CN111856036A - 结合疫苗中的游离多糖含量测定方法 - Google Patents

结合疫苗中的游离多糖含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，包括以下步骤：对结合疫苗原液进行盐析处理；向经盐析处理后的原液中加入无水乙醇，得到混合液A；对所述混合液A进行离心处理，分离，得到多糖蛋白结合物和游离糖的混合沉淀物；步骤S4：将所述混合沉淀物加入到水中，得到混合液B；对所述混合液B进行离心处理，收集上清液作为测试液；测定所述测试液的多糖含量，记为结合疫苗中的游离多糖含量。本发明提供的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，通过加入乙醇使结合疫苗中的多糖结合蛋白发生不可逆变性，以沉淀并分离结合疫苗中的多糖结合蛋白，从而减小结合疫苗中的多糖结合蛋白对游离多糖含量的测定的影响，以获得更准确的游离多糖含量。

Description

结合疫苗中的游离多糖含量测定方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合疫苗中的游离多糖含量测定方法。
背景技术
结合疫苗的有效成分为多糖蛋白结合物，该结合物能够引起机体胸腺依赖性免疫应答，对幼儿起到长期的保护作用；而游离多糖没有免疫原性和免疫记忆，当游离多糖过多时会到结合疫苗的免疫原性产生一定影响，因此游离多糖含量是结合疫苗在开发和生产过程中一项重要的质量控制参数。现有的多糖含量测定方法通常为蒽酮法，而采用蒽酮法得到的测定结果会把结合态的多糖含量包含进去，从而影响测定结果的准确性。
因此，针对上述技术问题，有必要提供一种结合疫苗中的游离多糖含量测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、准确率高的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，包括以下步骤：
步骤S1：对结合疫苗原液进行盐析处理；
步骤S2：向经盐析处理后的原液中加入无水乙醇，得到混合液A；
步骤S3：对所述混合液A进行离心处理，分离，得到多糖蛋白结合物和游离糖的混合沉淀物；
步骤S4：向所述混合沉淀物加水进行复溶，得到混合液B；
步骤S5：对所述混合液B进行离心处理，收集上清液作为测试液；
步骤S6：测定所述测试液的多糖含量，记为结合疫苗中的游离多糖含量。
进一步地，所述步骤S1中的盐析处理方式为：向所述结合疫苗原液中加入浓度为4.5～6mol/L的氯化钠溶液，混匀后静置。
进一步地，所述氯化钠溶液和结合疫苗原液的体积比为1:(1～2.5)。
进一步地，所述步骤S2中的结合疫苗原液和无水乙醇的体积比为1:(8～16)。
进一步地，所述步骤S3中的离心处理方式为：将所述混合液A置于离心机中，在离心力为(5500～6500)×g、温度为3～7℃的条件下，离心1～1.5小时。
进一步地，所述步骤S5中的离心处理方式为：将所述混合液B置于离心机中，在转速为3000～5000rpm、温度为12～18℃的条件下，离心10～20分钟。
本发明有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，通过加入乙醇使结合疫苗中的多糖结合蛋白发生不可逆变性，以沉淀并分离结合疫苗中的多糖结合蛋白，从而减小结合疫苗中的多糖结合蛋白对游离多糖含量的测定的影响，以获得更准确的游离多糖含量。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
需要说明的是，以下的说明中，表示量的“％”和“份”只要无特别说明，则为重量基准。除非另外指明，否则本说明书和权利要求中使用的表示特征尺寸、数量和物理特性的所有数字均应该理解为在所有情况下均是由术语“约”来修饰的。因此，除非有相反的说明，否则上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，本领域的技术人员能够利用本文所公开的教导内容寻求获得的所需特性，适当改变这些近似值。用端点表示的数值范围的使用包括该范围内的所有数字以及该范围内的任何范围，例如，1至5包括1、1.2、1.4、1.55、2、2.75、3、3.80、4和5等等。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素；术语“优选”指的是较优的选择方案，但不只限于所选方案。
试样准备
将破伤风载体蛋白用生理盐水将其稀释蛋白浓度80-120μg/ml，以此作为试样1。采用lowry法测定试样1的蛋白质含量，测试结果记为样M1。
将7F型衍生物原液用水进行适当稀释(稀释倍数为2倍)，至固体总量约为100μg/ml，作为试样2，按照蒽酮法测定试样2的多糖含量，测试结果记为M2。
实施例1
从准备好的试样中，取0.75ml试样1和0.75ml试样2，分别置于两根容量为50ml的离心管中。
向前述试样1和试样2中分别加入浓度为5mol/L的氯化钠溶液0.5ml，混匀后，于室温下静置2小时。
向经盐析处理后的试样1和试样2中分别加入9.0ml无水乙醇，得到混合液A1和混合液A2。
将所述混合液A1和混合液A2置于离心机中，在离心力为5500×g、温度为5℃的条件下，离心1小时，移除上清液，得到混合沉淀物1和混合沉淀物2。
分别向所述混合沉淀物1和混合沉淀物2中加入3ml水，得到混合液B1和混合液B2。
将混合液B1和混合液B2，置于离心机中，在将转速为4000rpm、温度为15℃的条件下，离心15分钟，收集上清液，得到测试液1和测试液2。
采用lowry法测定所述测试液1的蛋白质含量，记为M3；采用蒽酮法测定所述测试液2的多糖含量，记为M4。
为减少测量误差，共重复6次前述操作。
实施例2
从准备好的试样中，取0.75ml试样1和0.75ml试样2，分别置于两根容量为50ml的离心管中。
向前述试样1和试样2中分别加入浓度为5mol/L的氯化钠溶液0.5ml，混匀后，于室温下静置2小时。
向经盐析处理后的试样1和试样2中分别加入9.0ml无水乙醇，得到混合液A1和混合液A2。
将所述混合液A1和混合液A2置于离心机中，在离心力为6000×g、温度为5℃的条件下，离心1小时，移除上清液，得到混合沉淀物1和混合沉淀物2。
分别向所述混合沉淀物1和混合沉淀物2中加入3ml水，得到混合液B1和混合液B2。
将混合液B1和混合液B2，置于离心机中，在将转速为4000rpm、温度为15℃的条件下，离心15分钟，收集上清液，得到测试液1和测试液2。
采用lowry法测定所述测试液1的蛋白质含量，记为M3；采用蒽酮法测定所述测试液2的多糖含量，记为M4。
为减少测量误差，共重复6次前述操作。
实施例3
从准备好的试样中，取0.75ml试样1和0.75ml试样2，分别置于两根容量为50ml的离心管中。
向前述试样1和试样2中分别加入浓度为5mol/L的氯化钠溶液0.5ml，混匀后，于室温下静置2小时。
向经盐析处理后的试样1和试样2中分别加入9.0ml无水乙醇，得到混合液A1和混合液A2。
将所述混合液A1和混合液A2置于离心机中，在离心力为6500×g、温度为5℃的条件下，离心1小时，移除上清液，得到混合沉淀物1和混合沉淀物2。
分别向所述混合沉淀物1和混合沉淀物2中加入3ml水，得到混合液B1和混合液B2。
将混合液B1和混合液B2，置于离心机中，在将转速为4000rpm、温度为15℃的条件下，离心15分钟，收集上清液，得到测试液1和测试液2。
采用lowry法测定所述测试液1的蛋白质含量，记为M3；采用蒽酮法测定所述测试液2的多糖含量，记为M4。
为减少测量误差，共重复6次前述操作。
对比例1
从准备好的试样中，取0.75ml试样1和0.75ml试样2，分别置于两根容量为50ml的离心管中。
向前述试样1和试样2中分别加入浓度为5mol/L的氯化钠溶液0.5ml，混匀后，于室温下静置2小时。
向经盐析处理后的试样1和试样2中分别加入9.0ml无水乙醇，得到混合液A1和混合液A2。
将所述混合液A1和混合液A2置于离心机中，在离心力为5000×g、温度为5℃的条件下，离心1小时，移除上清液，得到混合沉淀物1和混合沉淀物2。
分别向所述混合沉淀物1和混合沉淀物2中加入3ml水，得到混合液B1和混合液B2。
将混合液B1和混合液B2，置于离心机中，在将转速为4000rpm、温度为15℃的条件下，离心15分钟，收集上清液，得到测试液1和测试液2。
采用lowry法测定所述测试液1的蛋白质含量，记为M3；采用蒽酮法测定所述测试液2的多糖含量，记为M4。
为减少测量误差，共重复6次前述操作。
方法有效性验证
根据以下公式计算蛋白沉降率和多糖回收率：
蛋白沉降率＝(1–4M3÷M1)×100％；
多糖回收率＝4M4÷2M2×100％。
当某个测定方法得到的蛋白沉降率≥90％且多糖回收率为80～120％时认为该测定方法有效，否则认为测定方法无效，以验证本申请提供的测定方法的有效性(具体结果见表1～8)：
表1-实施例1中蛋白沉降率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>3</sub>(μg/ml) 1.28 1.39 0.53 1.57 1.36 1.01
M<sub>1</sub>(μg/ml) 108.3 100.3 104.2 110.4 114.9 108.7
蛋白沉降率(％) 95.4 94.4 98.0 94.3 95.3 96.3
表2-实施例1中游离多糖回收率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>4</sub>(μg/ml) 53.6 51.4 53.2 51.7 49.8 50.3
M<sub>2</sub>(μg/ml) 112.1 112.2 112.5 117.2 112.4 112.9
多糖回收率(％) 95.6 91.6 94.6 88.2 88.6 89.1
表3-实施例2中蛋白沉降率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>3</sub>(μg/ml) 1.31 1.93 0.53 0.84 0.78 1.03
M<sub>1</sub>(μg/ml) 105.2 110.3 105.6 111.7 103.9 103.4
蛋白沉降率(％) 95.0 93.0 98.0 97.0 97.0 96.0
表4-实施例2中游离多糖回收率检测结果
Figure BDA0002610956270000061
Figure BDA0002610956270000071
表5-实施例3中蛋白沉降率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>3</sub>(μg/ml) 1.21 0.98 1.34 0.77 1.05 1.38
M<sub>1</sub>(μg/ml) 100.4 105.9 99.7 103.8 107.4 98.5
蛋白沉降率(％) 95.2 96.3 94.6 97.0 96.1 94.4
表6-实施例3中游离多糖回收率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>4</sub>(μg/ml) 56.0 53.8 54.2 52.8 51.9 54.5
M<sub>2</sub>(μg/ml) 118.3 115.9 116.4 110.4 115.5 114.4
多糖回收率(％) 94.7 92.8 93.1 95.1 89.9 95.3
表7-对比例1中蛋白沉降率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>3</sub>(μg/ml) 6.34 5.13 7.44 7.02 5.43 4.76
M<sub>1</sub>(μg/ml) 115.3 102.5 110.3 112.4 108.6 105.8
蛋白沉降率(％) 78 80 83 75 80 82
表8-对比例1中游离多糖回收率检测结果
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
M<sub>4</sub>(μg/ml) 31.5 37.5 43.0 34.4 32.1 39.0
M<sub>2</sub>(μg/ml) 98.7 96.9 98.1 105.3 99.1 104.6
多糖回收率(％) 64.1 77.4 87.7 65.3 64.8 76.4
由表1～8可以看出，实施例1～3所使用的测定方法均通过方法有效性验证，而对比例1未通过方法有效性验证；这可能是因为对比例1所使用的测定方法在第一次离心处理过程中的离心力不足，导致混合沉淀物分离不完全，从而对测定结果产生不利影响。
本发明提供的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，通过乙醇降低水溶液的介电常数使结合疫苗中的游离多糖脱水从来沉淀来游离多糖，并使结合疫苗中的多糖蛋白结合物发生不可逆变性来沉淀多糖蛋白结合物；再用水对产生的混合沉淀物复溶，由于乙醇使多糖蛋白结合物发生不可逆变性，此时混合沉淀物中只有游离多糖重新溶解；然后再进行离心处理收集复溶形成的游离多糖溶液用于测定结合疫苗中游离多糖的含量。
本发明提供的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，通过加入乙醇使结合疫苗中的多糖结合蛋白发生不可逆变性，以沉淀并分离结合疫苗中的多糖结合蛋白，从而减小结合疫苗中的多糖结合蛋白对游离多糖含量的测定的影响，以获得更准确的游离多糖含量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：对结合疫苗原液进行盐析处理；
步骤S2：向经盐析处理后的原液中加入无水乙醇，得到混合液A；
步骤S3：对所述混合液A进行离心处理，分离，得到多糖蛋白结合物和游离糖的混合沉淀物；
步骤S4：向所述混合沉淀物加水进行复溶，得到混合液B；
步骤S5：对所述混合液B进行离心处理，收集上清液作为测试液；
步骤S6：测定所述测试液的多糖含量，记为结合疫苗中的游离多糖含量。
2.根据权利要求1所述的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，所述步骤S1中的盐析处理方式为：向所述结合疫苗原液中加入浓度为4.5～6mol/L的氯化钠溶液，混匀后静置。
3.根据权利要求2所述的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，所述氯化钠溶液和结合疫苗原液的体积比为1:(1～2.5)。
4.根据权利要求1所述的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，所述步骤S2中的结合疫苗原液和无水乙醇的体积比为1:(8～16)。
5.根据权利要求1所述的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，所述步骤S3中的离心处理方式为：将所述混合液A置于离心机中，在离心力为(5500～6500)×g、温度为3～7℃的条件下，离心1～1.5小时。
6.根据权利要求1所述的结合疫苗中的游离多糖含量测定方法，其特征在于，所述步骤S5中的离心处理方式为：将所述混合液B置于离心机中，在转速为3000～5000rpm、温度为12～18℃的条件下，离心10～20分钟。
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