CN103275237B - 一种茄枝多糖的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茄枝多糖的制备方法。采用的技术方案是：将茄子根茎预处理，乙醇脱脂，然后加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时，乙醇沉淀后得到茄枝多糖粗品；采用酶解与三氯乙酸试剂相结合的方法除蛋白，得到纯化的茄枝多糖；将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，采用DEAE-D22纤维素柱和Sephadex G-100柱对多糖混合物进行分离纯化，得到了组分相对单一的分离纯化后的茄枝多糖。本发明解决了植物多糖原材料珍贵稀少，解决生产成本高和提取工艺不足的问题，不仅原材料简单易得，而且设计出最佳的提取工艺，最终所获得的茄枝多糖具有抗氧化和提高免疫的生物活性，为茄枝多糖应用到食品，药品生产领域中，提供新的原材料和生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物多糖的制备方法，尤其涉及从茄子根茎中提取茄枝多糖的方法。
背景技术
目前，已知的天然多糖生物聚合物约有300多种。由于多糖本身及其复合物的复杂性，与蛋白质，核酸相比较，我国对多糖的研究起步较晚，重视程度不够。但近年来随着生物化学的快速发展，对多糖的结构及其生物活性分析越来越深入，逐渐发现多糖对人体具有极大的利用价值。近年来，大量的实验结果表明，植物多糖有调节免疫﹑抗氧化﹑抗菌﹑抗辐射﹑抗病毒﹑降低血糖﹑调节血脂和降胆固醇等生理功能，具有高效低毒的特点。据不完全统计，目前全球至少有30余个多糖已进入到抑制肿瘤，抗艾滋病及糖尿病治疗等临床试验阶段。另外，多糖可以改善食品的食用品质，提高加工特性和感官特性，可用作乳化剂，稳定剂及抗氧化剂。
但是，很多植物多糖的原材料来源较为稀少，大多数原材料为名贵的中草药，珍稀的植株花草，作为生产的原材料来说，生产成本较高，而且，对于植物多糖的组成分析，生物活性作用机制还并不深入，近年来对植物多糖的提取工艺的研究方法有很多，可根据需要，进行溶剂处理，酶法处理，微波加热处理，超声波处理，酸碱处理等。但不同的提取方法都有一定的缺点，比如利用酸碱溶剂法提取，当酸碱浓度发生变化时，极易破坏多糖的空间结构及活性；高温，高压等条件下提取的植物多糖，其多糖得率和生物活性不稳定，因此需要寻求一种能够考虑到能耗及植物多糖最佳得率，且条件相对温和稳定的提取工艺。
发明内容
本发明的目的在于，解决植物多糖原材料珍贵稀少，提出一种可以解决生产成本高和提取工艺不足的从茄子根茎中提取多糖的方法。不仅原材料简单易得，而且设计出最佳的提取工艺，并证明茄枝多糖所具有的抗氧化和提高免疫的生物活性，为茄枝多糖应用到食品，药品生产领域中，提供新的原材料和生产工艺。
为了实现本发明的目的，本发明采用的是如下技术手段：一种茄枝多糖的制备方法，方法如下：
(1)预处理：将茄子根茎洗净，烘干，粉碎，得茄子根茎粉；
(2)脱脂：取茄子根茎粉，加入乙醇，加热回流，弃去溶剂，剩余残渣自然风干，得脱脂后的茄子根茎粉；
(3)提取：向脱脂后的茄子根茎粉中加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时后，过滤，滤液浓缩，再将浓缩液与乙醇混合，于4℃环境静置，离心分离，沉淀冷冻干燥，得到茄枝多糖粗品；
(4)纯化：将茄枝多糖粗品溶于蒸馏水中，加入三氯乙酸溶液，4℃静置，过滤，得滤液，向滤液中加入滤液重量5-10%的木瓜蛋白酶，调节pH=5，60℃酶解1小时，得产物，产物冷冻干燥即为纯化的茄枝多糖；
(5)分离：将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，上样于DEAE-D22纤维素柱上，用梯度混合器配制成浓度为0—2mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，每2ml收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，透析除盐，再上样于Sephadex G-100柱，以双蒸水为洗脱剂，以1ml/min的流速进行洗脱，每2mL收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，旋蒸浓缩，冻干，即得分离纯化后的茄枝多糖。
上述的一种茄枝多糖的制备方法，优选的制备方法如下：
(1)预处理：将茄子根茎洗净，烘干，粉碎，得茄子根茎粉；
(2)脱脂：取茄子根茎粉，加入茄子根茎粉10倍体积的95%乙醇，加热回流2次，每次2小时，弃去溶剂，剩余残渣自然风干，得脱脂后的茄子根茎粉；
(3)提取：向脱脂后的茄子根茎粉中，按料液比1:80加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时后，过滤，滤液浓缩，再将浓缩液与75%乙醇按1:3体积比混合，于4℃环境静置12小时，离心分离，沉淀冷冻干燥，即得到茄枝多糖粗品；
(4)纯化：将茄枝多糖粗品与蒸馏水，按料液比1:30混合溶解，然后向茄枝多糖粗品溶液中加入等体积的7%三氯乙酸溶液，充分混匀，4℃静置4小时，过滤，得滤液，向滤液中加入滤液总重量7%的木瓜蛋白酶，调节pH=5，60℃酶解1小时，得产物，产物冷冻干燥，即为纯化的茄枝多糖；
(5)分离：将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，制备成10mg/ml的溶液，上样于DEAE-D22纤维素柱上，用梯度混合器配制成浓度为0—2mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂，通过梯度洗脱器与恒流泵，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，并且每2ml收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，透析除盐，冻干，再将冻干后的产物溶于双蒸水中，配制成浓度为10mg/ml的溶液，再上样于Sephadex G-100柱，以双蒸水为洗脱剂，通过恒流泵，以1ml/min的流速进行洗脱，每2mL收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，旋蒸浓缩，冻干，即得分离纯化后的茄枝多糖。
本发明的有益效果：
（1）本发明中使用茄子根茎作为多糖提取的原材料，与其它原材料相比，成本低廉，简单易得，易保存；
（2）本发明中使用的提取方法工艺简单，成本低，无污染，能够提高原材料的利用率，提高茄枝多糖浸提率，浸提率可达到2.87%，易于应用到工业生产中；
（3）采用酶解与三氯乙酸试剂相结合的方法除蛋白，提高了茄枝多糖蛋白清除率和降低了多糖的损失率；
（4）采用纤维素柱层析（DEAE-D22纤维素柱）和葡聚糖凝胶层析法（Sephadex G-100柱）对多糖混合物进行分离纯化，得到了组分相对单一的茄枝多糖，不仅可以提高茄子根茎研究与开发的技术水平和茄子加工企业的经济效益，同时也为茄枝多糖产品的开发与产业转化奠定了一定的基础；
（5）通过小鼠体内，体外抗氧化实验和小鼠皮淋巴细胞增殖实验，证明了经过水提，分离纯化后的茄枝多糖具有抗氧化与提高免疫力的生物活性功能，为茄枝多糖在食品，药品领域中，制备具有抗氧化、提高免疫力的药品、食品或保健品，提供了可靠的科学依据。
（6）本发明开发出一种新的可利用的多糖提取原材料，设计出了一种可以大幅度的提高由茄子根茎中提取出的茄枝多糖的提取和分离纯化工艺，并且开发出茄枝多糖可利用的生物活性功能，有效的提高了原材料的利用率，降低生产成本，其工艺路线简单，设备投入少，易于工业化，是一种茄子根茎加以回收利用的有效方法。
附图说明
图1是DEAE-D22纤维素柱洗脱后，管与吸光度的曲线图。
图2是Sephadex G-100柱洗脱后，管与吸光度的曲线图。
具体实施方式
实施例1
一种茄枝多糖的制备方法，步骤如下：
（1）预处理：将茄子根茎清洗，晾干，粉碎，过60目筛，得茄子根茎粉；
（2）乙醇脱脂：取茄子根茎粉500g，加入茄子根茎粉10倍体积的95%乙醇，加热回流2小时，弃去乙醇溶剂；残渣再次加入残渣10倍体积的95%乙醇，加热回流2小时，弃去乙醇溶剂，剩余残渣清洗去除乙醇后，自然风干，得脱脂后的茄子根茎粉，备用；
（3）提取：取脱脂后的茄子根茎粉，按照料液比1:80（料液比即，1g脱脂后的茄子根茎粉加入80ml蒸馏水）加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时后，过滤，滤液浓缩至1/3体积，得浓缩液；
（4）乙醇沉淀：将浓缩液与75%乙醇按1:3体积比混合，于4℃环境静置12小时，离心分离，沉淀冷冻干燥，即得到茄枝多糖粗品，其茄枝多糖提取率为2.87％；
（5）纯化：取茄枝多糖粗品5g，溶于150ml蒸馏水中，微热溶解，加入茄枝多糖粗品溶液等体积的质量浓度为7%的三氯乙酸溶液，充分混匀，4℃静置4小时，过滤，得滤液；于滤液中加入滤液总重量7%的木瓜蛋白酶，调节pH=5，60℃酶解1小时，得产物，产物冷冻干燥，即为纯化的茄枝多糖；
（6）分离：将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，制备成10mg/ml的溶液，离心，过滤，移取5mL滤液上样于已经平衡好的DEAE-D22纤维素柱上，用梯度混合器配制成浓度为0—2mol/L的Nacl溶液作为洗脱剂，通过恒流泵，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，并且每2ml收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，共收集130管，测定每管中溶液的吸光度值，以管为横坐标，吸光度值为纵坐标，做出曲线，如图1所示，合并主峰（吸光度对应值为：0.285-2.432-0.287）所对应的所有管的溶液，经过透析除盐，冻干，再将冻干后的产物以双蒸水配制成浓度为10mg/ml的溶液，上样于已经过平衡的Sephadex G-100柱，以双蒸水为洗脱剂，通过恒流泵，以1ml/min的流速进行洗脱，每2mL收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，共收集100管，测定每管中溶液的吸光度值，以管为横坐标，吸光度值为纵坐标，做出曲线，如图2所示，合并主峰（吸光度对应值为：0.285-3.5-0.286）所对应的所有管的溶液，经旋蒸浓缩，冻干即得分离纯化后的茄枝多糖。
实施例2
（一）检测
将实施例1获得的分离纯化后的茄枝多糖用1mol/L的浓硫酸完全水解，BaCO3中和至中性，浓缩，过滤，离心取上清制备成分离纯化后的茄枝多糖样品，同样操作制备甘露糖，半乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，木糖，果糖单糖标准品。
作薄层层析，同时将分离纯化后的茄枝多糖样品和六种单糖标准品进行柱前衍生化，进行高效液相色谱分析，记录保留时间，通过薄层层析与高效液相色谱法分析证明，本发明的方法制备的分离纯化后的茄枝多糖是由甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖组成。
（二）抗氧化和免疫试验
（1）茄枝多糖体外抗氧化：
将实施例1获得的分离纯化后的茄枝多糖配制成0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml系列浓度的水溶液，同时配制相同系列浓度的抗坏血酸水溶液（Vc）作对照，通过Fenton实验测定茄枝多糖对羟基自由基·OH清除能力，结果如表1。
表1茄枝多糖对羟基自由基（·OH）清除能力的测定
由表1可见，茄枝多糖具有清除羟基自由基（·OH）的活力。
将实施例1获得的分离纯化后的茄枝多糖配制成0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml系列浓度的水溶液，同时配制相同系列浓度的抗坏血酸水溶液（Vc）作对照，通过邻苯三酚自氧化实验测定茄枝多糖对超氧阴离子自由基O2 -清除能力，结果见表2。
表2茄枝多糖对超氧阴离子自由基O2 -．清除能力的测定
由表2可见，茄枝多糖具有清除超氧阴离子自由基（O2 -）的能力。
（2）茄枝多糖体内抗氧化：
取昆明种小鼠50只，随机分成5组，每组10只，除空白组外，其它每组小鼠腹腔注射环磷酰胺，连续腹腔注射5天。
给药：空白组，模型组（喂食水），阳性对照组（香菇多糖组），茄枝多糖高剂量（200mg·kg-1·d-1），低剂量组（50mg·kg-1·d-1），连续给药30天，眼球取血，离心取血清测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）含量和丙二醛（MDA）含量，结果见表3。
表3 茄枝多糖对血清中SOD、MDA水平的影响
注：与模型组比较＊＊P﹤0.01
由表3可见，茄枝多糖能够影响小鼠体内SOD、MDA水平，即在体内具有抗氧化的作用。
（3）茄枝多糖体内免疫：
取昆明种小鼠50只，随机分成5组，每组10只，除空白组外，其它每组小鼠腹腔注射环磷酰胺，连续腹腔注射5天。
给药：空白组，模型组（喂食水），阳性对照组（香菇多糖组），茄枝多糖高剂量（200mg·kg-1·d-1），低剂量组（50mg·kg-1·d-1），连续给药30天，取各组小鼠脾脏，通过测定脾淋巴细胞转化率，检测茄枝多糖对小鼠免疫功能的影响，结果见表4。
表4茄枝多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
注：与空白组比较**P﹤0.01
由表4可见，茄枝多糖具有提高小鼠免疫细胞增殖的能力，效果与香菇多糖相当。
Claims (3)
1.一种茄枝多糖的制备方法，其特征在于制备方法如下：
(1)预处理：将茄子根茎洗净，烘干，粉碎，得茄子根茎粉；
(2)脱脂：取茄子根茎粉，加入乙醇，加热回流，弃去溶剂，剩余残渣自然风干，得脱脂后的茄子根茎粉；
(3)提取：向脱脂后的茄子根茎粉中加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时后，过滤，滤液浓缩，再将浓缩液与乙醇混合，于4℃环境静置，离心分离，沉淀冷冻干燥，得到茄枝多糖粗品；
(4)纯化：将茄枝多糖粗品溶于蒸馏水中，加入三氯乙酸溶液，4℃静置，过滤，得滤液，向滤液中加入滤液重量5-10%的木瓜蛋白酶，调节pH=5，60℃酶解1小时，得产物，产物冷冻干燥即为纯化的茄枝多糖；
(5)分离：将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，上样于DEAE-D22纤维素柱上，用梯度混合器配制成浓度为0—2mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，每2ml收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，透析除盐，再上样于Sephadex G-100柱，以双蒸水为洗脱剂，以1ml/min的流速进行洗脱，每2mL收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，旋蒸浓缩，冻干，即得分离纯化后的茄枝多糖。
2.如权利要求1所述的一种茄枝多糖的制备方法，其特征在于制备方法如下：
(1)预处理：将茄子根茎洗净，烘干，粉碎，得茄子根茎粉；
(2)脱脂：取茄子根茎粉，加入茄子根茎粉10倍体积的95%乙醇，加热回流2次，每次2小时，弃去溶剂，剩余残渣自然风干，得脱脂后的茄子根茎粉；
(3)提取：向脱脂后的茄子根茎粉中，按料液比1:80加入蒸馏水，温度60℃浸提2小时后，过滤，滤液浓缩，再将浓缩液与75%乙醇按1:3体积比混合，于4℃环境静置12小时，离心分离，沉淀冷冻干燥，即得到茄枝多糖粗品；
(4)纯化：将茄枝多糖粗品与蒸馏水，按料液比1:30混合溶解，然后向茄枝多糖粗品溶液中加入等体积的7%三氯乙酸溶液，充分混匀，4℃静置4小时，过滤，得滤液，向滤液中加入滤液总重量7%的木瓜蛋白酶，调节pH=5，60℃酶解1小时，得产物，产物冷冻干燥，即为纯化的茄枝多糖；
(5)分离：将纯化的茄枝多糖溶于双蒸水中，制备成10mg/ml的溶液，上样于DEAE-D22纤维素柱上，用梯度混合器配制成浓度为0—2mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂，通过恒流泵，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，并且每2ml收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，透析除盐，冻干，再将冻干后的产物溶于双蒸水中，配制成浓度为10mg/ml的溶液，再上样于Sephadex G-100柱，以双蒸水为洗脱剂，通过恒流泵，以1ml/min的流速进行洗脱，每2mL收集一管，用苯酚—硫酸法跟踪检测至无糖，测定每管中溶液的吸光度值，合并主峰所对应的所有管的溶液，旋蒸浓缩，冻干，即得分离纯化后的茄枝多糖。
3.按照权利要求1或2所述的方法制备的分离纯化后的茄枝多糖在制备具有抗氧化、提高免疫力的药品、食品或保健品中的应用。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |