Lys Val Gly Thr Gln Gln His Phe Val Gln Gln Pro Ile Thr Glu
325 330 335
Leu Asp Thr Ile Ser Thr Ser Leu Gln Ile Leu Ala Asn Gln Thr Ile
340 345 350
Thr Pro Gly Gln Thr Leu Leu Ser Ser Ile Arg Gly Thr Ala Leu Asp
355 360 365
Val Arg Val Ala Phe Tyr Pro Asp Ala Gly Ser Val Leu Ser Leu Ala
370 375 380
Val Arg Lys Gly Ala Ser Glu Gln Thr Val Ile Lys Tyr Thr Gln Ser
385 390 395 400
Asp Ala Thr Leu Ser Val Asp Arg Thr Glu Ser Gly Asp Ile Ser Tyr
405 410 415
Asp Pro Ala Ala Gly Gly Val His Thr Ala Lys Leu Glu Glu Asp Gly
420 425 430
Thr Gly Leu Val Ser Ile Arg Val Leu Val Asp Thr Cys Ser Val Glu
435 440 445
Val Phe Gly Gly Gln Gly Glu Ala Val Ile Ser Asp Leu Ile Phe Pro
450 455 460
Ser Asp Ser Ser Asp Gly Leu Ala Leu Glu Val Thr Gly Gly Asn Ala
465 470 475 480
Val Leu Gln Ser Val Asp Val Arg Ser Val Ser Leu Glu
485 490
<210> 2
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcaatcta atgattaccg tccatcatac cacttcacac cggaccaata ctggatgaat 60
gagccaaatg gcttgattaa gatcggatcc acctggcact tgttctttca acacaatccg 120
acggctaatg tatggggtaa tatatgttgg gggcacgcta cgagcaccga cctgatgcac 180
tgggcacaca agcccactgc cattgcggac gagaacggag tcgaagcgtt taccggtaca 240
gcttattatg acccaaacaa cacctctggt cttggggact cggcaaaccc accctatttg 300
gcttggttca caggttatac cacttcaagc caaacacaag accaacgcct ggctttcagt 360
gtggataacg gggcgacgtg gaccaaattt caaggcaatc ccatcatatc aactagccaa 420
gaagcaccac atgacataac gggtggtctc gagagtaggg acccaaaggt attcttccat 480
cgccaatcgg ggaattggat catggttctc gcccatggcg ggcaagacaa gttgtctttc 540
tggacgtctg cagacaccat aaactggaca tggcaaagtg acctgaagtc cacctcgatc 600
aacggtctat cgtccgatat tacagggtgg gaagtccccg acatgtttga actcccggtt 660
gaaggcactg aggagaccac gtgggtggtg atgatgacgc cggctgaagg atccccagct 720
ggtggtaatg gggtcttagc tatcaccggt tcttttgacg ggaagagttt tacggcagac 780
cccgtcgacg cttcgaccat gtggctggac aacgggagag atttcgacgg cgctctgagc 840
tgggtgaacg tgccagcgtc cgacggacgg cggattatcg ctgctgtcat gaatagctac 900
ggttccaacc cgccaacaac cacctggaag gggatgctct cctttccccg gacgttgtcg 960
ctcaagaaag ttggtacgca acaacacttt gttcaacaac cgatcacaga gttggacaca 1020
atcagtacca gtctgcaaat actagcaaac caaaccatta cccctggcca aacattgttg 1080
tcatcgattc ggggaactgc tctcgacgtt cgagttgctt tttaccctga tgctggttcg 1140
gttctgtccc tcgccgtccg aaagggtgct tcggagcaaa cagtcattaa gtacacccaa 1200
tcagacgcca cattgtcggt tgatcgaaca gagagtggag acatctcgta tgacccggct 1260
gcaggtggtg tccataccgc caagttggaa gaggacggca ccggactggt ttccatccgg 1320
gtgttggtgg acacgtgttc tgtagaggtt tttggtggac aaggagaagc cgtcatttcc 1380
gacctcatct tcccgagtga cagttctgac ggtttggctt tggaggtaac tggcggaaat 1440
gcagtgctgc aatcggtgga cgtgcggagt gtttcacttg aatga 1485
Claims (8)
1.一种低聚果糖的制备方法，其特征在于，以菊粉内切酶酶解含有多聚果糖的材料；
所述菊粉内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述多聚果糖为以β-2,1键连接的多聚果糖；
所述酶解的温度为55℃~65℃，50 r/min~70 r/min搅拌，酶解2h~4h；
所述菊粉内切酶为表达SEQ ID NO:2所示核苷酸序列DNA分子的工程菌的发酵液，所述工程菌的起始菌株为毕赤酵母GS115；DNA分子的表达载体骨架为pPIC9K。
2.根据权利要求1所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为60℃，时间为3h，搅拌速率为60r/min。
3.根据权利要求1所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述菊粉内切酶的用量为1U/mL。
4.根据权利要求1所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述含有多聚果糖的材料为菊芋或菊苣；所述菊芋制成菊芋粉、菊芋汁、菊芋浆或菊芋渣；所述菊苣制成菊苣粉。
5.根据权利要求4所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述菊芋粉或菊苣粉酶解前以水稀释至质量分数为10%，然后95℃搅拌0.5h。
6.根据权利要求4所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述菊芋汁由菊芋压榨后，取汁制得，酶解前与水混合90℃煮0.5h，体积比为1：1。
7.根据权利要求4所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述菊芋渣为菊芋压榨、取汁后的渣，酶解前与水混合90℃煮0.5h；所述与水混合的质量体积比为1g:（1~2）mL。
8.根据权利要求4所述的低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述菊芋浆由菊芋破碎制得，酶解前与1~2倍体积的水混合85℃煮0.5h，离心分离获得上清液A和沉淀；将所述沉淀与等体积水混合，再次离心分离得到上清液B；将上清液A与上清液B混合，然后进行酶解。
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| Inulinase precursor (2,1-beta-D-fructanfructanohydrolase);NCBI;《NCBI Genpept》;20030915;第1-2页 * |
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