CN1602200A - 具有免疫刺激剂活性的植物提取物 - Google Patents

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Abstract

一种具有免疫刺激、抗病毒和/或抗细菌活性的物质，该物质可通过用水从薯蓣科(Dioscoreaceae)、车前科(Plantaginaceae)或茄科(Solanaceae)科捣碎的植物原材料中提取而获得，且该物质是分子量为1200－40000kD且葡萄糖对糖醛酸的重量比例为1到2－4的水溶性酸性肽聚糖。

Description

具有免疫刺激剂活性的植物提取物
发明领域
本发明涉及具有免疫刺激剂活性的植物提取物。
发明背景
已通过如下程序生产了生物活性的多糖，即捣碎马铃薯球茎的芽、用沸水进行提取、在20℃维持16-18小时、分离提取物、放置不少于20日、根据分子量进行分级分离和提取具有超过10000道尔顿分子量的物质，随后进行浓缩和干燥(RU 2108800 C1，A61K 35/78，20.04.1998)。在该途径中产生的物质具有抗病毒和抗细菌活性。
已通过如下程序生产了具有免疫刺激活性的多糖，即用含水的甲醛处理植物材料、置于含水的酸中、用含水的草酸铵提取果胶多糖并冻干。将新鲜的水生有花植物如浮萍属(Lemna spp)杂草的任何物种和高等植物如Oberna behen(L)精细剪切的“水面上”部分用作原材料(RU2149642 C1，A61K 35/78，27.05.2000)。
L.A.Chekanovskaya和A.V.Generalov公开了来自马铃薯Solanumtuberosum芽的提取物和生物活性制剂“γ-植物”特征，参见Chem.Pharm Journal(2000)  34(3)：51-56。其生产包括捣碎原材料、用沸水进行提取、对水相提取物进行离心、用丙酮进行浓缩和沉淀、精制和干燥终产物。精制是常规的，且包含透析、在AcA44上的凝胶过滤、离子交换层析和在最终阶段的HPLC。用该方法产生的物质是分子量为70kD的糖蛋白，该糖蛋白包含90％的糖类和10％的蛋白质。γ-植物中的糖类部分由70％葡萄糖、3.7％阿拉伯糖、2.08％木糖、6.84％半乳糖、0.58％甘露糖、1％氨基糖(aminosaccharide)和5.1％糖醛酸组成。
发明概述
根据本发明，可从薯蓣科、车前科或茄科捣碎的植物原材料中提取具有免疫刺激、抗病毒和抗细菌活性的新物质。具体地，将水相提取物进行离心，然后在氯化钠存在时用96％的乙醇浓缩和沉淀。将沉淀溶解并再次用盐或酸进行沉淀，并将这样获得的粗酸性肽聚糖用碱或碱金属盐的饱和溶液进行处理；将纯化的酸性肽聚糖用凝胶层析进行精制，然后进行干燥。
这种依赖于特定操作顺序的方法得到了具有强的免疫刺激、抗病毒和抗细菌活性的新物质，且该物质是分子量为1200-40000kD且葡萄糖对糖醛酸的重量比例为1到2-4的水溶性酸性肽聚糖。一种药物组合物可包含该肽聚糖连同一种或多种药物可接受的填充物和/或载体。
优选实施方案描述
给定的方法优选应用植物的叶、茎、根、球茎和/或芽。可应用植物在其发育到成熟的任何阶段的不同部分。
在次级沉降过程中，优选地将溴棕三甲铵和氯化钙用作盐。可将有机或无机酸或酸性非有机盐用作酸性剂。次级沉降使得粗酸性肽聚糖能够同各种伴随的多糖和蛋白质相分离。
酸性肽聚糖产物可用如凝胶层析进行纯化；TSK HW-75F、琼脂糖2B或4B CL是适当的层析剂。
新物质的肽部分构成了全部肽聚糖分子质量的13±3％。用牛血清白蛋白作为标准应用劳里方法测量了肽的量(Lowry等人，J.Biol.Chem(1951)193：265-275)。获得了如表1所示的分析(显示了5种主要的氨基酸)。
表1
氨基酸  ％质量
 Asp  10,6
 Thr  5,6
 Ser  10,3
 Glu  11,1
 Gly  8,9
 Ala  12,5
 Val  5,9
 Ile  2,8
 Leu  5,0
 Tyr  1,3
 Phe  2,6
 His  19,0
 Lys  1,8
 Arg  2,6
分子的多糖部分发现由下面成分组成：
半乳糖醛酸              18±6％
葡萄糖                  9±3％
半乳糖                  5.5±2％
甘露糖                  0.7±0.25％
阿拉伯糖                3.8±1.3％
鼠李糖                  1.9±0.9％
酸性糖根据在浓缩硫酸中与3，5-二甲基苯酚的颜色反应确定(Usov等人，Botanica Marina(1995)，38：43-51)。应用糖醛酸的气液层析法(GLC)发现在酸性肽聚糖中半乳糖醛酸主要以3-甲基甲硅烷基衍生物的形式存在(Albersheim，Methods Enzymol.(1987)118：3-40)。用多元醇乙酸盐形式的糖的GLC分析探测中性糖(Ablersheim，同上)。
如在下文中报道的结果所显示的，本发明的物质具有各种有益的性质。它可用于人或其他哺乳动物或动物疾病的治疗(包括预防)，该疾病可由任何增强的抗体合成或活化的巨噬细胞、单核细胞、NK-细胞、粒细胞或细胞因子或干扰素合成来改善。这种疾病是本领域技术人员公知的。
在应用中，该物质一般将制备为包含可接受的载体的药物组合物。适当的载体(可为液体的)的例子是本领域中众所周知的，且将根据所需给药途径进行选择。途径和同样的剂量可易于由本领域技术人员根据通常的因素进行选择，该因素如疾病的严重性、患者的状况、其他治疗等。对这些因素的指南由下文的实施例提供。
下面的实施例阐明本发明。
实施例1
使来自薯蓣科的山药(dioscorea)(D.cuacasia Lipsky)根部分的植物细胞生长于培养基中。在培养阶段结束时，通过过滤分离细胞物质，并将上清液浓缩、用蒸馏水进行透析及冷冻干燥。
将500ml蒸馏水加入到从培养液中产生的5g干燥混合物中。在室温进行3小时的提取。用离心将不溶的沉淀除去。将上清液浓缩到200ml的体积；将200mg氯化钠溶解于其中，然后添加600ml 96％的乙醇。通过在4000rpm离心30分钟提取沉淀。然后将沉淀用50ml 96％的乙醇洗涤、离心并在气流中干燥。
通过在室温混合1小时而将如上所述获得的1g干产物在200ml蒸馏水中稀释。向该溶液中加入5ml 10％的三氯乙酸溶液。将结果所得的沉淀即酸性粗肽聚糖通过离心进行分离，并用水进行洗涤。然后加入50ml蒸馏水，且在混合的同时，逐滴加入25％的氨溶液直到实现沉淀的完全溶解。
将产生的溶液引入到TSK HW-75F柱中以进行凝胶层析。用水使级分从柱子中洗脱。收集分子量在1200和40000kD之间的第一个高分子量峰。将该级分在旋转蒸发器中浓缩并冻干。
酸性肽聚糖的产量为39mg。葡萄糖与糖醛酸的重量比例为1∶3。肽含量为11.2％。
实施例2
将100g来自薯蓣科的山药(Q.cuacasia Lipsky)新鲜的茎捣碎。加入500ml蒸馏水，并将捣碎的产物在30-40℃进行5小时的提取。将混合物用机械压力挤压，并将水相提取物收集、透析并用蒸发器将其浓缩至100ml体积。向浓缩物中加入100mg氯化钠，然后也加入300ml 96％的乙醇。通过在4000rpm离心30分钟提取沉淀。然后将沉淀用30ml 96％的乙醇洗涤、离心并在气流中干燥。
通过在室温混合1小时而将上面获得的1g干燥沉淀在200ml蒸馏水中稀释。去除不溶性部分并向上清液添加5ml浓缩的HCl。将结果所得的沉淀通过离心进行分离并在水在中进行洗涤。然后加入50ml蒸馏水，且在混合的同时，逐滴加入25％的氨溶液直到实现沉淀的完全溶解。
用水使级分从柱子中洗脱。收集分子量在1200和40000kD之间的第一个高分子量峰。将该级分在蒸发器中浓缩并然后冻干。
酸性肽聚糖的产量为16mg。葡萄糖与糖醛酸的重量比例为1∶2.2。肽含量为14.7％。
实施例3
将100g来自车前科(P.major L.)的新鲜收获的车前草叶在500ml蒸馏水中捣碎，并在30-40℃加热的同时进行4小时的提取。将混合物用机械压力挤压，并将水相提取物收获、透析并用蒸发器将其浓缩至100ml体积。向浓缩物中加入100mg氯化钠，然后也加入300ml 96％的乙醇。通过在4000rpm离心30分钟提取沉淀。然后将沉淀用30ml96％的乙醇洗涤、离心并在气流中干燥。
通过在室温混合1小时而将1g干产物在200ml蒸馏水中稀释。去除不溶性部分并向上清液添加5ml浓缩的HCl。将产生的沉淀通过离心进行分离并在水在中进行洗涤。然后加入50ml蒸馏水，且在混合的同时，逐滴加入25％的氨溶液直到实现沉淀的完全溶解。
将结果所得的溶液引入到TSK HW-75F柱中以进行凝胶层析。用水使级分从柱子中洗脱。收集分子量在1200和40000kD之间的第一个高分子量峰。将该级分在蒸发器中浓缩并然后冻干。
酸性肽聚糖的产量为16mg。葡萄糖与糖醛酸的重量比例为1∶2.7。肽含量为13.8％。
实施例4
除应用200ml浓的NH4NO3或(NH4)2SO4溶液代替5ml浓HCl以提取酸性肽聚糖之外，重复实施例3。
终产物产量为14mg。葡萄糖与糖醛酸的质量相关性为1∶2.4。肽含量为15.8％。
实施例5
将5kg来自茄科的马铃薯(S.tuberosum)芽用10L水捣碎并在室温于搅拌的同时进行2小时的提取。将混合物用机械压力挤压。将水相提取物透析并用10kD中空纤维柱体通过超滤而浓缩至1升。
向浓缩物中加入1g氯化钠，然后也加入300ml 96％的乙醇。通过在4000rpm离心30分钟提取沉淀。然后将沉淀用30ml 96％的乙醇洗涤、离心并在气流中干燥。
在室温搅拌1小时的同时将10g干产物在1升蒸馏水中稀释。去除不溶性部分并向上清液添加150ml 5％的氯化钙。将酸性粗肽聚糖沉淀通过离心进行分离。然后将其于50℃进行搅拌的同时溶解于氯化钠饱和溶液中，直到聚合物完全溶解。
将结果所得的溶液引入到TSK HW-75F柱中以进行凝胶层析。用水使级分从柱子中洗脱。收集分子量在1200和40000kD之间的第一个高分子量峰。将该级分在蒸发器中浓缩并然后冻干。
酸性肽聚糖的产量为170mg。葡萄糖与糖醛酸的重量比例为1∶4。
实施例6
除应用马铃薯球茎及将9％的溴棕三甲铵溶液用作次级沉降中的盐之外，重复实施例4。酸性肽聚糖的产量为114mg。葡萄糖与糖醛酸的质量相关性为1∶3.5。肽含量为16％。
实施例7
将如在实施例3中获得的21.4mg酸性肽聚糖在0.1M三氟乙酸中于100℃进行2小时的部分水解。将水解过程中形成的沉淀通过离心(13000rpm，2分钟)获得，用三氟乙酸和水进行洗涤，然后冻干。沉淀的产量(编码为L-1)为1.5mg。将去除沉淀后剩余的可溶性物质通过真空蒸发进行干燥，然后溶于乙醇中并进行干燥以去除痕量的三氟乙酸。将剩余物溶于3ml水中，并将不溶性材料通过离心进行沉淀，用水进行洗涤并冻干。
沉淀的产量(L-2)为1.5mg。沉淀L-1和L-2的总产量为酸性肽聚糖起始质量的约14％。人们发现沉淀为脂质。
沉淀的甲醇分解进行如下。将0.8mg L-1和0.9mg L-2样品分别与1ml无水甲醇混合，然后向每一个上述反应混合物加入0.1ml乙酰氯(冰冷的)。将反应混合物在接合的玻璃安瓿中于100℃加热4小时，这将导致沉淀的完全溶解。将反应混合物通过真空蒸发进行干燥，然后加入1ml氯仿，并用气液层析法(GLC)和层析质谱仪(chromatomassspectrometer)进行检查。
两个样品(L-1和L-2)的GLC-光谱相同；每一个光谱具有2个信号。GLC在Carlo Fractovap Series 4200上进行(气体载体He、注射器温度280℃、柱-Ultra-1(25m×0.2mm×0.33μm))。
质谱显示棕榈酸和硬脂酸的甲基酯以2∶1的比例存在。应用离子型Capture ITD-700(Finnigan MAT、电子命中70EV、质量范围m/z 39-450、扫描速度1次扫描/秒、保留累积240秒)质谱仪。
实施例8  抗体合成的活化
本实施例显示酸性肽聚糖(APG)同时与外源抗原的注射导致对注射的抗原特异性的抗体生产的实质强化。在实验中，应用小鼠CBA、C57BI/6、(CBA×C57BI/6)F1和BALB/c。将牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(EA)和绵羊红细胞(SE)用作对小鼠进行免疫接种的抗原。
通过离心(1000rpm、10分钟)将去纤维蛋白的绵羊血液红细胞在50-倍体积的Hank氏溶液中洗涤，然后重悬于相同的溶液中。通过腹膜内给予2ml SE、200μg BSA或50μg EA而对小鼠进行免疫接种。后两种抗原注射两次，在免疫接种之间有2-4星期的间隔。
在使用前2-3小时，将适当量的APG溶于Hank氏溶液或生理盐水中。将APG以1-1000μg的剂量给予小鼠。当用BSA、EA或SE对小鼠进行免疫接种时，将APG与抗原同时给予。
用SE进行免疫接种的小鼠中免疫反应的强度根据抗体形成细胞(AFC)数目确定，该细胞在脾细胞悬浮液中用Jerne和Nordin(1963)的方法进行探测。AFC在免疫接种后4-5日进行探测。对小鼠血清中EA或BSA特异性的抗体的存在用固相酶免疫测定(EIA)进行探测。对BSA特异性的抗体同种型通过EIA用对小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3特异性的次级兔抗体进行确定。
用BSA和APG进行免疫接种后对小鼠血清中BSA特异性的抗体水平(EIA-效价)达到了1∶20000，而对单独应用BSA免疫接种的反应水平非常低且仅达到了1∶500。如果抗原与APG联合，那么对BSA的次级免疫反应期限也增加。在该情况中，IgG1、IgG2a和IgG3抗体同种型占优势。在APG影响下，对BSA特异性的IgM和IgG2b生产以较低的程度增加。佐剂作用主要依赖于APG的剂量。10μg APG的剂量对于增强对SE的原发免疫反应最适，而1μg APG的剂量对于刺激对BSA的次级免疫反应最适。
APG对BaBb/c小鼠中EA-特异性抗体生产的影响由表2中所示的数据证明。脂肽为Pam3Cys-Ser-Lys4，即一种众所周知的免疫佐剂。
                                 表2
      抗原     制剂     剂量   注射途径   EA-特异性抗体的血清效价
  EA，50μg     -     -     -     13,000
  EA，50μg     APG     20μg     腹膜内     22,000
  EA，50μg     脂肽     20μg     腹膜内     20,000
  EA，50μg     弗氏佐剂     250μl     腹膜内     33,000
实施例9  组织巨噬细胞的活化
本实施例显示从腹膜腔溢泌物中收获的小鼠组织巨噬细胞可通过在APG存在时的体外培养而强烈活化。该活化可在其形态学(细胞改变了其大小和形状)以及在其代谢和酶活性中观察到。
用3ml培养基199对(CBA×C57BI/6)F1小鼠进行腹膜内注射。在注射后5分钟内收集腹膜溢泌物。将10-15只小鼠的溢泌物收获入相同的硅渗化离心管中，并于1000rpm旋转10分钟。将细胞沉淀重悬，并将其浓度调节到每ml中有2-2.5mln腹膜溢泌物细胞(PEC)。
巨噬细胞的氧化自由基生产
将1ml PEC细胞悬浮液倾倒入化学发光图(chemiluminograph)试管中，并于37℃在气氛中5％CO2的润湿空气中温育2小时。温育后，用培养基199将非贴壁的细胞洗掉。然后将1ml含有浓度为每ml中0-50μgAPG的完全培养基(RPMI-1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和10μg/ml艮他霉素)在附着试管的贴壁细胞上部倾倒入每一个试管中。然后将试管温育24小时。温育后，用0.5ml缓冲溶液(pH7.2)代替培养基，该缓冲溶液从Hank氏溶液(无苯酚红)制备，补充了5mM葡萄糖、10mM HEPES-缓冲液和0.62mM鲁米诺(Sigma Chemical Co.)。
将贴壁的巨噬细胞的氧化自由基生产估计为自发的和酵母多糖(zymozan)-诱导的化学发光水平。3个实验的结果总和表示为每分钟每1mln细胞中脉冲的平均数目。在APG存在时贴壁巨噬细胞在24小时内的温育不影响其自发化学发光的水平，但相当大地增加了(达到50％)细胞对酵母多糖反应而产生氧化代谢物的能力，该酵母多糖是一种是微生物细胞壁成分。巨噬细胞化学发光能力的增加在0.2μg/ml APG时即已经开始，且在5.5μg/ml APG时达到其最大值。剂量依赖性充分与APG浓度相关，这导致由其形态学改变估计的巨噬细胞的最大活化。
巨噬细胞膜上5’-核苷酸酶(5’-NTDase)的活性
对5’-NTDase酶水平的探测是估计巨噬细胞活化的高说明性的方法之一。已知在免疫调制剂影响下该酶活性的降低充分与其免疫增强和抗感染功效相关。
为了确定APG对腹膜巨噬细胞5’-NTDase水平的影响，用0.5ml生理盐水中30μg的APG对(CBA×C57BI/6)F1小鼠进行腹膜内注射。用0.5ml不含APG的生理盐水对对照小鼠进行注射。注射后24小时，通过用5ml培养基199对每一个小鼠腹膜进行洗涤而收获腹膜溢泌物细胞。将10ml体积中的PEC悬浮液置于100mm培养皿中，然后于37℃和5％CO2温育2小时。将非贴壁细胞去除，而用乳胶刮刷从培养皿表面收集贴壁细胞，然后将PEC的浓度调节到50μl体积中2mln细胞。将该体积的悬浮液置于96-孔微量滴定板上的孔中，然后加入5’-腺甘单磷酸作为5’-NTDase的底物，并将细胞在上述条件下温育60分钟。根据钼试剂的色彩强度用光度测定法(λ620nm)测量酶活性，该钼试剂是在温育后置于所有孔中的。结果表示为每1mln PEC的光密度单位和对照水平百分比的相对5’-NTDase活性。APG存在时5’-NTDase的活性为对照水平的16％。
实施例10  人免疫系统的活化
本实施例显示APG对在人外周血中循环的免疫系统细胞的体外影响。
人NK-细胞的活化
应用三色激光细胞计量术发现作为APG对人NK-细胞影响结果的活化标记。肝素化的血液通过应用“Vacutainer”系统(由BectonDickinson生产)对健康供体的静脉穿刺获取。将APG制剂在培养基RPMI-1640中稀释到1mg/ml的浓度，并通过0.22mcm的滤器过滤而灭菌。在培养基RPMI-1640中制备0.016-100μg/ml APG的因子2系列浓度，并将其以0.2ml的体积置于48-孔Nunc培养平板的孔中。作为负对照，应用0.2ml不含APG的RPMI-1640。将0.2ml肝素化的血液加入到每一个孔中。将样品于37℃和5％CO2温育3-48小时。温育后，将0.05ml血液样品置于1.2ml的塑料管中。插入了5μl下面的抗体：抗-CD16-FITC(Sorbent)、抗-CD69-藻红素(Pharmingen)、抗-CD3-PerCR(Becton Dickinson)。将管子摇动5秒，然后于室温暗温育20分钟。将1ml裂解-固定溶液(Becton Dickinson)加入到每一个试管中，然后使其在室温放置15分钟。将试管在300g离心10分钟，去除上清液并将细胞沉淀重悬于0.5ml等渗溶液中。
应用激光活化的荧光细胞荧光光度计(cytofluorimeter)(FACSCalibur，由Becton Dickinson生产)和应用Cell Quest软件显示不存在APG时仅有7％的NK-细胞表达CD69(一种活化标记)，但如果在细胞培养物中存在10μg/ml APG，那么实际上所有的(96％)NK-细胞均活化并表达CD69。
在APG影响下NK-细胞的溶细胞活性的增加
应用Ficoll(Pharmacia)密度梯度离心(室温30分钟，300g)从肝素化的血液中获得了单核级分。将细胞用培养基199洗涤并于2mln/ml悬浮于完全培养基(CM)中，该完全培养基包含RPMI-1640，并补充了10％胎牛血清、20mM Hepes缓冲液(pH7.4)和10μg/ml艮他霉素。将1ml细胞悬浮液置于12-孔Nunc培养平板的每一个孔中，然后将1ml CM(对照)、1ml 20μg/ml的APG溶液或1ml白细胞介素-2(IL-2，20ME/ml，一种标准的NK-细胞活化剂)加入到细胞培养物中。将培养物于37℃在5％CO2的空气中温育3小时。温育后，将细胞收集于离心管中，通过离心(10分钟，300g)进行沉淀，并以每1mlCM中5mln细胞的浓度重悬。将回收的细胞用作溶细胞效应物。将效应物细胞在CM中连续2-倍稀释的三份引入(0.1ml体积)到96-孔圆底培养平板的孔中。将10,000个K562细胞系来源的3H-尿苷-标记的目标细胞加入到每一个培养孔中。使效应物和目标细胞的混合物于37℃在5％CO2的空气中温育4小时。温育后，用Titertek Cell Harvester 550将细胞转移到滤纸上，然后用Wallac 1409meter对放射性水平进行计数。
使效应物细胞在APG存在时温育3小时后，29％的NK-细胞表达CD69，这意味着该细胞已活化。这种APG-活化的效应物细胞对K562肿瘤目标细胞的溶细胞活性的研究显示在APG影响下NK-细胞杀伤目标细胞能力的巨大增加。这在低的效应物-目标比例时更明显，特别是在6.25和12.5的比例时，NK细胞的细胞溶解能力在APG影响下增加3倍。APG在活化NK细胞中比IL-2更有效，不管该活化是根据CD69的表达还是对K562肿瘤细胞的杀伤活性进行估计的。
粒细胞的活化
对不同类型细胞上活化标记表达的研究显示APG诱导粒细胞上CD69的表达。粒细胞的活化在APG存在时体外温育24小时后明显。在该时间，60％的粒细胞表达CD69。
实施例11  细胞因子合成和分泌的活化
本实施例显示APG活化人血细胞中细胞因子的生产。例如，APG起始了白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)的产生。
肝素化的血液通过应用Vacutainer系统(Becton Dickinson)对健康供体的静脉穿刺获取。将APG制剂在培养基RPMI-1640中稀释到1mg/ml的浓度，并通过0.22μm的滤器过滤而灭菌。在培养基RPMI-1640中制备了0.016-100μg/ml APG的因子2系列浓度，并将其以0.2ml的体积置于48-孔培养平板的孔中。作为负对照，应用0.2ml不含APG的RPMI-1640。然后将0.2ml肝素化的血液加入到每一个孔中。
将样品于37℃和5％CO2温育3-48小时。温育后，将0.2ml培养基收集于0.5ml离心试管中，并于10000rpm离心15分钟。将上清液于-70℃冷冻并用于确定分泌的细胞因子。将在培养孔中剩余的细胞轻轻用移液管吸取并转移到1.2ml塑料试管中以用流式细胞仪确定细胞活化标记。培养物上清液中的IL-1β浓度用EIA进行确定。根据生产商的说明书应用Immunotech(法国)生产的IL-1β试剂盒。TNF-α和IL-8分别用购自Innogenetics(比利时)的EIA试剂盒进行测量。颜色强度用由Dynatech(瑞士)制造的自动光度计(450nm)阅读器进行测量。
应用三色激光活化的流式细胞仪(FACS Callbur，BectonDickinson，美国)在人血液单核细胞中探测了细胞内的细胞因子。将肝素化的血液用RPMI-1640进行1∶1的稀释，该RPMI-1640含有各种浓度的APG且也含有10μg/ml布雷非尔德菌素A(Sigma，美国)，即一种真核细胞中蛋白质分泌的抑制剂。将样品于37℃和5％CO2温育5小时。温育后，获取0.1ml悬浮液，并添加1ml裂解-固定溶液(BectonDickinson)。使混合物在室温放置15分钟。将试管进行离心(300g，10分钟)，去除上清液并将细胞沉淀重悬于0.5ml细胞透化混合物中(Becton Dickinson)。将该悬浮液于室温放置10分钟。该程序使得细胞内部能够显色。在添加了5ml含有0.5％牛血清和0.1％叠氮化钠的等渗液体后，将细胞通过离心(300g，10分钟)进行沉淀，并将上清液去除。将5μl抗体添加入细胞沉淀中。为了确定单核细胞中的IL-1β，应用了下面的抗体混合物：抗-IL-1β-FITC(Caltag Lab.)、抗-CD14-PE(Caltag Lab.)、抗-CD45-PerCR(Becton Dickinson)。细胞内的确定类似，但在各个标记的抗体混合物中应用FITC-标记的抗-TNF-α。
结果显示APG刺激TNF-α、IL-1β和IL-8由单核细胞的生产，且该单核细胞是细胞外培养基中这些细胞因子的来源。事实上，如果将布雷非尔德菌素A添加到温育培养基中且因此阻断蛋白质分泌，并用流式细胞仪记录单核细胞内这些细胞因子的累积，那么其在培养基中的浓度就为背景水平。无布雷非尔德菌素A时，单核细胞中细胞因子的累积是不明显的，这是因为它们不断输出到细胞外部，因此培养基中细胞因子的浓度急剧增加，这直接依赖于APG的浓度。剂量依赖性曲线显示随APG-浓度在体外从40到400ng/ml的增加，单核细胞的TNF-α、IL-1β和IL-8生产为指数增长。
实施例12  干扰素合成的诱导
在体外用人细胞系进行了APG的干扰素诱导活性的研究，该人细胞系即L-41(成纤维样细胞)和J-96(单核细胞样细胞系)。干扰素诱导的强度通过APG对用脑心肌炎病毒(encephalo-myocarditis virus)(EMV)感染的人细胞系的抗病毒活性进行估计。将每100μl体积20,000个细胞置于96-孔平底培养平板的每一个孔中。将培养基199用于J-96细胞的培养，而使L-41用Eagle’s最小培养基进行生长；两种培养基均补充了10％胎牛血清、300μg/ml L-谷氨酰胺和100单位/ml的青霉素。
将一种双链微生物DNA制剂，Ridostin(Vector，俄罗斯)用作参考的干扰素诱导剂。将APG和Ridostin的干扰素诱导功效根据其在体外保护L-41和J-96细胞不受EMV的细胞病原性影响的能力进行估计。干扰素诱导能力表示为保护50％的细胞不被病毒致死的化合物的最小有效浓度(CPD50)。
在细胞培养物中将检验的制剂的因子2系列稀释制备为0-100μg/ml的APG或Ridostin终浓度。感染的细胞的生存力和病毒的细胞病原性作用在感染后24小时用光学显微镜(Leitz，放大200×)进行计数。在每一种情况下3个实验结果显示于表3和4中。
                                        表3
           用100LD100 EMV感染的L-41细胞培养物中APG的干扰素诱导功效
    制剂                          抗病毒作用(CPD50)
  实验1   实验2   实验3     M+-m
  APG  100μg/ml  50μg/ml   5 0μg/ml   66.7±16.7μg/ml
  Ridostatin  250μg/ml  4μg/ml   15.6μg/ml   89.9±80.1μg/ml
                                         表4
              用100LD100 EMV感染的J-96细胞培养物中APG的干扰素诱导功效
    制剂                          抗病毒作用(CPD50)
  实验1   实验2   实验3     M+-m
 APG   25μg/ml   12.5μg/ml   6.25μg/ml     14.6±5.5μg/ml
 Ridostatin   2μg/ml   8μg/ml   8μg/ml     6±2μg/ml
实施例13  抗细菌防御的活化
应用小鼠的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的实验性感染检验APG为抗细菌防御的增强剂。该实验在体重为12-14g的两种性别的小鼠上进行。在感染前24小时将不同剂量的APG(3.3μg、10μg或30μg)进行皮下注射。用102、103、104或105个微生物细胞(每只小鼠)对小鼠进行腹膜内攻击。在20日中记录死亡率。根据动物存活的增加(％)、导致50％死亡的感染剂量(ID50)和攻击后寿命的延长估计该制剂的保护功效。结果显示于表5中。
                                     表5
                  APG对小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌感染抗性的影响
    制剂   剂量   注射途径   存活率(％)     ID50  平均寿命(日)
生理盐水  0.5ml     S/c     30     501(200-1258)*     11.4
APG  3.3μg     S/c     32.5     630(251-2512)     12
 10μg     S/c     37.5     1000(316-3162)     11.6
 30μg     S/c     52.5     3981(1258-12589)     13.1
*-表示ID50及其显示0.05概率时的界限(括弧中的)。
人们也已发现APG成功地增加了鸡对葡萄球菌的抗感染防御。进一步地，应用APG的免疫调节可增加抗细菌化学疗法的功效。在用1.5×109金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)攻击后20分钟，将一种抗细菌制剂，nifulin以10mg/kg的剂量经口引入鸡中。与攻击的对照组中的40％相比，应用nifulin的治疗将鸡的存活率增加到70％。APG和nifulin的联合保护了100％的感染的鸡。
实施例14  抗病毒防御的活化
应用1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)(HSV-1)感染的实验模型在白色非近交小鼠中研究了APG的抗病毒作用。结果显示APG的预防和治疗性作用。在攻击前48小时用每只小鼠3μgAPG的注射或者在攻击前48和24小时分两次用每只小鼠3-30μg的注射可保护40-60％的动物不由于感染而死亡。
应用VERO细胞培养物中的HSV-1感染研究了APG增加人细胞对病毒感染抗性的能力。已显示APG可赋予VERO细胞对HSV-1导致的细胞死亡的防护。
与未处理的VERO细胞相比，在用APG处理的VERO细胞中病毒复制得到急剧抑制。因此，如果在攻击前24小时用APG对VERO细胞进行预处理，那么HSV-1效价将减少100-1000倍。如果在用HSV-1攻击VERO细胞后给予该制剂，那么病毒的效价将减少70-100倍。

Claims (13)

1.一种具有免疫刺激性、抗病毒和/或抗细菌活性的物质，该物质可通过用水从薯蓣科、车前科或茄科捣碎的植物原材料中提取而获得，且该物质是分子量为1200-40000kD且葡萄糖对糖醛酸的重量比例为1到2-4的水溶性酸性肽聚糖。
2.一种根据权利要求1的物质，其中肽部分构成了酸性肽聚糖总质量的13±3％。
3.一种根据权利要求1或权利要求2的物质，该物质以2.4∶1的比例含有10-15％的棕榈酸和硬脂酸。
4.一种根据任何前述权利要求的物质，用于治疗性用途。
5.一种包含根据任何前述权利要求的物质和药物可接受的载体的药物组合物。
6.一种根据权利要求5的组合物，为液体形式。
7.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由增强的抗体合成改善的病症。
8.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的巨噬细胞改善的病症。
9.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的单核细胞改善的病症。
10.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的天然杀伤细胞(NK-细胞)改善的病症。
11.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的粒细胞改善的病症。
12.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的细胞因子合成改善的病症。
13.根据权利要求1-4中任何一项的物质用于制备药物的用途，该药物用于治疗可由活化的干扰素合成改善的病症。
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