CN114606281A - 一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法 - Google Patents

一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法。首先采用热水浸提法提取菊苣根茎中果聚糖，再通过正交试验法进行菊糖酶酶解果聚糖工艺优化。通过HPLC法检测酶解前后葡萄糖和果糖的含量，将葡萄糖和果糖含量的差值换算成果聚糖含量。最后，确定最佳酶解工艺为酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。结果测定菊苣根茎中果聚糖含量高达8.19mg/mL，占干物质百分含量为40.95％。

Description

一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法
技术领域
本发明涉及功能性食品加工技术领域，更具体的说是涉及一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法。
背景技术
菊苣，属于菊科菊苣属，其根茎中富含果聚糖。果聚糖又称为菊糖、菊粉，具有调节改善肠道、缓解便秘、降血糖、降脂减肥等功能，被广泛应用于食品和医疗等相关领域。
菊苣根茎作为提取果聚糖的主要原材料之一，在菊苣中提取的果聚糖已被国外应用于开发功能性食品。然而，不同品种和种质资源菊苣根茎中果聚糖含量存在差异，为更好地筛选高果聚糖含量的菊苣品种和种质资源作为提取果聚糖的原材料或用于加工原材料等，测定菊苣根茎中的果聚糖含量必不可少。目前测定果聚糖含量的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、离子色谱法(HPAEC)等，即利用热水浸提法提取果聚糖后，采用HPLC和HPAEC等测定果聚糖含量，但果聚糖标准品的成本较高；还有利用强酸水解-HPLC法检测水解前后的糖含量，计算差值，换算成果聚糖含量，但此法会对色谱柱产生腐蚀，损害仪器。本发明与现有技术存在区别(李绍平等，2009；柏雪等，2020)，与其他方法相比，酶解法具有反应条件温和、无污染、效率高等优点，但关于利用酶解法测定果聚糖含量的研究报道较少。因此，本发明采用热水浸提法提取菊苣根茎中的果聚糖，再利用酶解法联合HPLC法，通过优化酶解工艺条件，分别测定酶解前后果糖和葡萄糖的含量，从而换算成果聚糖含量，以期为测定菊苣根茎中果聚糖含量提供参考依据。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，通过单因素试验和正交试验法，优化酶解工艺，获得了最佳酶解工艺。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，包括以下步骤：
(1)制备菊苣根茎粉：
将菊苣根茎洗干净，切成薄片，烘干至恒重，粉碎，过筛，得菊苣根茎粉；
(2)提取果聚糖：
将菊苣根茎粉倒入25mL试管中，然后加入双蒸水，将试管放入水浴锅，沸水浴30min，将试管放至室温，将试管中溶液倒入10mL离心管离心处理，并将上清液转移至25mL容量瓶中，重复以上操作，合并两次上清液，定容，即为果聚糖提取液；
(3)单因素试验：
制定酶解基本条件为：酶底比6％、酶解时间80min和酶解温度40℃，固定其中两个条件，改变另一个条件，分别研究三个因素的影响，确定较佳的因素水平；
(4)正交试验法优化酶解工艺：在单因素试验结果的基础上，分别选取酶底比、酶解时间和酶解温度三个因素较佳的三个水平进行L9(34)正交试验；
(5)HPLC法分别检测步骤(2)(3)(4)待测液的葡萄糖和果糖含量，按以下公式计算果聚糖含量：
果聚糖含量(mg/mL)＝k(G+F)，k＝[180+162(n-1)]/180n
其中n：待测液平均聚合度；G：待测液果糖含量；F：待测液葡萄糖含量；
(6)确定最佳酶解条件。
优选的，步骤(1)中所述烘干温度为65℃，过筛为过40目筛。
优选的，步骤(2)中所述菊苣根茎粉与双蒸水的质量体积比为0.5g：20mL；所述离心的转速为12000r/min；离心时间为10min。
优选的，步骤(3)中所述酶解中用到的酶为菊糖酶，酶活性为60000U/g，(EC：3.2.1.7)
优选的，步骤(3)中所述单因素试验中酶解取值为：酶底比为4％、5％、6％、7％、8％；酶解时间为80min、90min、100min、110min、120min、130min；酶解温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。
优选的，步骤(4)正交试验法优化酶解工艺中三个因素三个水平取值为：酶底比为5％、6％、7％；酶解时间为100min、110min、120min；酶解温度为40℃、45℃、50℃。
优选的，步骤(5)中待测液在检测前先通过孔径为0.22μm的滤膜。
优选的，步骤(5)中HPLC检测法中检测参数为：Shodex SUGAR SC1011色谱柱，示差检测器RID-10A，柱温80℃，进样量5μL，流动相为双蒸水，流速1mL/min。
优选的，步骤(6)中所述最佳酶解条件为：酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明针对富含果聚糖的菊苣根茎，采用了正交试验法优化了果聚糖酶解工艺，再进行HPLC法检测，提供一个最佳酶解工艺条件。优化后的酶解工艺，在果聚糖的检测上操作更加简便、成本较低。
2.本发明研究了酶底比、酶解时间和酶解温度对菊苣根茎中果聚糖酶解的影响。通过单因素试验和正交试验法，优化酶解工艺，获得最佳酶解工艺为酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。经验证表明，该酶解工艺酶解果聚糖稳定、可靠，可用于测定菊苣根茎中果聚糖含量。本发明为检测菊苣根茎中果聚糖含量提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为葡萄糖标准曲线；
图2为果糖标准曲线；
图3为酶底比对酶解果聚糖的影响；
图4为酶解时间对酶解果聚糖的影响；
图5为酶解温度对酶解果聚糖的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种用正交试验法酶解菊苣果聚糖工艺优化及HPLC法检测的方法，正交试验法优化的最佳酶解工艺为酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。
1.1材料与试剂
菊苣品种：TOPSCORE；菊糖酶(60000U/g，EC：3.2.1.7)：上海源叶生物科技有限公司；果糖标准品(纯度≥98％)、葡萄糖标准品(纯度≥98％)：北京索莱宝科技有限公司。
1.2试验方法
正交试验法酶解菊苣果聚糖工艺优化的具体操作步骤：
1.2.1建立标准曲线
通过2倍稀释倍数稀释葡萄糖标准品和果糖标准品，进行HPLC检测，建立葡萄糖标准曲线(图1)和果糖标准曲线(图2)。
HPLC法优选Shodex SUGAR SC1011色谱柱，示差检测器RID-10A，柱温80℃，进样量5μL，流动相为双蒸水，流速1mL/min。
1.2.1制备菊苣根茎粉
将菊苣根茎洗干净，切成薄片，在65℃下烘干至恒重，再用磨粉机将其粉碎，过40目筛。
1.2.2提取果聚糖
称取菊苣根茎粉0.5g，倒入25mL试管中，加入20mL双蒸水，将试管放入水浴锅，沸水浴30min。将试管放置至室温。将试管中溶液倒入10mL离心管，12000r，离心10min，将上清液转移至25mL容量瓶中，重复以上操作，合并两次上清液，定容，即为果聚糖提取液。通过HPLC测定果聚糖提取液中葡萄糖和果糖含量。
1.2.3单因素试验
1.2.3.1酶底比对菊苣根茎中果聚糖酶解的影响
分别取1mL果聚糖提取液，固定酶解时间为80min、酶解温度为40℃，分别进行酶底比为4％、5％、6％、7％、8％时的酶解反应。酶解结束后，将以上反应体系放入沸水浴中5min，让酶失去活性，待冷却至室温，测定葡萄糖和果糖含量，计算酶解前后葡萄糖和果糖含量差值，换算成果聚糖含量。结果表明，在酶解时间和酶解温度相同的基础上，随着酶底比的增加，酶解果聚糖含量在不断增加。但在酶底比大于5％后，酶解果聚糖含量处于相对稳定的状态(图3)。因此，选取酶底比为5％、6％和7％三个水平进行下一步正交试验。
1.2.3.2酶解时间对菊苣根茎中果聚糖酶解的影响
分别取1mL果聚糖提取液，固定酶解温度为40℃、酶底比为6％，分别进行酶解时间为80min、90min、100min、110min、120min、130min时的酶解反应。酶解结束后，将以上反应体系放入沸水浴中5min，让酶失去活性，待冷却至室温，测定葡萄糖和果糖含量，计算酶解前后葡萄糖和果糖含量差值，换算成果聚糖含量。结果表明，随着酶解时间的增加，酶解果聚糖含量先稍微下降后上升，在100min后达到相对稳定的状态，且在110min时达到最高值(图4)。因此，选取100min、110min和120min三个水平进行正交试验。1.2.3.3酶解温度对菊苣根茎中果聚糖酶解的影响
分别取1mL果聚糖提取液，固定酶底比为6％、酶解时间为80min，分别进行酶解温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃时的酶解反应。酶解结束后，将以上反应体系放入沸水浴中5min，让酶失去活性，待冷却至室温，测定葡萄糖和果糖含量，计算酶解前后葡萄糖和果糖含量差值，换算成果聚糖含量。结果表明，在酶解温度上升到50℃前，随着酶解温度的上升，菊苣根茎中果聚糖的酶解量在不断增加，在45℃时达到峰值。当酶解温度大于45℃后，随着酶解温度的上升，酶解果聚糖含量不断减少，在酶解温度达到55℃时酶解果聚糖含量减少明显，说明此时温度过高，使酶变性失活(图5)。因此，选取酶解温度为40℃、45℃和50℃三个水平进行正交试验。
1.3正交试验法优化酶解工艺
由单因素试验结果，确定正交试验的因素和水平(表1)。通过正交试验结果和极差分析表明(表2)，三个因素对菊糖酶酶解菊苣果聚糖的影响大小顺序为：酶底比>酶解温度>酶解时间，正交试验优化酶解最佳工艺为：A3B2C2，即酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。
表1正交试验因素与水平
Figure BDA0003598623640000071
表2正交试验分析
Figure BDA0003598623640000072
Figure BDA0003598623640000081
1.4验证最优试验
取3份果聚糖提取液，每份1mL。按最佳酶解工艺酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃进行试验。试验结果表明，酶解菊苣根茎中果聚糖含量分别为8.14mg/mL、8.14mg/mL、8.19mg/mL，高于正交试验各组结果，RSD为0.35％。表明该优化后的最佳酶解工艺稳定、可靠。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备菊苣根茎粉：
将菊苣根茎洗干净，切成薄片，烘干至恒重，粉碎，过筛，得菊苣根茎粉；
(2)提取果聚糖：
将菊苣根茎粉倒入试管中，然后加入双蒸水，沸水浴30min，放至室温，离心处理，并将上清液转移至容量瓶中，重复以上操作，合并两次上清液，定容，即为果聚糖提取液；
(3)单因素试验：
制定酶解基本条件为：酶底比6％、酶解时间80min和酶解温度40℃，固定其中两个条件，改变另一个条件，分别研究三个因素的影响，确定较佳的因素水平；
(4)正交试验法优化酶解工艺：在单因素试验结果的基础上，分别选取酶底比、酶解时间和酶解温度三个因素较佳的三个水平进行L9(34)正交试验；
(5)HPLC法分别检测步骤(2)(3)(4)待测液的葡萄糖和果糖含量，按以下公式计算果聚糖含量：
果聚糖含量(mg/mL)＝k(G+F)，k＝[180+162(n-1)]/180n
其中n：待测液平均聚合度；G：待测液果糖含量；F：待测液葡萄糖含量；
(6)确定最佳酶解条件。
2.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(1)中所述烘干温度为65℃，过筛为过40目筛。
3.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(2)中所述菊苣根茎粉与双蒸水的质量体积比为0.5g：20mL；所述离心的转速为12000r/min；离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶解中用到的酶为菊糖酶，酶活性为60000U/g。
5.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(3)中所述单因素试验中酶解取值为：酶底比为4％、5％、6％、7％、8％；酶解时间为80min、90min、100min、110min、120min、130min；酶解温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。
6.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(4)正交试验法优化酶解工艺中三个因素三个水平取值为：酶底比为5％、6％、7％；酶解时间为100min、110min、120min；酶解温度为40℃、45℃、50℃。
7.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(5)中待测液在检测前先通过孔径为0.22μm的滤膜。
8.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(5)中HPLC检测法中检测参数为：Shodex SUGAR SC1011色谱柱，示差检测器RID-10A，柱温80℃，进样量5μL，流动相为双蒸水，流速1mL/min。
9.根据权利要求1所述的一种酶解菊苣果聚糖工艺优化方法，其特征在于，步骤(6)中所述最佳酶解条件为：酶底比7％，酶解时间110min，酶解温度45℃。
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