一种胸腺五肽与匹多莫德的生成物七肽及合成方法
技术领域
本发明属于化学制药技术领域。
背景技术
一.胸腺五肽概述
人工合成的胸腺五肽(Thymopentin,简称TP5),是胸腺生成素第32-36位的氨基酸残基片段,但有着与“胸腺生成素”相同的全部生理功能和药效,是一种具有双向调节作用的新型免疫调节剂。它主要通过诱导T细胞,并与T细胞特异受体结合,使细胞内cAMP水平上升,从而诱导一系列胞内反应,达到调节免疫功能的作用。它还具有良好的抗衰老作用,这主要是通过增强血清中超氧化物歧化酶活性发挥作用。本品用于治疗肿瘤、免疫功能低下和自身免疫病等。
1)胸腺五肽药理作用
TP5能使机体失衡的免疫功能正常化,促进胸腺细胞的生长和分化,因此对因年龄和应激损伤等其它因素造成的胸腺萎缩及功能减退具有重要的调节作用。TP5对小鼠的脾重和脾组织学结构都有显著的促进作用,实验动物脾淋巴细胞的E-玫瑰花结形成率及转化率、空斑形成细胞(Plague forming cell,PFC)均明显高于对照组,对人体血液红细胞免疫功能有显著增强作用,对血液中超氧阴离子自由基(Oi)有明显的清除作用,且能增高红细胞的SOD活性,能提高小鼠体内IL-2水平。
体外实验证实,TP5对正常幼年及成年鼠的Th1、Th2细胞产生细胞因子影响,皮下注射TP5均可促进各种年龄鼠脾细胞产生IL-2、α-肿瘤坏死因子(INF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)。对老年鼠产生IL-2、IFN-γ和INF-α的促进作用更明显,同时显著降低老年鼠的IL-4水平。
动物实验表明,TP5加强小鼠抗SRBC的初次及再次抗体反应,对于高反应性Balb/c小鼠,在亚适抗原刺激以及环磷酰胺抑制状态下,TP5使小鼠血清初次及再次抗体水平提高至正常。而在最适抗原刺激下仅可提高初次反应,此作用是胸腺五肽激活Th细胞所致。在迟发型超敏反应(DTH)模型中,胸腺五肽同样可提高低反应性C57B1/6小鼠的DTH反应,而对于高反应性Balb/c小鼠的DTH抑制,同时加重环磷酰胶引起的DTH的抑制。在此,胸腺五肽进一步诱导了Ts细胞的功能,同样,在亚适抗原刺激下胸腺五肽增加小鼠脾Tc细胞功能,Tc细胞前体(CLP-U)计数增加。
2)胸腺五肽药代动力学
TP5在人血浆中半衰期约为30s,很快由蛋白酶降解。水解从TP5的氨基端即精氨酸开始,经四肽(Lys-Asp-Val-Tyr)到三肽(Asp-Val-Tyr)。但实验提示可能有小部分TP5经双肽直接分解为Asp-Val-Tyr,而Lys-Asp-Val-Tyr则更可能被氨基肽酶以外的其它酶类水解。除肠道胰酶中的羧基肽酶A是先从C端的酪氨酸(Tyr)水解TP5外,未见有体内其他酶从C端降解TP5及TP4和TP3的文献报道。因此,这三种肽在体内代谢不是由TP5及TP4和TP3的逐级降解过程。且发现在活性胰提取物中,TP5很快降解,形成酪氨酸、多数可能为TP4及TP4的进一步代谢物,在培养液的降解清除率随肽浓度的增加而降解。10mM EDTA可完全抑制胰提取物中酶对胸腺五肽的降解,大豆胰岛素抑制剂可使胸腺五肽清除下降73%。口服肽降解清除率强烈依赖于其在肠道的位置,在大肠(结肠)中的降解比在小肠中慢许多,而在小肠的各段中,与空肠和回肠相比较,在十二指肠的降解更慢。
运用薄层色谱法分析了人血浆中含氚胸腺五肽3H-胸腺五肽的体外稳定性,结果表明放射性的迅速消失与胸腺五肽的构成有关,半衰期为30秒,,在人唾液中,25%放射性在这种无肽构成中保留10分钟。在大鼠和狗中研究了胸腺五肽的体内分布。在一小猎犬静脉中施以接近0.1mg/kg体重的3H-胸腺五肽,结果最初是血液水平上的放射性衰退,在5分钟内,继之是逐步地广泛的衰退。在为期21天的观察中放射性衰退之和只为总体的29%,这一结果暗示了血管外药物或代谢物在进入正常代谢途径过程中慢慢释放了。在幼小的Wistor大鼠静脉和腹膜中施3H-胸腺五肽,结果血液中放射性迅速上升,继之迅速下降。在胸膜内施以该药出现放射性与静脉内施药时放射性的出现之间有微小的间隔时间,近似于3.5-7分钟。概括起来,体内分布的结果和体外运行的数据在放射性迅速退化方面是一致的。
3)胸腺五肽药效学
胸腺五肽治疗原发性T细胞缺乏和Di George综合症的婴幼儿得到良好的效果,临床症状及免疫学指征明显改善。AIDA病前期病人经TP5 10mg静脉注射,每周三次,治疗一个月后,外周血CD8(Tc/Ts)细胞增加,对PHA反应增强,皮肤过敏反应阳性,病人临床症状明显好转,体重增加,部分病人症状改善持续8个月之久。在临床上,用逆转录酶(RT)抑制剂叠氮胸苷(ZDV)治疗无症状HIV感染者时,随着治疗时间的延长,RT基因可出现变异,使HIV对ZDV具有抗药性,如果同时加用胸腺五肽则能明显延缓HIV对ZDV抗药性的产生,同时能提高循环血中CD4+T细胞数和降低HIV RNA拷贝数,从而延缓或阻止无症状HIV携带者发展为艾滋病。
使用TP5综合治疗重型肝炎,总有效率为80%,显著高于对照组(P<0.01);病死率降低为25.71%,低于对照组57.14%(P<0.01);HBsAg及HBV-DNA阴转率显著高于对照组(P<0.01)同时能有效控制感染并减少继发感染。
胸腺五肽对机体受损细胞免疫功能的提高,也使其对复发性单纯疱疹、带状疱疹以及人类乳头瘤病毒感染期显著延长。胸腺五肽还可能通过提高CD4+和CD45RO肿瘤浸润淋巴细胞数及其分泌的细胞因子使肿瘤细胞凋亡及坏死,明显改善化疗所致的淋巴细胞转化率(LTT)和NK细胞活性的降低,从而达到抗皮下转移性黑色瘤的作用,并能减轻化疗药物的毒副作用。此外,胸腺五肽对放射治疗、手术创伤、手术感染等应激情况引起的机体免疫功能下降,具有明显的保护作用。胸腺五肽还能预防复发性尿路感染和呼吸道感染。
二.目前应用免疫调节剂可分为以下几类:
1)免疫替代剂,用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物。按其作用机制可分为提高巨噬细胞吞噬功能的药物,提高细胞免疫功能的药物,提高体液免疫功能的药物等;按其作用性质又可分为特异性免疫增强剂和非特异性免疫增强剂;按其来源则可分为细菌性免疫增强剂及非细菌性免疫增强剂。
2)免疫恢复剂,能增强被抑制的免疫功能,但对正常免疫功能作用不大。
3)免疫佐剂,又称非特异性刺激剂。随着人们对疾病治疗观念的转变,治疗的重点已经由直接杀伤外源性病原体转向调整生物机体自身功能,从而免疫增强剂在医学的应用引起广泛的关注,免疫增强剂的研究已成为应用医学最活跃的研究领域之一。虽然免疫增强剂的种类繁多,不下十几类上百种,但是理想的免疫增强剂并不多见。免疫增强剂的种类繁多,不下十几类上百种,包括矿物质类,如硒、锌等;中草药类,如黄芪、白芍、芦荟、当归等;免疫佐剂类,如蜂胶、弗氏佐剂等;微生物制剂类,如卡介苗、霍乱毒素B亚单位等;维生素类,如维生素A、维生素E等;氨基酸类,如精氨酸、亮氨酸等;激素或激素样物质类,如生长激素、胸腺肽等;核酸制剂类,如多(聚)核苷酸、免疫核糖核酸等;抗寄生虫药物类,如左旋咪唑、甲硝唑等;其它免疫增强剂,如干扰素、蜂花粉、热休克蛋白等。
目前市场主要应用:1)硒。有关硒的免疫增强功能研究已经很多,现在人们已经把眼光转向硒的药物制剂方面和有机硒的研制开发方面。在药物制剂方面,人们已研制开发了纳米硒。纳米技术在药物制剂方面的应用主要是纳米粒的应用,纳米粒可以改善难溶性药物的口服吸收,可以靶向和定位释药,可以作为生物大分子的特殊载体。纳米硒对小鼠免疫系统的保护研究已经取得了较理想的结果。在有机硒的研制开发方面,人们已开发了多种有机硒,如硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒酵母等。与无机硒相比,有机硒具有低毒高效,易于机体吸收的特点。另外,人们还发现补硒可以抑制癌症的发生,相关作用机制有不少假说,包括对抗氧化损伤、影响免疫系统、刺激癌细胞凋亡等。硒抗癌可能不仅仅是一种机制在起作用,而是多种机制共同作用的结果,硒抗癌机制需进一步的研究。无机硒亚硒酸钠是最常用的硒补充剂,尤其畜牧业应用更是广泛。但由于亚硒酸钠是毒性物质,稍一过量就会引起中毒,特别是幼龄动物更为敏感,且生物利用率不理想,这些都将大大限制亚硒酸钠以后在实践中的应用。当前,人们越来越倾向于使用高效低毒的有机硒,如硒酵母,有机硒将是未来的主导硒补充剂。
2)黄芪。黄芪是传统补气中药,能补诸虚,可固可托,其有益气、补虚、升阳等功效,大量研究表明黄芪具有明显的免疫增强功能。黄芪多糖是中药多糖的一种,而中药多糖一直是近20年生命科学研究领域的研究热点。人们发现中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用,其中最重要的当推免疫增强作用。作为免疫增强剂或免疫调节剂,中草药具有独特的优势,其卓越的双向调节功能和较小的毒、副作用已得到世界医学界的普遍认可。黄芪作为中草药免疫增强剂的典型代表,其免疫增强功能已为人们所公认。无论在人,还是在动物,黄芪都将得到更广泛的应用。
3)卡介苗(Bacilus Calmette-Guerin,BCG)是一种非特异性免疫增强剂,可增强巨噬细胞的吞噬活性,活化淋巴细胞,提高机体细胞免疫和体液免疫水平,是一种常用的免疫增强剂。卡介苗在人医临床主要用于辅助治疗恶性黑色素瘤、急性淋巴细胞性白血病、肺癌、胃肠道癌肿等。在畜牧业,人们把卡介苗作为免疫佐剂,和疫苗同时使用,以提高疫苗的免疫效果,效果都较理想。卡介苗中成分复杂,使用时有一定的毒副作用,尤其做注射用,现人们倾向于提纯卡介苗有效成分用于临床实践。
4)左旋咪唑。左旋咪唑是不仅具有广谱的驱虫效果,而且对机体具有良好的免疫调节功能,因此深受人们的重视,尤其在畜牧业有广泛的应用。左旋咪唑主要用于自身免疫病的治疗,还可作为肿瘤治疗的辅助用药,但长期使用会导致肝功能损伤,粒细胞减少。左旋咪唑在畜牧业应用广泛,但最近几年欧盟和日本已禁止使用左旋咪唑作为肉鸡饲料添加剂,这将大大限制其在我国畜牧业的应用。
5)核酸制剂。近年来,人们发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂,可有效地激活免疫效应细胞,介导这一作用的是一类具有特征性的短核苷酸序列,称为免疫应激DNA序列(Immmuno-stimulatory DNAsequence,ISS)。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入,扩展了人们对DNA生物学的新认识。免疫核糖核酸(immunogenicRNA,iRNA)是从被免疫机体的淋巴细胞、淋巴组织中提取的核糖核酸,具有传递细胞免疫和体液免疫信息的功能。由于iRNA具有超越种属界限传递免疫功能的特点,因此有关它的基础和应用方面的研究始终受到重视。国内iRNA的研究始于20世纪70年代,它的研究主要围绕着肿瘤的治疗,并已应用于肿瘤的临床治疗。国外大量研究表明,当机体缺乏核苷酸时,免疫细胞的数量减少,免疫细胞的活性下降,抗体的形成也明显下降;而补充核苷酸则有利于恢复免疫细胞功能和抗体的产生。国内有人对核酸口服液的药理作用和安全性进行实验,发现:核酸口服液具有调节机体免疫机能和植物神经系统功能的作用;急性毒性试验和长期毒性试验提示,核酸口服液无明显毒副作用,应用安全,为长期应用提供了实验依据。国内外大量实验证明,给动物或人补充外源性核苷酸,不仅可以增强机体的免疫功能,有助于维持细胞和体液免疫应答,而且还能部分解除免疫抑制。作为免疫增强剂,核酸制剂的价格相对较高。在人上,以核苷酸为主要原料制成的人类免疫保健食品,日益为人们所青睐,具有广阔的应用前景;在动物上,目前人们更倾向于把核酸制剂作为免疫佐剂,以提高疫苗的免疫效果。
6)蜂花粉。蜂花粉(beepollen)是蜜蜂采集的花粉粒,并在采集过程中加入花蜜和唾液,将花粉粘合而成的团状物。蜂花粉是一种天然营养佳品,全部含有机体必需的14种微量元素,含有自然界中22种游离氨基酸中的20种,还含有较全面的维生素及生命活动不可缺少的各种物质,如磷脂、活性酶、生长素、核酸等,被誉为完全营养素。蜂花粉除具有较高的营养价值外,还是一种理想的免疫增强剂。蜂花粉的成分决定了它的开发利用可以朝着饲料添加剂和免疫增强剂这2个方向努力。蜂花粉作为饲料添加剂,不仅具有天然、无毒副作用的特性,符合现代畜牧业开发环保饲料的需要,而且营养成分丰富、全面,能起到全面促进机体新陈代谢的作用。蜂花粉作为免疫增强剂,不仅可以增强机体的体液免疫和细胞免疫,而且具有天然、无毒副作用的特性,符合现代药物开发的需要,是一种理想的免疫增强剂。此外,我国拥有数量相当可观的蜜粉源植物和蜂群,蜂花粉资源极为丰富。这些决定了蜂花粉在畜牧业中的开发利用潜力巨大,研究前景广阔。
7)胸腺肽。1966年Goldstein首先从小牛胸腺中提取并命名胸腺素(肽)以来,人们对其进行了大量研究,研究表明:胸腺肽可以促进淋巴细胞的转化,增强巨噬细胞的吞噬活性,对机体免疫机能既具有增强作用又有抑制作用,是一种高效的免疫调节剂。目前临床使用的胸腺肽大多为注射液,这不利于其在临床上的应用,口服胸腺肽更适合在临床上应用。现在人们已转向口服胸腺肽的研制开发,并取得可喜的成绩。胸腺肽口服易被胃肠道中的酸和酶分解破坏而失活,如何保护胸腺肽不受酸和酶的破坏是口服胸腺肽的研制开发最大的难题。有人在胸腺肽中加脱氧胆酸钠、微晶纤维素和淀粉,制成肠溶胶囊,可以使胸腺肽直接到达小肠,形成局部高浓度,使其大部分能被吸收,从而发挥更好的疗效。还有人对口服胸腺肽结肠溶制剂的药效学进行研究,结果表明:口服胸腺肽结肠溶制剂与胸腺肽注射剂一样,同样具有明显增强并调节T细胞免疫功能的作用和效果。胸腺肽α1是人胸腺素第5组分中纯化出来的一种生物因子,具有促进体内细胞因子的分泌及淋巴细胞功能的作用,早期主要用于肝炎、重症细菌感染和免疫缺陷病的治疗,近年来已用于肿瘤的治疗。有人研究了胸腺肽α1对恶性肿瘤患者化疗期间免疫功能的影响,结果表明:胸腺肽α1能明显提高肿瘤患者的免疫功能,特别对提高NK细胞活性尤为明显,并且没有发现明显的毒副作用,是一种低毒高效的免疫调节剂。胸腺肽是一种高效的免疫调节剂,主要应用于人医临床治疗细胞免疫缺陷病、自身免疫性疾病、肿瘤等,尤其是用于肿瘤的辅助治疗,并取得较理想的效果。胸腺素虽然免疫增强作用较好,但因其价格昂贵,在畜牧业中还很难大范围的推广应用。
发明内容
本发明的目的是:
提供一种胸腺五肽与匹多莫德的生成物七肽及合成方法,它通过固相合成法使胸腺五肽与匹多莫德通过酰胺键连接合成七肽(PT-TP5),以达到筛选出有治疗作用的新型免疫调节剂的目的。
本发明的技术方案如下:
本发明的胸腺五肽与匹多莫德的生成物七肽(PT-TP5)化学结构式是:
其合成方法是:通过固相合成法使胸腺五肽与匹多莫德通过酰胺键连接合成七肽(PT-TP5)。
本发明的有益效果是:
根据拼合原理对TP5进行修饰,考察修饰后的衍生物免疫活性是否增强,进一步考察药代动力学方面是否改变。在此思想的指导下,我们选择了匹多莫德,因为匹多莫德是一种人工合成的高纯度二肽,既能促进非特异性免疫反应,又能促进特异性反应。该药应用安全,对于急性、亚急性和慢性毒性数据都非常好,是一种多相广谱免疫促进剂。在合成过程中,我们通过匹多莫德的羧基与胸腺五肽精氨酸的氨基成酰胺键将两者连接在一起,形成了一个新的化合物,由于胸腺五肽在代谢过程中是从精氨酸的氨基端开始降解,所以连接匹多莫德后相当于对氨基端进行了保护,可能会改变胸腺五肽的药代动力学性质,而且匹多莫德是惟一一种具有口服生物活性的免疫促进剂,如果七肽衍生物可以保留匹多莫德具有口服生物活性的性质,则可以改变传统胸腺五肽的剂型,将具有很好的临床价值。
具体实施方式:
实施例1:
1NH2-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Resin的制备在合成Fmoc-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Resin后,用2.0ml吡啶,2.0ml乙酸酐于室温下氮气鼓泡反应2hr以封闭Lys上未反应的氨基,反应完毕后,树脂用甲醇,N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷各洗涤三次(25ml/次),后用50%哌啶/DMF溶液40ml脱除Fmoc保护基,于室温下氮气鼓泡反应1hr,抽干,用甲醇,N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷各洗树脂三次(25ml/次),取少量树脂于试管中,加少量茚三酮/氰化钾/苯酚混合溶液定性检测Fmoc是否脱除完全,沸水浴加热2min,如溶液颜色呈深蓝紫色(不透明),则说明Fmoc的脱除达99%以上,可以进行下步反应。
2PT-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Resin的制备
向反应器中加入匹多莫德(1.954g,8mmol)Bop(3.54g,8mmol)DIEA(1.6mL,8mmol),室温下氮气鼓泡反应过夜,除去滤液,用甲醇,N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷各洗树脂三次(25ml/次),取少量树脂于试管中,加少量茚三酮/氰化钾/苯酚混合溶液定性检测匹多莫德与NH2-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Resin的缩合程度,沸水浴加热2min,如溶液颜色呈黄绿色或浅紫色(透明),则说明Arg的氨基形成酰胺键的反应程度达99%以上,可以进行下步反应。
3酸切
TFA(60ml),Thioanisole(6.7ml),O-Cresol(7.2g),Anisole(6.7ml)
加入上述树脂中室温下振荡6hr,过滤树脂,并用TFA 10ml洗涤树脂二次,减压蒸除部分滤液后加入乙醚600ml有大量白色沉淀析出。将沉淀抽滤并真空下干燥,得白色固体1.8克。
3.1PT-TP5的分离与纯化
3.1-1CM-Sephadex C-25弱酸型阳离子交换柱
将七肽溶于0.15M/L的醋酸胺溶液中,经滤膜过滤后上CM-Sephadex C-25阳离子交换柱,流速为1.5毫升/分钟。上样完毕后,用0.15M/L醋酸胺溶液洗三次,每次至少为上样体积,随后开始用PH6.0的醋酸胺溶液线性洗脱(0.15M)进行离子交换纯化,紫外280nm检测,收集产品峰,冻干后得1产品。为白色固体,但较粘稠(因含醋酸胺,所以质量增加),具体条件为:
(1)用超纯净水溶胀填料,装柱后用0.15M/L醋酸胺平衡柱子,流速2.0毫升/分钟,待基线平衡后等待上样
(2)胸腺五肽粗品经滤膜(0.20μm)过滤后上柱
(3)VA-6型检测器动态监测基线
(4)待上样完毕后用三倍上样体积的0.15M醋酸胺溶液冲柱子
(5)用0.15M醋酸胺溶液进行线性洗脱
(6)收集产品峰
(7)产品冻干后转至高效液相工艺段
3.1-2高效液相色谱纯化
将经过CM-Sephadex C-25阳离子交换葡聚糖凝胶分离后得到的冻干品用超纯净水溶解,选用60%乙腈为流动相,采用梯度洗脱程序进行洗脱。
流动相组分:A:H2O
B:60% CH3CN/H2O
洗脱程序:流速3ml/min,梯度洗脱
收集含七肽的流份,冻干,即得七肽纯度达到95%以上,,收率为61%;ESI-MS(M+)906.7(实际分子量905.7)见附图16;IR(KBr)CM-13400-3100,3000-2500,3404,2960,2921,1654,1573,1400,1316,1245,1116,652,540,见附图7;1H-NMR(400MHz,D2O)δ:6.97(d,J=8.4Hz,2H,=CH-)6.68(d,J=8.4Hz,2H,=CH-),4.29(dd,J=8.0Hz,J=4.8Hz,1H,>CH-),4.21(t,J=6.8Hz,1H,>CH-),3.95(d,J=7.6Hz,1H,>CH-),3.30(dd,J=12.4Hz,J=7.6Hz,1H,>CH-),3.06(m,2H,-CH2-),2.98(m,1H,-CH2-),2.96(m,1H,-CH2-),2.85(t,J=7.6Hz,2H,-CH2-)2.75(dd,J=13.8Hz,J=8.8Hz,1H,-CH2-),2.49-2.56(m,3H,-CH2-),2.29(m,2H,-CH2-),1.91(m,1H,>CH-),1.89(m,2H,-CH2-),1.87(m,1H,>CH-),1.67(m,3H,-CH2-),1.61-1.51(m,5H,-CH2-),1.22(m,2H,-CH2-),0.72(d,J=6.8Hz,3H,-CH3),0.70(d,J =6.8Hz,3H,-CH3),13C-NMR(400MHZ,D2O)δ:181.39,178.36,176.94,176.61,172.72,172.69,172.08,171.73,171.43,171.27,156.21,153.67,130.11,128.85,114.82,62.47,58.83,55.75,55.00,52.92,52.7750.92,48.68,40.03,38.69,37.50,36.33,32.41,30.02,29.86,28.60,27.90,25.76,23.85,23.63,21.47,21.29,18.00,16.94
活性测定:
1T淋巴细胞转化实验(MTT法):
无菌取小鼠脾脏,用毛玻璃片磨碎,并用棉花过滤细胞悬液,洗涤一遍(1500r/min),用IMDM培养液调细胞浓度5×106/ml,加入微孔培养板,每孔0.1ml。每孔加入ConA 0.1ml,每个样品加3复孔,终浓度5μg/ml并设立每只小鼠的不加CoaA的对照3复孔。在37℃CO2培养箱中培养24-48hr,于结束培养前4hr加入MTT(5mg/ml)10μl/孔.结束培养时将培养板取出吸弃上清液后,向每孔加入100μl DMSO裂解细胞并溶解兰色的颗粒物质37℃孵育2hr,在振荡器上混匀后酶标仪上读取(OD570)结果.结果判定SI=ConA刺激孔A570nm均值/对照孔A570nm均值。
2E花环实验
将上述小鼠摘眼球取的抗凝血用Hank’s液稀释一倍后,用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞,再用含20%FBS的Hank’s液配成5×106/ml细胞悬液。同时将新鲜的绵羊红细胞用生理盐水洗3次,再用含20%FBS的Hank’s液调至1×108/ml细胞悬液。取上述淋巴细胞悬液和红细胞悬液各0.1ml放入1.5mlEP管中混合,1500r/min离心沉淀5min,放冰水中1-2hr(或放普通冰箱过夜)。弃去大部分上清,轻轻摇动EP管,将沉淀物悬浮,滴在载玻片上,吹干后用乙醇(或1%戊二醛)固定,显微镜下计数E花环阳性细胞率。
结果判定:凡淋巴细胞周围粘附3个以上绵羊红细胞,既为花环阳性细胞。计数两百个淋巴细胞,计算出花环阳性细胞百分数。
3溶血空斑形成实验
在实验的前4天,也就是小鼠给药第7天,将新鲜的SRBC用生理盐水调成1.5%的浓度,无菌操作每只小鼠腹腔内注射1.0ml。将免疫后4天的小鼠处死,无菌取出脾脏,放入含5ml冷的Hank’s液的平皿中,研磨成单细胞悬液,并移至试管中,计数脾细胞,用Hank’s液稀释成1×107/ml。分别取脾细胞悬液0.12ml,20%SRBC0.12ml,1∶10稀释的补体0.46ml,加至试管内混匀。用100μl加样器吸取被检细胞混合悬液,于预先作好玻片小室一端轻轻将液体注满小室(避免气泡产生,避免液体外溢),记录实际注入悬液的量。用牙签沾取少量凡士林,密封小室上下两个开口。将做好的标本置于湿盘中,水平放置37℃温箱,孵育30-60min。肉眼或低倍显微镜观察空斑,计数出现溶血空斑数,真正的溶血空斑中心育一个淋巴细胞,周围未透明区。
活性测定结果:
1T淋巴细胞转化实验结果
采用ConA刺激T淋巴细胞转化试验显示,阳性对照组T淋巴细胞转化明显高于对照组(t=4.428,p<0.05),该实验结果与文献报道一致。实验组PT-TP5在13.36μg,66.8μg组T淋巴细胞转化明显高于对照组(t=2.869,3.66,p<0.05),并呈剂量性促进T淋巴细胞转化作用,结果见表9。N=4查表得t0.05,6=2.45
表1淋巴细胞转化实验
组 |
T淋(脾) |
I |
1.475±0.14 |
II |
1.602±0.23 |
III |
1.78±0.16 |
IV |
1.851±0.15 |
V |
2.034±0.21 |
2E玫瑰花环实验结果
实验进一步检测小鼠外周血T细胞比例,采用E玫瑰花环实验显示,阳性对照组E花环形成率明显高于对照组(t=5.589,p<0.05),该实验结果与文献报道一致。实验组PT-TP5在13.36μg,66.8μg组E花环形成率明显高于对照组(t=6.618,6.647,p<0.05),并呈剂量性促进T细胞花环形成,结果见表10。N=4查表得t0.05,6=2.45
表2E花环实验
组 |
200个细胞花环数(平均数) |
200个细胞花环率(平均数,r%) |
I |
86 |
43±4.1 |
II |
91.5 |
45.75±4.9 |
III |
123 |
61.5±3.8 |
IV |
129.5 |
64.75±5.1 |
V |
116.5 |
58.25±3.6 |
3溶血空斑实验结果
实验进一步检测T细胞辅助抗体产生能力变化,采用溶血空斑实验检测分泌抗体的B细胞数量,阳性对照组溶血空斑形成率明显高于对照组(t=3.874,p<0.05),该实验结果与文献报道一致。实验组PT-TP5在13.36μg,,66.8μg组溶血空斑形成率明显高于对照组(t=3.98,7.787,p<0.05),并呈剂量性促进B细胞的溶血空斑形成,结果见表11。N=4查表得t0.05,6=2.45
表3空斑形成率
组 |
空斑形成 |
I |
13±1.5 |
II |
17±2.8 |
III |
19.5±2.9 |
IV |
30±4.1 |
V |
18±2.1 |