CN109400741A - 一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法，该方法包括将脱脂灵芝孢子粉，超声提取，板框过滤后，得到的滤液依次通过质量浓度为75％的乙醇和质量浓度为85％的乙醇进行沉淀过滤，得到的多糖对于动物移植性肿瘤的抑制作用显著。

Description

一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法

技术领域

本发明属于中药制药领域，具体地说，涉及一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法。

背景技术

灵芝是我国传统名贵中药材之一，被誉为“仙草”。在中华传统文化中，有着极高的美誉度。灵芝中的赤芝、紫芝，已被《中华人民共和国药典》所收载，明确其具有“补气安神，止咳平喘。用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食”等功能主治。

灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，由菌盖中弹射出来的灵芝的繁殖细胞即灵芝的种子。灵芝孢子具有增强机体免疫力、抑制肿瘤、保护肝损伤、抗辐射等多种功效，目前已广泛地应用于药品及保健食品中。

灵芝孢子中目前比较公认的有效成分为多糖类和三萜类。多糖为真菌目有的水溶性有效成分之一，经研究具有增强人体免疫细胞活性、抑制肿瘤细胞生成等多种作用。但天然真菌中所含多糖含量一般较低，如何将天然真菌多糖分离、纯化、富集，一直是近年来相关科研工作者努力的方向。

发明内容

本发明的目的是将灵芝孢子中的多糖类有效成分进一步浓缩精制，并富集为功效最强的分子量排布段，作为相应药品及保健食品的有效原料成分。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法，包括将脱脂灵芝孢子粉采用超声提取，板框过滤后，得到的滤液再依次通过质量浓度为75％的乙醇进行沉淀过滤和质量浓度为85％的乙醇进行沉淀过滤，取最终沉淀物。该最终沉淀物再加少量无水乙醇清洗，烘干。

上述所取用的脱脂灵芝孢子粉中含油脂＜1.0％，多糖＞1.2％。

上述脱脂灵芝孢子粉可以通过将新鲜的灵芝孢子破壁后，加入适量水挤压造粒，干燥后采用CO₂超临界萃取脱油得到；所述的CO₂超临界萃取方法优选为：萃取温度35～65℃，萃取压力20～35Mpa，萃取时间2～7小时，CO₂流量0.5～1m³/h。所述干燥温度优选为50℃～70℃，进一步优选60℃。

所述的超声提取为加入脱脂灵芝孢子粉1.5～2.3倍重量水，50℃～70℃超声提取，超声功率15～26千瓦，超声时间1～3小时；优选所述的超声提取为加入脱脂灵芝孢子粉2倍重量水，60℃超声提取，超声功率20千瓦，超声时间1小时。

上述通过质量浓度为75％的乙醇沉淀过滤具体如下：将板框过滤得到的滤液加入滤液2倍体积的质量浓度为75％乙醇，静置过夜，弃去沉淀物。

上述通过质量浓度为85％的乙醇沉淀过滤具体如下：取经质量浓度为75％的乙醇沉淀后得到的上清液缓慢加入95％乙醇至乙醇浓度达到85％，静置，过滤，取沉淀物。所述静置条件优选为4℃静置12小时。

现阶段的多糖制品多为未经分离、精制、筛选等优化工艺而制成的粗多糖制剂，不利于发挥多糖的最佳功效。粗多糖组成成分复杂，除主要含有多糖的不同组分外，还含有蛋白质、生物碱及其他水溶性成分等，有些多糖与色素、蛋白质结合，影响多糖的构象变化，相应多糖的活性会受明显的影响。此外，不同来源的多糖作用不一，配伍后同样存在协同作用。所以，多糖的不同提取纯化工艺影响着多糖的构成基础，从而对多糖的活性有一定程度的影响，因此控制其相对分子质量显得非常必要。

通过本发明可知，灵芝孢子多糖抑瘤活性与相对分子质量大小有关，相对分子质量在1000～500000之间的多糖成分活性较强，由此可见不同的多糖产生生物学活性有其最佳相对分子质量范围。

附图说明

图1HPGPC标准分子量拟合曲线

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明：

实施例1

a、采收新鲜的灵芝孢子破壁后，加入适量水挤压造粒，60℃烘干，CO₂超临界萃取脱油，采用的条件：萃取温度35℃，萃取压力30Mpa，萃取时间3小时，CO₂流量0.5m³/h得到脱脂灵芝孢子粉。

b、取脱脂灵芝孢子粉，加入脱脂灵芝孢子粉2倍重量水后，60℃超声提取，超声罐体积500m³，超声功率20千瓦，超声时间1小时，板框过滤，弃去滤渣，取过滤液，加入滤液2倍体积75％乙醇，静置过夜，弃去沉淀物；取上清液，继续缓慢加入质量浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到85％。4℃静置12小时，过滤，取沉淀物。加少量无水乙醇清洗，烘干后可得，收率为1.16％。

实施例2

a、采收新鲜的灵芝孢子破壁后，加入适量水挤压造粒，50℃烘干，CO₂超临界萃取脱油，采用的条件：萃取温度45℃，萃取压力20Mpa，萃取时间2小时，CO₂流量1m³/h。

b、取脱脂后灵芝孢子粉，加入脱脂灵芝孢子粉2.3倍重量水后，50℃超声提取，超声罐体积500m³，超声功率26千瓦，超声时间1小时，板框过滤，弃去滤渣，取过滤液，加入滤液2倍体积75％乙醇，静置过夜，弃去沉淀物；取上清液，继续缓慢加入质量浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到85％。4℃静置12小时，过滤，取沉淀物。加少量无水乙醇清洗，烘干后可得，收率为1.20％。

对比例1

a、采收新鲜的灵芝孢子破壁后，加入适量水挤压造粒，60℃烘干，CO₂超临界萃取脱油，采用的条件：萃取温度35℃，萃取压力30Mpa，萃取时间3小时，CO₂流量0.5m³/h。

b、取脱脂后灵芝孢子粉，加入2倍量水后，低温超声提取，超声罐体积500m3，超声功率20千瓦，超声时间1小时，板框过滤，弃去滤渣，取过滤液，加入2倍体积85％乙醇，静置过夜，取沉淀物，加少量无水乙醇清洗，烘干后可得，收率为5.37％。

对比例2粗多糖提取

将灵芝孢子粉加入蒸馏水，加入量使灵芝孢子成形为准，混匀，制成颗粒，自然干燥，用CO₂超临界萃取法去除其中的油脂类物质，采用的条件：萃取温度35℃，萃取压力30Mpa，萃取时间3小时，CO₂流量0.5m³/h。称取脱脂灵芝孢子10kg装入提取罐中，加150kg水，浸泡2小时，加热至沸，保持回流4小时，提取液离心，澄清过滤液浓缩至5kg，加入85％乙醇，静置24小时，使多糖沉淀，过滤，烘干后可得，收率为11.48％。

试验例1以下通过对动物移植性肿瘤的抑制作用的药效对本发明进行进一步说明：

1试验材料

1.1受试药物：本发明灵芝孢子多糖(按实施例1方法制备，简称1号)，灵芝孢子多糖(按对比例1方法制备，简称2号)，粗多糖(按对比例2方法制备，简称3号)。

1.2动物：ICR种小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中国药科大学动物实验室提供，饲料为颗粒饲料，饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。

1.3阳性药：环磷酰胺(CTX)，江苏盛迪医药有限公司。规格：0.2g/瓶。

2实验的主要内容

2.1 1号，2号，3号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。

2.2 1号，2号，3号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用。

3实验方法和步骤

3.1 1号，2号，3号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。

3.1.1给药途径：1号，2号，3号尾静脉注射(iv)

3.1.2给药周期：按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，停药后第2天处死解剖小鼠。

3.1.3剂量设置：共设6组，分别为：

空白对照组(生理盐水)

1号：3mg/kg

1号：1mg/kg

CTX：30mg/kg

粗多糖对照组：150mg/kg

2号：3mg/kg

3.1.4给药体积：0.4ml/20g

3.1.5实验方法：取上述规格小鼠60只按移植性肿瘤研究方法接种Heps实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。

3.1.6实验结果

结果见表3，结果表明，与空白对照组相比，1号(3mg/kg，1mg/kg)组iv给药可显著地抑制Heps的肿瘤生长作用(P＜0.01，P＜0.05)，同时对实验小鼠的体重有减低作用，但与阳性药CTX组相比，影响很小，且效果明显优于2号(3mg/kg)和粗多糖对照组(150mg/kg)。

表3 1号，2号，3号iv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n＝10)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01

3.2 1号，2号，3号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用

3.2.1给药途径：1号，2号，3号尾静脉注射(iv)

3.2.2给药周期：按移植性肿瘤研究法接种S180实体型，接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，停药后第2天处死解剖小鼠。

3.2.3剂量设置：共设6组，分别为：

空白对照组(生理盐水)

1号：3mg/kg

1号：1mg/kg

粗多糖对照组：150mg/kg

2号：3mg/kg

CTX：30mg/kg

3.2.4给药体积：0.4ml/20g

3.2.5实验方法：取上述规格小鼠60只按移植性肿瘤研究方法接种S180实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。

3.2.6结果见表4，结果表明，与空白对照组相比，1号(3mg/kg，1mg/kg)组iv给药均可显著地抑制S180的肿瘤生长作用(P＜0.01，P＜0.05)，同时对实验小鼠的体重有减低作用，但与阳性药CTX组相比，影响很小，且效果明显优于2号(3mg/kg)和粗多糖对照组(150mg/kg)。

表4 1号，2号，3号iv对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01

本发明对实施例1方法制备的多糖产品进行以下方面的质量测定：

一、硫酸蒽酮法检测该产品多糖含量

1样品溶液的配制

取样品取2g，精密称定，置于100ml量瓶中，加热水90ml，沸水浴中浸提2h，冷却至室温后，用水稀释并定容至刻度。过滤，精密量取续滤液2.0ml，加入乙醇30ml，摇匀，4℃放置12h，取出离心，倾去上清液，沉淀加水溶解，摇匀，定容到100ml，即为样品溶液。

2对照品溶液的配制

配制100mg/L葡萄糖溶液，精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、，分别置10ml的量瓶中，加水至2.0ml，再精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀，沸水浴中加热15分钟，取出，摇匀，冰水中冷却15分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法试验，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3多糖含量测定

精密量取供试品溶液2.0ml，置10ml的具塞试管中，照对照品溶液的配制项下的方法，自“加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中的葡萄糖的量，计算，即得。

根据标准曲线计算样品中多糖的含量，并结合样品的质量，经计算得到实施例多糖的含量92.0％.

二、高效凝胶过滤色谱法测定该产品分子量排布

1仪器与试药

HP1050高效液相色谱仪

sEDEX 75LT-ELsD蒸发光散射检测器

标准分子量多糖Dextran standard 4,900,000(MW4900000Da)，

Dextran standard 1,400,000(MW1394000Da)，

Dextran standard 670,000(MW668000Da)，

Dextran standard 410,000(MW409800Da)，

Dextran standard 270,000(MW273000Da)，

Dextran standard 150,000(MW147600Da)，

Dextran standard 80,000(MW80900Da)，

Dextran standard 50,000(MW48600Da)，

Dextran standard 12,000(MW11600Da)，

Dextran standard 5,000(MW5220Da)：Fluka公司

2色谱条件

色谱柱：shodex Ohpak sB-805HQ，shodex Ohpak sB-804HQ，300mm×8mm，日本昭和电工

流动相：重蒸水

流速：0.6ml/分钟

ELsD检测器漂移管温度：50℃

ELsD检测器压力：3.5bar

ELsD检测器gain值：7

色谱工作站：江申Js-3050型色谱工作站(带GPC软件)

3灵芝孢子多糖精制品的制备

取样品适量加水溶解成5％的糖溶液，加氨水调pH至7.8，离心去除沉淀，上清液加H₂O₂脱色，sevag法脱蛋白，透析，85％醇沉，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤3次，真空干燥，得三批类白色灵芝孢子多糖精制品。

4色谱柱的标定

取系列标准分子量多糖，制成2mg/ml水溶液，分别用0.45μm微孔滤膜过滤，各取20μl注入色谱仪。记录峰值保留时间，标定色谱柱，结果见表1。运用色谱工作站所带GPC软件，以保留时间对分子量的对数进行曲线拟合，拟合曲线见图1。

表1HPGPC标准曲线

5分子量及其分布的测定

取实施例灵芝孢子多糖，用水配制成5mg/ml的溶液，高速离心后取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取20μl注入色谱柱，记录色谱图。运用色谱工作站所带GPC软件计算灵芝多糖分子量及其分子量分布，结果见表2。

表2三批灵芝多糖分子量及其分布测定结果

Claims (9)

1.一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于包括将脱脂灵芝孢子粉采用超声提取，板框过滤后，得到的滤液再依次通过质量浓度为75%的乙醇进行沉淀过滤和质量浓度为85%的乙醇进行沉淀过滤，取最终沉淀物。

2.根据权利要求1所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的脱脂灵芝孢子粉是通过将新鲜的灵芝孢子破壁后，加入适量水挤压造粒，干燥后采用CO₂超临界萃取脱油得到的。

3.根据权利要求2所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的干燥温度为50℃～70℃。

4.根据权利要求2所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于该方法中所述的CO₂超临界萃取方法为：萃取温度为35～65℃，萃取压力为20～35Mpa，萃取时间为2～7小时，CO₂流量为0.5～1m³/h。

5.根据权利要求1所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的超声提取为加入脱脂灵芝孢子粉1.5～2.3倍量水，50℃～70℃超声提取，超声功率15～26千瓦，超声时间1～3小时。

6.根据权利要求1所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的通过质量浓度为75%的乙醇沉淀过滤具体如下：将板框过滤得到的滤液加入滤液2倍体积的75%乙醇，静置过夜，弃去沉淀物。

7.根据权利要求1所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的通过质量浓度为85%的乙醇沉淀过滤具体如下：取经质量浓度为75%的乙醇沉淀后得到的上清液缓慢加入95%乙醇至乙醇浓度达到85%，静置，过滤，取沉淀物。

8.根据权利要求7所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述静置条件为4℃静置12小时。

9.根据权利要求1所述的灵芝孢子多糖的分离纯化方法，其特征在于所述的最终沉淀物加少量无水乙醇清洗，烘干。