CN103819574B - 一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 - Google Patents
一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103819574B CN103819574B CN201410082755.0A CN201410082755A CN103819574B CN 103819574 B CN103819574 B CN 103819574B CN 201410082755 A CN201410082755 A CN 201410082755A CN 103819574 B CN103819574 B CN 103819574B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- addicted
- spot
- polysaccharide
- pore fungi
- karst
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 66
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 66
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 239000011148 porous material Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims abstract description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004132 diethyl ether Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 2
- 241000414064 Fomitiporia punctata Species 0.000 claims 9
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims 1
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 7
- -1 hydroxyl radical free radical Chemical class 0.000 abstract description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 241000414044 Fomitiporia Species 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 abstract 1
- 241000420786 Phellinus punctatus Species 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 description 2
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 229920000018 Callose Polymers 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000123107 Phellinus Species 0.000 description 1
- 241000222341 Polyporaceae Species 0.000 description 1
- 241000222383 Polyporales Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 description 1
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
一种从斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporia？punctata（P.Karst.）Murrill中提取的抗氧化多糖及其制备方法。本发明的抗氧化多糖是将斑嗜蓝孢孔菌子实体磨成粉后，经热水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冻干、离子交换和分子筛而获得。该抗氧化多糖为淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43，同时存在α和β两种构型。易溶于热水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂。该多糖具有较强的抗小鼠红细胞溶血和一定的清除DPPH、超氧阴离子及羟基自由基的作用。本发明中斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖为天然提取物，其制备方法简单，成本较低，纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种斑嗜蓝孢孔菌(Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill，俗名：斑褐孔菌、层卧孔菌)中提取的抗氧化多糖及其制备方法。
背景技术
我国真菌资源丰富，许多真菌作为珍贵的药、食两用菌受到广泛关注。随着对真菌资源开发和研究的不断深入，已从中分离获得了许多活性成分，诸如腺苷、甾醇类、有机酸、萜类等小分子活性物质，除此之外，还有多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等大分子化合物，具有良好的抗病毒、降血糖和增强免疫调节等功能，因此，食、药用真菌作为中草药中的“上上药”，其研究开发存在很大潜力。
斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill，属担子菌纲，非褶菌目，多孔菌科，主要分布在我国的吉林、辽宁、河北、陕西、江苏、浙江、湖北、湖南、福建、广西、江西、安徽、云南等地。一般寄生于栎、槭及其他阔叶树的树皮和腐木上，其子实体多年生，无菌盖，平伏贴生于基物表面可达20cm或更大。菌管多层，干时龟裂，每层厚约2～3mm，并逐年缩小，形成扁半球形的子实体，其总厚度达约15mm，管孔表面初期锈褐色，后期由于被灰色菌丝所充塞而变为淡烟色至棕灰色，子实体的边缘灰黑色，管孔壁厚，完整，管口呈圆形。
目前，虽然市场上已有将斑嗜蓝孢孔菌粗提物作为保健品的商品和治疗冠心病、心绞痛的药品销售，但对斑嗜蓝孢孔菌的药理活性成分的研究报道甚少，缺少相应的理论支撑。
本发明首次从斑嗜蓝孢孔菌子实体中分离纯化得到一种具有抗氧化活性的多糖。
发明内容
本发明目的在于提供斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill中的一种抗氧化多糖及其制备方法，该多糖具有一定的抗小鼠红细胞溶血、清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的生物活性。
本发明提供的从斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill中提取的抗氧化多糖为淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43，同时存在α和β两种构型，易溶于热水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂。
本发明涉及的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill中的抗氧化多糖是按照如下方法制备的：
（1）将斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体研成粉末，80～100℃热水浸提3～5h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体粗提液；
（2）斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体粗提液经旋转蒸发浓缩后，加入3～5倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀。于2～6℃放置过夜，10000～20000rpm离心20～30min，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill粗提物；
（3）将（2）步中得到的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill粗提物用蒸馏水复溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后装入分子截留量为3000～10000Da的透析袋中，在2～6℃，足量蒸馏水中透析，经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill多糖粗粉；
（4）将（3）步中得到的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill多糖粗粉溶解于10～100mMTris-Hcl(pH7.4)溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/LNaCl溶液连续梯度洗脱，收集洗脱峰；
（5）将洗脱峰上样于SephadexG-75分子筛，用蒸馏水洗脱，获得抗氧化多糖。
本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖采用HPLC-ELSD进行纯度和分子量的检测，证明其是分子量为151KDa的纯品。
本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖对小鼠红细胞溶血有较好的抑制作用，对DPPH、超氧阴离子及羟基自由基也具有一定的清除作用。
将上述斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill中抗氧化多糖命名为FPAPS（Fomitiporiapunctataantioxidantpolysaccharide）。
所述的斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖可应用于治疗氧化应激水平升高引起疾病的药物的制备。
本发明具有的优点和有益效果：
（1）本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖为天然提取物，具有良好的安全性；（2）本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖为纯品；（3）本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖具有良好的抗氧化效果；（4）本发明中斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖制备简单，成本低，适于大规模生产。
附图说明
图1是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的离子交换层析图。
图2是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的凝胶色谱层析图。
图3是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的HPLC-ELSD图。
图4是标准葡聚糖的分子量标准曲线图。
图5是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖对小鼠红细胞溶血的抑制作用图。
图6是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖对DPPH的清除作用图。
图7是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖对超氧阴离子清除作用图。
图8是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖对羟基自由基的清除作用图。
图9是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的红外光谱图。
图10是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的核磁共振氢谱图。
图11是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的200～400nm紫外扫描图。
图12是本发明Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill抗氧化多糖的HPLC-ELSD法单糖组成分析图。
图13是6种标准单糖的HPLC-ELSD法分析图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1、本发明抗氧化多糖的制备
（1）将斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体研成粉末，加入20倍体积蒸馏水混匀，于80℃恒温水浴提取5h，过滤所得滤渣再次提取，合并滤液，即斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体粗提液；
（2）斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill子实体粗提液经旋转蒸发浓缩，向其中加入4倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀。于4℃放置过夜，10000rpm离心20min，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill粗提物；
（3）将斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill粗提物用蒸馏水复溶，置于分液漏斗中，加入1/4体积Sevage试剂（三氯甲烷：正丁醇=4:1），剧烈震摇10min，静置30min，分液除去下层有机相和中间层白色絮状物，重复操作7次，取上层水相经旋转蒸发除去残留的有机溶剂。然后装入分子截留量为3500Da的透析袋中，在4℃，足量蒸馏水中透析2～3d，经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill多糖粗粉；
（4）将斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata（P.Karst.）Murrill多糖粗粉溶解于10mMTris-Hcl(pH7.4)溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/LNaCl溶液连续梯度洗脱，蒽酮-硫酸法跟踪监测每管洗脱液在620nm处的吸光值，得到洗脱曲线（图1），收集洗脱峰；
（5）将洗脱峰上样于SephadexG-75分子筛，用蒸馏水洗脱，蒽酮-硫酸法跟踪监测每管洗脱液在620nm处的吸光值，得到洗脱曲线（图2），收集洗脱峰获得抗氧化多糖。
实施例2、本发明抗氧化多糖的纯度和分子量测定
（1）将已知分子量的标准葡聚糖(DextranT-10、T-50、T-70、T-100、T-200)分别用双蒸水配制成浓度为1%的标准液，0.22μm滤膜过滤，本发明抗氧化多糖做同样处理。
（2）色谱条件：色谱柱为ShodexSUGARKS-804糖柱(8.0×300mm)；蒸发光散射检测器(ELSD)，柱温：室温；流动相：双蒸水；进样量：20μL；空压：3×105Pa
（3）分子量标准曲线绘制：将标准葡聚糖分别进样20μL，采集图谱，以分子量Mw为纵坐标，保留时间t为横坐标，绘制标准曲线（图4）。
（4）将抗氧化多糖进样20μL，采集图谱，根据出峰情况判定纯度，图3显示单一狭窄对称峰，可以判定该多糖为纯品，将保留时间6.6min代入标准曲线（图4），计算得到该多糖分子量为151kDa。
实施例3、本发明抗氧化多糖的清除DPPH自由基作用
（1）抗氧化多糖用无水甲醇做溶剂，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，DPPH用无水甲醇配制成终浓度为1×10-4mol/L的溶液。
（2）分别取上述多糖溶液0.06、0.12、0.18、0.3、0.6mL于1.5mL离心管中，用DPPH溶液补足1.2mL，等体积无水甲醇代替样品溶液的处理作为空白对照，抗坏血酸作为正对照，黑暗中放置30min。
（3）在517nm处测定各处理的吸光值，每个处理做3个平行。
（4）按“清除率=[1-(As-Ab)/Ai]×100%”公式计算DPPH清除率，其中Ai为不加样的DPPH溶液的吸光值，As为样品与DPPH反应后的吸光值，Ab为样品的吸光值。
该抗氧化多糖的清除DPPH自由基活性见图6，该图显示，在工作浓度为25～250ug/ml范围内，该多糖的DPPH自由基清除活性随着浓度的增大而升高，在250ug/ml时清除活性最高，为50.98%。
实施例4、本发明抗氧化多糖的超氧阴离子自由基清除作用
本研究采用1mLTris-HCl缓冲液（mM,pH8.0）的超氧阴离子产生体系，其中含有78uMNADH，50uMNBT，10uMPMS以及不同浓度的试样，以没食子酸作为正对照，用Tris-HCl补足1mL，在560nm测定超氧阴离子与NBT的颜色反应。
按“清除率=（A－A1）/A×100%”公式计算试样的超氧阴离子自由基清除率，其中A为对照体系的吸光值，A1为含试样体系的吸光值。
如图7所示，本发明抗氧化多糖在工作浓度为10～300ug/mL浓度范围内，随浓度升高，其超氧阴离子清除率先升高后下降，在200ug/mL时清除率最高为68.57%。
实施例5、本发明抗氧化多糖的红外光谱分析
取本发明抗氧化多糖2mg与KBr研磨混匀，压片，用红外光谱仪在4000～500cm-1波数范围内进行红外扫描。
结果如图9所示，表明样品在波数3420.23cm-1（O-H的伸缩振动），2924.40cm-1（C-H的伸缩振动）和1637.80cm-1（糖的水化物吸收峰）处均有多糖类物质的特征吸收峰。波数1400～1200cm-1范围内为C-H变角振动，它与C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收。波数889.23cm-1处为β-D-葡聚糖的特征吸收峰，表明该多糖以β-糖苷键为主，单糖组分中含有葡萄糖，1045.18cm-1和1080.23cm-1两处是呋喃糖环特征吸收峰，表明单糖是以呋喃糖苷的形式存在。
实施例6、本发明抗氧化多糖的单糖组成分析
将本发明抗氧化多糖酸水解成单糖后，用流动相（乙腈:水=70:30）配制成10mg/mL的溶液，色谱柱为NH2P-504E氨基柱，HPLC-ELSD法采集图谱（图12），图中显示4个峰值，出峰时间分别为5.2min、5.5min、6.2min和6.5min，表明该多糖的水解产物中有4种单糖成分。
同时，将六种标准单糖（阿拉伯糖、山梨醇、果糖、甘露糖、山梨醇和葡萄糖）用流动相配制成5mg/mL的标准液。首先单个进样，后混合进样，在同样条件下采集图谱，得到图13，自左至右依次为阿拉伯糖、果糖、山梨醇、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，出峰时间分别为5.2min、5.5min、5.6min、5.8min、6.2min和6.5min。根据出峰时间可判定，本发明抗氧化多糖的4种单糖组分为阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖，根据四种单糖的峰面积估计其比例约为1:6:29:43。
Claims (3)
1.一种斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill中提取的抗氧化多糖，所述的抗氧化多糖来自斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill，淡黄色粉末，分子量为151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4种单糖组成，比例为1:6:29:43。
2.权利要求1所述的斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill子实体研成粉末，80～100℃热水浸提3～5h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill子实体粗提液；
(2)将上步得到的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill子实体粗提液经旋转蒸发浓缩，加入3～5倍体积无水乙醇，边加边剧烈搅拌，产生沉淀；于2～6℃放置过夜，10000～20000rpm离心20～30min，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤沉淀数次，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill粗提物；
(3)将(2)步中得到的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill粗提物用蒸馏水复溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后装入分子截留量为3000～10000Da的透析袋中，在2～6℃，足量蒸馏水中透析，经冷冻干燥，即得斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill多糖粗粉；
(4)将(3)步中得到的斑嗜蓝孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill多糖粗粉溶解于10～100mMTris-HClpH7.4溶液中，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/LNaCl溶液连续梯度洗脱，收集洗脱峰；
(5)将洗脱峰上样于SephadexG-75分子筛，用蒸馏水洗脱，获得抗氧化多糖。
3.权利要求1所述的斑嗜蓝孢孔菌抗氧化多糖在制备用于治疗因自由基引起氧化应激水平升高导致疾病的药物方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410082755.0A CN103819574B (zh) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | 一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410082755.0A CN103819574B (zh) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | 一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103819574A CN103819574A (zh) | 2014-05-28 |
| CN103819574B true CN103819574B (zh) | 2016-02-03 |
Family
ID=50754894
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410082755.0A Expired - Fee Related CN103819574B (zh) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | 一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103819574B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754427B (zh) * | 2017-01-20 | 2023-05-02 | 山西省农业科学院食用菌研究所 | 嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化方法 |
| CN110063394A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-07-30 | 山西省农业科学院食用菌研究所 | 一种纯天然营养免疫保健固体饮料虫草茶的配制方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020023518A (ko) * | 2000-09-22 | 2002-03-29 | 이태규 | 버섯 추출물을 코팅한 곡물과 그 코팅방법 |
| CN1579414A (zh) * | 2004-03-04 | 2005-02-16 | 江卫世 | 注射用灵孢多糖及其制备工艺 |
| CN102617745A (zh) * | 2012-03-05 | 2012-08-01 | 广东省微生物研究所 | 灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能 |
-
2014
- 2014-03-07 CN CN201410082755.0A patent/CN103819574B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020023518A (ko) * | 2000-09-22 | 2002-03-29 | 이태규 | 버섯 추출물을 코팅한 곡물과 그 코팅방법 |
| CN1579414A (zh) * | 2004-03-04 | 2005-02-16 | 江卫世 | 注射用灵孢多糖及其制备工艺 |
| CN102617745A (zh) * | 2012-03-05 | 2012-08-01 | 广东省微生物研究所 | 灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "四种多孔菌子实体粗多糖抗肿瘤活性的比较研究";张媛，等;《菌物学报》;20140115;第33卷(第1期);第114-120页 * |
| "稀针嗜蓝孢孔菌多糖分析方法研究";朱胤龙，等;《中国实验方剂学杂质》;20080930;第14卷(第9期);第1-3页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103819574A (zh) | 2014-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ker et al. | Structural characteristics and antioxidative capability of the soluble polysaccharides present in Dictyophora indusiata (Vent. Ex Pers.) Fish Phallaceae | |
| CN102617745B (zh) | 灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能 | |
| CN102584963B (zh) | 一种活性灵芝多糖肽对照品、制备方法及应用 | |
| CN109400741B (zh) | 一种灵芝孢子多糖的分离纯化方法 | |
| CN106317246A (zh) | 一种黄褐牛肝菌中的抗氧化多糖及其制备方法及用途 | |
| CN103804507A (zh) | 马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用 | |
| CN104211633B (zh) | 异吲哚类化合物及其应用 | |
| CN102749299A (zh) | 一种中药组合物枸杞消渴制剂的质量检测方法 | |
| CN102621260B (zh) | 一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测方法 | |
| CN101839863A (zh) | 灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法 | |
| CN103239467B (zh) | 姬松茸多糖及其制备方法 | |
| CN102408494B (zh) | 一种灰树花多糖zzk组分及其制备方法 | |
| CN105663444A (zh) | 一种复方免疫增强及抗衰老剂及其制备方法 | |
| CN103494844B (zh) | 黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用 | |
| CN103819574B (zh) | 一种从斑嗜蓝孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制备方法 | |
| CN108250320A (zh) | 一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法 | |
| CN103275237B (zh) | 一种茄枝多糖的制备方法及其应用 | |
| CN104877037B (zh) | 一种蝙蝠草多糖分离纯化方法及其产品和应用 | |
| CN105566509A (zh) | 一种具有体内抗氧化活性的点柄粘盖牛肝菌子实体多糖及其制备方法 | |
| CN101838336A (zh) | 一种治疗ⅱ型糖尿病的湖北麦冬均一多糖及其制备方法 | |
| CN103183740A (zh) | 一种北五味子多糖的生产方法 | |
| CN104316603B (zh) | 猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法 | |
| CN104119427A (zh) | 一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN106946998A (zh) | 一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖ccpp‑1及其制备方法和用途 | |
| CN113717296A (zh) | 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160203 |