CN102716481A - 一种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂及其应用，这种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂是重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白，简称tHSP70，利用热休克蛋白70特异性上下游引物克隆罗非鱼热休克蛋白70基因，构建tHSP70酵母表达系统并表达纯化获得tHsp70蛋白，该蛋白与罗非鱼链球菌病口服疫苗联合使用，可显著提高罗非鱼腹腔巨噬细胞NO释放和吞噬活性；提高外周血淋巴细胞的增殖活性；调节免疫相关基因的表达；提高罗非鱼链球菌病口服疫苗的免疫保护率。该佐剂的应用克服了目前罗非鱼口服疫苗免疫效果差的不足，促进疫苗在水产养殖业中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂，具体涉及一种罗非鱼重组分泌型热休克蛋白70蛋白的应用。
背景技术
随着水产养殖业的高速发展，近20年来，我国水产养殖品种的疫病频繁发生，经济损失严重，据不完全统计，全国每年水产养殖以疫病为主的病害发病率达50％以上，损失率20％左右，年经济损失达数百亿元，并且还有上升的趋势，疫病已成为水产养殖业发展的重大制约因素之一。1942年，Duff次应用灭活的杀鲑产气单胞菌(A.salmonicida)口服免疫硬头鳟获得成功，开创了疫苗在鱼类应用的历史。之后，弧菌病菌苗、肠道性红嘴病(ERM)菌苗等获得了成功，使人们认识到应用疫苗预防鱼类疾病的可能，1975年美国疫苗有限公司(AVI)开始生产商品性鱼用疫苗ERM菌苗。目前，在挪威等发达国家，已出现许多商品化的鱼用疫苗，但这些疫苗大多以注射或浸浴的方式接种，口服免疫的很少。大规模的集约化养殖场采用注射法进行预防接种，显然比较麻烦，特别是在进行多种疾病的防治过程中，要耗费大量的人力和时间，同时会对鱼体组织器官造成一定的损害，对于规格较小的稚鱼或幼鱼，其难度将更大。相比之下，通过口服免疫接种，则安全易行、实用方便，不受鱼体大小的限制，且使用量比浸浴免疫要少，更易为广大水产养殖户所接受。但目前研制的鱼类口服疫苗普遍存在免疫效果差、免疫期短、成本高等各种不利于推广的因素。
罗非鱼是世界水产养殖的重要品种，中国罗非鱼产量占全球总产量的55％，其中出口量22.44万吨，是我国水产品出口创汇主要品种之一。近年来随着片面地重视规模发展和追求高产，造成病害频频暴发，养殖发病率高达75％。对广东、广西和海南罗非鱼养殖病害的调查发现，链球菌病是罗非鱼养殖的主要病害，并且有逐年递增的均势。按2010年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达15-30亿元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约我国罗非鱼产业继续向前发展的瓶颈。然而，目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。
由于传统的化学药物防控鱼类传染病导致病原体产生抗药性、污染环境、药物残留等，使用疫苗防控鱼类病害逐渐成为更为理想的鱼病防治手段。近几十年来，随着鱼用疫苗的发展和应用，与鱼用疫苗密切相关的鱼用免疫佐剂和免疫增强剂的研究也越来越受到重视。免疫增强剂是指一些化学物质、药物、应激原或某些能引起特异、非特异性免疫反应活动，增强动物对病毒、细菌、真菌、寄生虫等抵抗的物质；免疫佐剂，是能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，本身无免疫原性，发挥辅助作用的一类物质，属于免疫增强剂的范畴。免疫佐剂和免疫增强剂的研制与应用对鱼类病害的防控有重要意义，目前水产常用的免疫佐剂或免疫增强剂主要有以下几类：
(一)油类及矿物质类：包括弗氏佐剂、铝盐佐剂、微硅粉等。弗氏佐剂是免疫学上广泛应用的一种油类佐剂，分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，近几十年来一直都有弗氏佐剂在鱼类免疫上应用的报道，应用弗氏佐剂后可显著提高特异性抗体水平，大量的实验都证明弗氏佐剂是一种极为有效的佐剂，但是弗氏佐剂在应用中造成鱼类腹部损伤的副作用很明显，因此有学者认为该佐剂不太可能应用到生产当中。这类免疫佐剂或免疫增强剂普遍存在使用副作用大等缺点。
(二)微生物来源类：包括霍乱毒素、葡聚糖、肽聚糖、脂多糖、壳多糖等。霍乱毒素尤其是它无毒的B亚单位可以与动物细胞膜成分结合，是一种有效的哺乳动物粘膜免疫佐剂，但在鱼类中应用的佐剂效应显示的不明显。葡聚糖在水产动物中的免疫增强效果有较为广泛而深入的研究，当福尔马林灭活的杀鲑气单胞菌与葡聚糖混合后接种大西洋鲑，与单独注射全菌疫苗相比，前者分别针对杀鲑气单胞菌的全菌、外膜、LPS的血清抗体水平显著提高，但是攻毒试验显示试验鱼接种疫苗后没有产生有效的针对杀鲑气单胞菌的免疫保护作用。这类免疫佐剂或免疫增强剂多为借鉴人或畜牧应用经验，在鱼类中的应用效果和应用方法还需进一步深入研究。
(三)动植物来源类：包括蜂胶、甘草皂苷、伴刀豆球蛋白A等，这些免疫佐剂或免疫增强剂的使用均能不同程度的增强鱼类非特异性或特异性免疫，但特异性和针对性较弱。
(四)生物活性分子类：包括细胞因子、含有CpG的寡聚脱氧核糖核苷酸、激素、乳铁蛋白等。细胞因子是一类具有特定生物学功能的多肽或糖蛋白，近年来，鱼类细胞因子的研究已取得较大进展，特别是一批免疫相关的细胞因子及其基因被鉴定和克隆，在这些细胞因子中，已有部分被证实是有效的免疫增强剂和免疫佐剂，可用于鱼类病害的免疫防治。用体外表达的鲤鱼IL-1的一段C端多肽与福尔马林灭活的嗜水气单胞菌共同注射鲤鱼，检测到特异性抗体滴度显著提高，并且没有哺乳动物中出现的发热等副作用，表现出良好的佐剂效应。这类免疫佐剂或免疫增强剂对基础研究要求较高，开发难度大。
随着分子生物学的进步和鱼类免疫学的发展，可以根据鱼类自身免疫特点针对性的设计表达生物活性分子，生物活性分子免疫佐剂和免疫增强剂的优点越来越突出，面对水产养殖病害越来越严重的趋势，迫切需要研制开发新型生物活性分子免疫佐剂和免疫增强剂。
热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是广泛存在于生物界中进化上具有高度保守性的一组蛋白，现已证实Hsp家族中的一些成员具有分子伴侣及免疫佐剂功能，Hsps呈递抗原分子过程中同时辅助抗原分子成熟，具有潜在的免疫功能，在免疫系统激活中起双重作用。Hsp70为Hsps家族重要一员，其分子的N端具有结合ATP功能，C端可结合蛋白和肽类分子，Hsp70通过与ATP结合及对ATP水解促使Hsp70与蛋白和肽类的结合、解离，并维持蛋白正确构象，防止蛋白易位过程中产生过早性折叠及损害性折叠。研究表明Hsp70结合抗原分子向抗原呈递细胞递呈抗原，并可激活APCs分泌细胞因子。Hsp70-肽复合物或肽-Hsp70融合蛋白中的Hsp70不但具有分子伴侣作用，而且可激活T或B淋巴细胞介导的获得性免疫反应。研究表明体外培养中添加Hsp70与蛋白gp33可诱导部分树突细胞成熟，体内同时给与Hsp70与蛋白gp33可倒转T细胞自身免疫耐受作用。另外，重组人热休克蛋白70可在体外诱导部分DCs的成熟，作为疫苗佐剂时则可显著提高特异性抗体滴度，呈现出高效免疫佐剂作用。从小鼠肿瘤移植实验中偶然发现Hsp70具有肿瘤免疫原性以来，Hsp70参与肿瘤免疫研究成为Hsps家族研究的热点。进一步研究证实，Hsp70参与的肿瘤免疫中，抗原性来之于与Hsp70结合的多肽，Hsp70则通过参与抗原呈递起作用。近20年已大量开展了抗肿瘤、病毒、细菌及寄生虫病原多种Hsp70分子疫苗的设计研究，抗肿瘤Hsp70分子疫苗已完成了1、2和3期临床试验。
热休克蛋白70虽然在人免疫佐剂和免疫增强剂、肿瘤疫苗等方面被广泛研究，但对于人和其它动物，鱼类对免疫佐剂和免疫增强剂的应答有其自身的特点，而基于鱼类免疫机理的热休克蛋白70作为鱼类免疫佐剂和免疫增强剂的研究还未见报道。面对鱼类口服疫苗及免疫佐剂免疫增强剂应用存在的问题，迫切需要一种有效免疫佐剂的应用。
发明内容
针对上述鱼用免疫佐剂和免疫增强剂及鱼类口服疫苗开发存在的问题，本发明主要解决的问题是提供一种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂，该佐剂还具有免疫增强剂作用。
为实现上述任务，本发明采用的技术方案如下：
(1)39℃热激罗非鱼3min(分钟)，无菌采血10ml(毫升)；
(2)用TRIZOL法进行血细胞总RNA抽提并检测其质量；
(3)利用热休克蛋白70互补DNA(cDNA)序列，设计合成上下游引物Hsp70F、Hsp70R，分别引入EcoR1和AvrII两个酶切位点；
(4)摸索RT-PCR条件，在最佳条件下进行罗非鱼Hsp70的大量扩增；
(5)琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物与质粒pPIC9k分别经EcoR1和Sac11酶消化，消化产物去磷酸化并回收特异片段，用T4DNA连接酶进行连接及鉴定；
(6)连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，并用Zeocin抗生素LB平板进行选择培养，对阳性克隆进行酶切鉴定及核酸测序鉴定；
(7)大量制备pPIC9k-Hsp70质粒并用BstXI酶消化线性化，同时用山梨醇法制备感受态毕赤酵母，通过电穿孔仪将线性化的pPIC9k-Hsp70质粒转入到感受态毕赤酵母，在Zeocin的YPD板上选择培养，对菌斑进行PCR鉴定；
(8)利用甲醇对多个阳性克隆工程酵母进行目的蛋白诱导表达，在48h/72h分别取上清进行SDS-PAGE电泳分析，选择表达量较高的克隆进行表达时间及PH值优化，并对候选菌株进行多次传代及诱导表达，筛选出高效稳定分泌表达酵母工程菌株；
(9)用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化pPIC9k-Hsp70诱导上清，用40mM咪唑洗脱目的蛋白，并进行脱盐和浓缩，制的热休克蛋白70蛋白，即重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白(tHsp70)。
上述RT-PCR扩增热休克蛋白70cDNA所用引物Hsp70F、Hsp70R，分别加入保护碱基和酶切位点：
Hspf-EcoRI 5’CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’
保护碱基 EcoRI
Hspr-AvrII 5’TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’
保护碱基 AvrII
上述RT-PCR的反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；进行35个循环后，72℃延伸10分钟。
上述酵母菌表达载体是pPIC9k质粒DNA。
上述罗非鱼重组分泌型热休克蛋白70蛋白的制备方法，包括如下顺序的步骤：
(一)热休克蛋白70基因的克隆
1.热应激处理：
试验鱼在500L大水缸内暂养1周后(水温约25℃，气泵充气)，将其放入39℃水温下10min进行热应激，然后在室温下放置6h。
2.总RNA抽提：
用75％酒精棉球对试验鱼表面擦洗消毒，置于无菌托盘上，用肝素钠溶液润洗后的5ml注射器进行尾静脉采血。将同一品系3尾鱼的血液混合成1份。取混合血液0.2ml(约2.0×107个血细胞)加入1mlTrizol试剂，剧烈震荡至液体完全透明，室温作用5min；加入0.2ml氯仿剧烈震荡30s后室温作用5min，4℃，12000g×15min；小心吸取上层水相，加入0.5ml异丙醇-20℃沉淀30min，4℃，12000g×10min；弃上清，加1ml 75％乙醇，4℃，7500g×5min洗涤沉淀两次；室温干燥15min，加适量DEPC水溶解(55℃水浴助溶5min)。核酸蛋白测定仪测量OD值和变性电泳检测其完整性。
3.引物设计：
根据罗非鱼的热休克蛋白70cDNA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，设计合成上下游引物Hspf-EcoRI、Hspr-AvrII，分别引入EcoR1和AvrII两个酶切位点，理论扩增片段大小为1945bp，包括Hsp70基因的完整编码区。
Hspf-EcoRI 5’CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’
保护碱基 EcoRI
Hspr-AvrII 5’TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’
保护碱基 AvrII
4.RT-PCR扩增及克隆：
以提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链，反应体系为：
混匀，30℃下保温10min，42℃下退火反应30min，95℃下灭活反转录酶5min，5℃下冷却5min。
PCR扩增目的基因：PCR扩增反应体系(总体积50μL)：
扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，55.6℃退火45分钟，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
Hsp70基因克隆：取5μLPCR产物在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察，切下1923bp的目的DNA条带，使用Agarose Gel DNA purification Kit(TaKaRa公司)回收纯化PCR产物，连接到pMD18-T载体中，按照NEB Double Digest软件推荐，选用酶切反应体系，进行双酶切反应。
5.重组质粒的粘端连接
按Vector DNA∶Insert DNA的1∶3～10摩尔比在10μl反应体系进行连接：
6.连接产物的转化
采用诺赛化学转化感受态细胞(转化效率＞108)，按常规42℃热击法进行转化。
重组体DNA加入新鲜制备的感受态菌中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，立即转入冰浴2分钟，加800μl的LB培养基，37℃缓慢摇动1小时，1,000rpm(转每分钟)离心10min，倒去培养液，另加150μl的LB培养基悬起转化菌，涂布于含有(Amp，100μg/mL)的LB琼脂板上，同时做阴性对照一板，37℃过夜倒置培养。
7.质粒DNA的限制性酶切鉴定
按照NEB Double Digest软件推荐，选用酶切反应体系，进行双酶切反应，酶切结果正确者送测序。
(二)热休克蛋白70基因的表达
1.线性化质粒DNA
按照PmeI反应体系要求，在80μl NEB Buffer4反应体系中37℃4h酶切2μg pPIC9k-Hsp70和pPIC9k质粒进行质粒DNA线性化。
2.重组质粒电转酵母感受态细胞
取80μl酵母感受态细胞与5μl线性化DNA(0.1μg)混合，冰上放置5min；转入预冷的0.2cm电转杯中，电击转化(1500v，5ms)；立即取出电击杯，加入1ml预冷的1M山梨醇至电击杯中，轻轻混匀，将内容物转入灭菌离心管中。取适量涂于MD平板上30℃培养。
3.PCR鉴定阳性克隆
取少量酵母菌液，利用Hsp70特异性的上下游引物，通过PCR反应进行阳性克隆鉴定。
4.重组Hsp70蛋白的小量诱导表达
挑取单克隆，接种至含10ml BMGY培养基的试管中，28-30℃，250-300rpm摇床培养至OD600＝2-6(约16-18小时)，利用本实验室建立的甲醇诱导表达方法进行蛋白诱导表达，在诱导后24h、48h、72h、96h的时间点，分别取200μl培养基至1ml离心管，通过SDS-PAGE分析检测重组蛋白表达水平，确定诱导后收集细胞的最佳时间为72-96h。
5.重组Hsp70蛋白大量诱导重组酵母菌表达
挑取经过小量诱导表达筛选出的较高表达水平的菌株，接种至含10ml BMGY培养基的试管中，28-30℃，260rpm摇床培养至OD600＝2-6(约16-18小时)，将10ml培养物接种至含1L BMGY的3L摇瓶中，28-30℃剧烈震荡，260rpm，至对数生长期(OD600＝2-6)。用灭菌离心管，室温2000g离心5min收集细胞。诱导表达时，去除上清，将细胞重悬于300ml BMMY培养基中。将培养基加至2L摇瓶中，用2层灭菌纱布盖住，放入28-30℃摇床继续培养(260rpm)。甲醇诱导至72小时，室温2000g离心5min收集上清。
(三)热休克蛋白70蛋白纯化
1.亲和层析
用Ni-NTA agarose(QIANGEN)亲和层析柱纯化pPIC9k-Hsp70诱导上清，用40mM咪唑洗脱目的蛋白。
2.脱盐
利用AKTA蛋白纯化系统对Hsp70用HiTrap Desalting预装柱进行脱盐，收集蛋白峰组分用超滤离心管进行浓缩，由于蛋白峰和咪唑峰较接近，超滤同时再进行更换缓冲液，将蛋白保存在PBS(pH7.3)缓冲液中。
3.浓缩
将脱盐后的蛋白用超滤离心管进行浓缩。
上述重组罗非鱼热休克蛋白70作为佐剂在罗非鱼用口服疫苗的应用。
重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白作为免疫佐剂用于罗非鱼病害防治的口服疫苗。
重组罗非鱼热休克蛋白70作为免疫增强剂用于罗非鱼养殖。
重组罗非鱼热休克蛋白70用于预防或治疗鱼类病害，特别是预防或治疗罗非鱼链球菌病感染的药物组合。
采用上述技术方案，本发明利用从罗非鱼血液中克隆的热休克蛋白70基因，构建出一种新型的热休克蛋白70分泌型酵母表达载体pPIC9K-Hsp70。此表达载体具有引导蛋白出胞的信号肽，可使产物分泌出细胞，有利于产品的纯化和生产。通过电转化方法导入比赤酵母菌中进行表达，从酵母菌的培养上清中获得有活性的重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白，经纯化后可作为罗非鱼免疫增强剂和罗非鱼链球菌病疫苗免疫佐剂，可有效提高鱼体免疫力和疫苗的免疫效果，特别是在罗非鱼病害防治中进行应用，如口服疫苗。
具体实施效果如下：
(一)重组罗非鱼热休克蛋白70、重组罗非鱼热休克蛋白70-抗原复合物对腹腔巨噬细胞免疫功能的影响
1.巨噬细胞NO(一氧化氮)及吞噬活性检测
分别制备罗非鱼链球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原复合物，设12个试验组：tHsp70-thallus(菌体)复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，Hsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。将分离到的腹腔巨噬细胞培养于96孔板，每孔100μL(细胞个数约1×105)，培养24h，吸走未贴壁细胞并加入新的培养基继续培养48h。吸去培养基上清，加入190μL新培养基及10μL上述准备好各种刺激物，继续培养。于刺激后24h和48h分别吸取50μL培养上清液转入酶标板，按NO检测试剂盒(Promega，USA)操作说明进行NO浓度标准曲线制作和样品NO检测。同时，按巨噬细胞吞噬活性检测试剂盒(Jiancheng，Nanjin，China)说明进行抗原刺激48h各试验孔巨噬细胞吞噬活性的检测。
培养基中加入tHsp70(100μg/mL，10μg/mL和1μg/mL三个浓度)均可显著刺激罗非鱼腹腔巨噬细胞的贴壁和生长，细胞间突触样的细胞连接明显增多，其中以浓度为100μg/mL的tHsp70试验组细胞生长状态最好。NO检测结果显示(图1)，除tHsp70-thallus复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)和tHsp70(100μg/mL)两个试验组NO释放显著(P＜0.05)，其余组NO释放水平在24h差异不明显。tHsp70-ECP复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)可显著增强巨噬细胞NO产生(P＜0.01)。tHsp70(100μg/mL)单独作用也可刺激巨噬细胞NO释放(P＜0.05)。
腹腔巨噬细胞吞噬活性检测结果显示(图2)，海豚链球菌菌体或ECP与tHsp70体外非共价结合后，浓度为100μg/mL的tHsp70试验组可显著提高巨噬细胞的吞噬活性(P＜0.05)。tHsp70(100μg/mL，10μg/mL和1μg/mL)单独作用同样可以提高巨噬细胞吞噬活性，浓度为100μg/mL的tHsp70试验组最显著(P＜0.01)。
2.免疫相关基因表达检测
分别制备罗非鱼链球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原复合物，设12个试验组：Hsp70-thallus复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，Hsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。刺激24h后对PGK、MMP9、ICER、MHC II四个免疫相关基因进行定量检测。此外，对tHsp70-thallus复合物(菌体量为1×106，tHsp70浓度为100μg/mL)，菌体(1.0×106cell)和无刺激对照组的上述四基因进行了12、24、48和72h 4个时间点的表达定量分析。
实时荧光定量PCR检测结果显示(图3)，tHsp70-抗原复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)及单独tHsp70(100μg/mL)刺激罗非鱼腹腔巨噬细胞24h均可极显著提高其IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因表达水平(P＜0.01，相对于菌体或ECP单独作用)，10μg/mL和1μg/mL两个浓度作用不明显(P＞0.05)。相对于无刺激物对照组，菌体和ECP也可以提高腹腔巨噬细胞IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因的表达(P＜0.01)。罗非鱼腹腔巨噬细胞12h，24h，48h和72h四个时间点基因表达结果显示(图4)，tHsp70-菌体复合物组IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因的在四个时间点的表达量均极显著高于菌体组和无刺激对照组(P＜0.01)。从12h开始菌体组IL-8和Hsp70表达量超过无刺激对照组(P＜0.05)；CXCR4和PGRN从48h开始菌体组表达量才超过无刺激对照组(P＜0.05)。另外，IL-8表达峰值出现在48h，而Hsp70，CXCR4和PGRN三个基因一直呈上升趋势。
上述实验结果表明tHsp70单独使用或tHsp70与抗原联合使用均可提高腹腔巨噬细胞NO释放并增强其吞噬活性，显著调节免疫相关基因的表达，显示出很好的免疫佐剂和免疫增强剂功能。
(二)重组罗非鱼热休克蛋白70对外周血淋巴细胞免疫功能的影响
1.鱼热休克蛋白70提高外周血淋巴细胞增殖活性
分别制备罗非鱼链球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原复合物，将分离的外周血淋巴细胞于96孔板中培养12h后加入相应的刺激物，实验共设12个试验组：tHsp70-thallus复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，Hsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。刺激24h后按BrdU Cell Proliferation Assay(GE)操作说明测定外周血淋巴细胞的增殖活性。检测结果显示(图5)：浓度为10μg/mL的Hsp70和Hsp70-thallus均可极显著促进罗非鱼外周血淋巴细胞增殖(P＜0.01)；海豚链球菌菌体对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖活性也有显著增强作用(P＜0.05)，而ECP对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖活性有一定的抑制作用(P＝0.056)。但当ECP与浓度为10μg/mL的tHsp70体外非共价结合形成复合物后可减轻其对细胞增殖的抑制作用，浓度为100μg/mL和1μg/mL的tHsp70与抗原作用后其差异不明显。
2.重组罗非鱼热休克蛋白70对外周血淋巴细胞免疫相关基因表达调节
分别制备罗非鱼链球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原复合物，将分离的外周血淋巴细胞于96孔板中培养12h后加入相应的刺激物，实验共设12个试验组：tHsp70-thallus复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，Hsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。刺激24h后对PGK、MMP9、ICER、MHC II四个免疫相关基因进行定量检测。此外，对tHsp70-thallus复合物(菌体量为1×106，tHsp70浓度为100μg/mL)，菌体(1.0×106cell)和无刺激对照组的上述四基因进行了12h、24h、48h和72h四个时间点的表达定量分析。
如图6所示，浓度为100μg/mL的tHsp70与海豚链球菌菌体或ECP体外非共价结合形成的tHsp70-抗原复合物及单独的tHsp70刺激罗非鱼外周血淋巴细胞24h均可以极显著提高其PGK，ICER，MMP9and MHC II四个基因的表达(P＜0.01)，10μg/mL和1μg/mL两个浓度对PGK，MMP9and MHC II三个基因的表达也有提高(P＜0.05)，100μg/mL与10μg/m、1μg/mL两个浓度的作用结果差异显著(P＜0.01)。罗非鱼外周血淋巴细胞12h，24h，48h and 72h四个时间点基因表达结果显示(图7)，tHsp70-菌体复合物组的PGK，ICER，MMP9and MHC II四个基因在4个时间点的表达量均极显著高于菌体组和无刺激对照组(P＜0.01)；从24h开始，菌体组与对照组4个基因表达量开始出现差异，48h后菌体组明显高于对照组(P＜0.05)。同时，ICER和MHC II两个基因在48h均达到表达峰值，而PGK和MMP9两个基因一直呈上升趋势。
上述实验结果表明Hsp70单独使用或Hsp70与抗原联合使用均可提高外周血淋巴细胞增值活性，显著调节免疫相关基因的表达，显示出很好的免疫佐剂和免疫增强剂功能。
(三)鱼热休克蛋白70作为免疫佐剂和免疫增强剂的效果
使用已公开报道的方法制备壳聚糖-海藻酸钠微粒，利用该技术分别包裹热休克蛋白70-菌体、热休克蛋白70、菌体、空微粒，分别拌鱼用膨化饲料晒干后在1d、7d、14d饲喂免疫罗非鱼，同时设空白对照组。最后一次免疫结束10天后，使用CMS005菌株3倍半数致死量进行攻毒，计算各组的相对免疫保护率。结果显示热休克蛋白70-菌体组、热休克蛋白70组、菌体组、空微粒组相对免疫保护率分别为78.57％、60.71％、53.57％、10.71％，表明热休克蛋白70具有良好的免疫佐剂和免疫增强剂作用。
附图说明
图1tHsp70对体外培养罗非鱼腹腔巨噬细胞NO释放的影响
a/A代表与medium(培养基)对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图2tHsp70对体外培养罗非鱼腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图3tHsp70对腹腔巨噬细胞免疫相关基因表达影响的浓度效应
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图4tHsp70对腹腔巨噬细胞免疫相关基因表达影响的时间效应
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图5tHsp70对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖活性影响
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图6tHsp70对外周血淋巴细胞免疫相关基因表达影响的浓度效应
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP 对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图7tHsp70对外周血淋巴细胞免疫相关基因表达影响的时间效应
a/A代表与medium对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01；b/B代表tHsp70-thallus复合物和tHsp70-ECP复合物与对应的thallus和ECP
对照组的方差分析，其P＜0.05/0.01。
图8重组Hsp70蛋白诱导表达条件优化。
图9Hsp70蛋白用HiTrap Desalting预装柱进行脱盐。
图10tHsp70与不同量胞外产物ECP非共价结合后SDS-PAGE电泳.1，未结合tHsp70(1μg)；2，胞外产物ECP(50μL)；3-6，10μg的tHsp70分别与1μL、10μL、25μL、50μL胞外产物ECP非共价结合后取1/10体积反应液进行SDS-PAGE。
图11tHsp70与不同量菌体非共价结合离心后上清SDS-PAGE电泳.1-4，10μg的tHsp70分别与1×104、1×105、1×106、1×107菌体非共价结合，离心(10000g，10min)后取上清1/10体积进行SDS-PAGE电泳；5，未结合tHsp70(1μg)。
图12tHsp70对罗非鱼腹腔巨噬细胞体外培养生长的影响(200×)
(A)培养基中含有100μg/mL的tHsp70；(B)培养基中含有1μg的ECP/孔；(C)未含刺激物对照组；(D)培养基中含有tHsp70-ECP复合物(tHsp70浓度为100μg/mL，ECP含量为1μg/孔)。
具体实施方式
实施例1：罗非鱼热休克蛋白70的表达与纯化
(1)罗非鱼热休克蛋白70基因的克隆
①热应激处理：
试验鱼在500L大水缸内暂养1周后(水温约25℃，气泵充气)，将其放入39℃水温下10min进行热应激，然后在室温下放置6h。
②总RNA抽提：
用75％酒精棉球对试验鱼表面擦洗消毒，置于无菌托盘上，用肝素钠溶液润洗后的5ml注射器进行尾静脉采血。将同一品系3尾鱼的血液混合成1份。取混合血液0.2ml(约2.0×107个血细胞)加入1mlTrizol试剂，剧烈震荡至液体完全透明，室温作用5min；加入0.2ml氯仿剧烈震荡30s后室温作用5min，4℃，12000g×15min；小心吸取上层水相，加入0.5ml异丙醇-20℃沉淀30min，4℃，12000g×10min；弃上清，加1ml75％乙醇，4℃，7500g×5min洗涤沉淀两次；室温干燥15min，加适量DEPC水溶解(55℃水浴助溶5min)。核酸蛋白测定仪测量OD值和变性电泳检测其完整性。
③引物设计：
根据罗非鱼的热休克蛋白70(tHsp70)cDNA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，设计合成上下游引物Hspf-EcoRI、Hspr-AvrII，分别引入EcoR1和AvrII两个酶切位点，理论扩增片段大小为1945bp，包括Hsp70基因的完整编码区。
Hspf-EcoRI 5’CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’
保护碱基 EcoRI
Hspr-AvrII 5’TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’
保护碱基 AvrII
④RT-PCR扩增及克隆：
以提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链，反应体系为：
混匀，30℃下保温10min，42℃下退火反应30min，95℃下灭活反转录酶5min，5℃下冷却5min。
PCR扩增目的基因：PCR扩增反应体系(总体积50μL)：
扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，55.6℃退火45分钟，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
tHsp70基因克隆：取5μLPCR产物在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察，切下1923bp的目的DNA条带，使用Agarose Gel DNA purification Kit(TaKaRa公司)回收纯化PCR产物，连接到pMD18-T载体中，按照NEB Double Digest软件推荐，选用酶切反应体系，进行双酶切反应。
⑤重组质粒的粘端连接
按Vector DNA∶Insert DNA的1∶3～10摩尔比在10μl反应体系进行连接：
⑥连接产物的转化
采用诺赛化学转化感受态细胞(转化效率＞108)，按常规42℃热击法进行转化。
重组体DNA加入新鲜制备的感受态菌中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，立即转入冰浴2分钟，加800μl的LB培养基，37℃缓慢摇动1小时，1,000rpm离心10分钟，倒去培养液，另加150μl的LB培养基悬起转化菌，涂布于含有(Amp，100μg/mL)的LB琼脂板上，同时做阴性对照一板，37℃过夜倒置培养。
⑦质粒DNA的限制性酶切鉴定
按照NEB Double Digest软件推荐，选用酶切反应体系，进行双酶切反应，酶切结果正确者送测序。
(2)热休克蛋白70基因的表达
①线性化质粒DNA
按照PmeI反应体系要求，在80μl NEB Buffer4反应体系中37℃4h酶切2μg pPIC9k-Hsp70和pPIC9k质粒进行质粒DNA线性化。
②重组质粒电转酵母感受态细胞
取80ul酵母感受态细胞与5μl线性化DNA(0.1μg)混合，冰上放置5min；转入预冷的0.2cm电转杯中，电击转化(1500v，5ms)；立即取出电击杯，加入1ml预冷的1M山梨醇至电击杯中，轻轻混匀，将内容物转入灭菌离心管中。取适量涂于MD平板上30℃培养。
③PCR鉴定阳性克隆
取少量酵母菌液，利用tHsp70特异性的上下游引物，通过PCR反应进行阳性克隆鉴定。
④重组tHsp70蛋白的小量诱导表达
挑取单克隆，接种至含10ml BMGY培养基的试管中，28-30℃，250-300rpm摇床培养至OD600＝2-6(约16-18小时)，利用本实验室建立的甲醇诱导表达方法进行蛋白诱导表达，在诱导后24h、48h、72h、96h的时间点，分别取200μl培养基至1ml离心管，通过SDS-PAGE分析检测重组蛋白表达水平，确定诱导后收集细胞的最佳时间为72-96h(图8)。
⑤重组tHsp70蛋白大量诱导重组酵母菌表达
挑取经过小量诱导表达筛选出的较高表达水平的菌株，接种至含10ml BMGY培养基的试管中，28-30℃，260rpm摇床培养至OD600＝2-6(约16-18小时)，将10ml培养物接种至含1L BMGY的3L摇瓶中，28-30℃剧烈震荡，260rpm，至对数生长期(OD600＝2-6)。用灭菌离心管，室温2000g离心5min收集细胞。诱导表达时，去除上清，将细胞重悬于300ml BMMY培养基中。将培养基加至2L摇瓶中，用2层灭菌纱布盖住，放入28-30℃摇床继续培养(260rpm)。甲醇诱导至72小时，室温2000g离心5min收集上清。
(3)热休克蛋白70蛋白纯化
①亲和层析
用Ni-NTA agarose(QIANGEN)亲和层析柱纯化pPIC9k-tHsp70诱导上清，用40mM咪唑洗脱目的蛋白。
②脱盐
利用AKTA蛋白纯化系统对tHsp70用HiTrap Desalting预装柱进行脱盐，图中(图9)红色A1、A2、A3为蛋白峰，A4-A8组分为咪唑峰(咪唑有较高紫外吸收峰)，收集A1、A2、A3组分用超滤离心管进行浓缩，由于蛋白峰和咪唑峰较接近，超滤同时再进行更换缓冲液，将蛋白保存在PBS(pH7.3)缓冲液中。
③浓缩
将脱盐后的蛋白用超滤离心管进行浓缩。
实施例2：重组分泌表达罗非鱼热休克蛋白70蛋白活性鉴定
(1)罗非鱼热休克蛋白70蛋白：按照实施例1表达与纯化步骤获得。
(2)抗原制备：使用罗非鱼养殖主要病害病原罗非鱼链球菌，菌株编号CMS005，接种于兔血平板，28℃培养24h。挑取单菌落接种于含TSB培养基50mL的250mL三角瓶，150r/min，28℃振荡培养24h。加入甲醛使其最终浓度为0.25％，150r/min，28℃静止灭活24h。2kD超滤浓缩到原体积的1/10，超滤产物10000g离心10min，分别获得菌体(thallus)和分子量大于2kD胞外产物(ECP)抗原。将thallus用PBS重悬，浓度调整为1.0×109/mL。(3)活性鉴定-重组分泌表达鱼热休克蛋白70与抗原体外结合：取上述准备的ECP抗原(体积分别为1μL、10μL、25μL、50μL)、菌体抗原10μL(浓度分别为1×109/mL、1×108/mL、1×107/mL、1×106/mL)，分别加入35μL tHsp70(10μg)混合，加PBS至90μL，再加入10×结合反应液(10mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，1mmol/L ADP)10μL，37℃孵育45min。分别取ECP-Hsp70复合物10μL，thallus-tHsp70复合物离心后上清10μL进行SDS-PAGE电泳。
结果：等量tHsp70(10μg)与不同量海豚链球菌ECP(体积分别为1、10、25、50μL)非共价结合后SDS-PAGE电泳结果显示(图10)，结合前海豚链球菌ECP量越多，对应泳道tHsp70条带越亮，表明结合的海豚链球菌ECP越多。同时，不同量菌体与等量tHsp70体外非共价结合后离心取上清SDS-PAGE电泳结果(图11)显示，海豚链球菌体量越多，结合的tHsp70越多，离心后上清中tHsp70蛋白条带越暗(上清中剩余的tHsp70蛋白量变小)。结果证明表达纯化获得的重组分泌型鱼热休克蛋白70具有体外活性。
实施例3：罗非鱼热休克蛋白70提高腹腔巨噬细胞免疫功能
(1)罗非鱼热休克蛋白70蛋白按照实施例1表达与纯化步骤获得。
(2)tHsp70-抗原复合物制备按照实施例2中重组分泌表达鱼热休克蛋白70与抗原体外结合方法获得。实验共设12个试验组：tHsp70-thallus复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。
(3)罗非鱼腹腔巨噬细胞分离与培养
取雄性奥尼罗非鱼腹腔注射250μL角鲨烯，正常饲养48h后，100mg/L的MS-222麻醉，75％酒精消毒体表。用连接有三通阀的注射器吸取预冷的PBS对腹腔进行冲洗，冲洗液收集于45mL离心管中，300g、4℃离心10min。吸去上清，细胞沉淀用预冷的HBSS重悬，300g、4℃离心10min洗涤1次。细胞重悬于2mLHBSS，加入9mL灭菌三蒸水作用20s破裂红细胞，立即加入1mL10×HBSS。300g、4℃离心10min，HBSS洗涤2次，最后用L-15完全培养基(含10％罗非鱼血清、5×10-5μmol/L β-巯基乙醇、100IU/mL氨苄青霉素、100μg/mL硫酸链霉素)重悬细胞。取适量细胞悬液，台盼蓝染色计数，瑞氏染色观察细胞状态。调整细胞密度为1.0×106/mL，加入96孔培养板，每孔100μL，28℃培养。
(4)巨噬细胞NO及吞噬活性检测
将分离到的腹腔巨噬细胞培养于96孔板，每孔100μL(细胞个数约1×105)，培养24h，吸走未贴壁细胞并加入新的培养基继续培养48h。吸去培养基上清，加入190μL新培养基及10μL上述准备好各种刺激物，继续培养。于刺激后24h和48h分别吸取50μL培养上清液转入酶标板，按NO检测试剂盒(Promega，USA)操作说明进行NO浓度标准曲线制作和样品NO检测。同时，按巨噬细胞吞噬活性检测试剂盒(Jiancheng，Nanjin，China)说明进行抗原刺激48h各试验孔巨噬细胞吞噬活性的检测。
(5)免疫相关基因表达检测
刺激24h后对CXCR4、PGRN、Hsp70、IL-8四个基因进行定量检测。此外，对tHsp70-thallus复合物(菌体量为1×106cell，tHsp70浓度为100μg/mL)，菌体(1.0×106cell)和无刺激对照组的上述四基因进行了12、24、48和72h 4个时间点的表达定量分析。
将各试验组3个平行孔细胞收集于离心管，2000g离心10min，去除上清，加入1mLTrizol混合作用5min。加入200μL氯仿涡旋振荡15s，12000g，4℃离心15min。吸取上清转入新的离心管，加入500μL异丙醇混匀-20℃静置30min。12000g，4℃离心15min。弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次，7000g，4℃离心5min。弃上清，室温干燥沉淀，加入10μLTE，55℃水浴助溶5min。获得的RNA按荧光定量PCR剂盒
PrimeScriptTM RT-PCR Kit II中反转录说明进行反转录，反转录所得cDNA于-80℃备用。
CXCR4、PGRN、Hsp70、IL-8和及内参基因β-actin引物序列分别为：
CXCR4F 5′AAGGGCCAGACACTGAAGAAAA-3’
CXCR45’-AGTAGGGGAGCCAGCAACAA-3’；
PGRN F5’-GCGGTCACAGTCAAATCCAA-3’
PGRN R5’-TGTCCTGATGGCACTACTTGCT-3’，
Hsp70F5’-GGCGATTTTGTCCCTCTGAA-3’
Hsp70R5’-GGCCGACTGAGCAAAGAAGA-3’；
IL-8F5’-GCACTGCCGCTGCATTAAG-3’
IL-8R5’-GCAGTGGGAGTTGGGAAGAA-3’；
β-actinF5’-AACAACCACACACCACACATTTC-3
β-actinR5’-TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT-3’。
用ddH2O对cDNA进行5倍稀释，使用ABI 7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR扩增反应。反应体系(50μL)：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL，ROX Reference Dye II(50×)1μL，正反引物各2μL(10μmol/L)，稀释后的cDNA模板4μL，ddH2O 16μL；反应程序：95℃预变性2min，95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环。
结果：
(1)巨噬细胞培养状态观察
显微镜下观察(图12)发现，培养基中加入tHsp70(100μg/mL，10μg/mL和1μg/mL三个浓度)均可显著刺激罗非鱼腹腔巨噬细胞的贴壁和生长，细胞间突触样的细胞连接明显增多，其中以浓度为100μg/mL的tHsp70试验组细胞生长状态最好。加入ECP试验组贴壁细胞数量明显少于其它试验组，出现大量的死亡细胞(疑似调亡的细胞)，tHsp70-ECP复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)试验组尽管细胞生长状态不如无刺激对照组，但细胞死亡程度明显减弱。菌体和tHsp70-thallus复合物对罗非鱼腹腔巨噬细胞生长也有一定的刺激作用，其中以浓度为100μg/mL的tHsp70-thallus试验组的细胞生长状态最佳。
(2)腹腔巨噬细胞NO检测
NO检测结果显示(图1)，除tHsp70-thallus复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)和tHsp70(100μg/mL)两个试验组NO释放显著(P＜0.05)，其余组NO释放水平在24h差异不明显。刺激48h后，ECP可显著降低罗非鱼腹腔巨噬细胞NO释放(P＜0.05)；而tHsp70-ECP复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)却可显著增强巨噬细胞NO产生(P＜0.01)。tHsp70(100μg/mL)单独作用也可刺激巨噬细胞NO释放(P＜0.05)。
(3)腹腔巨噬细胞吞噬活性
检测结果显示(图2)，海豚链球菌菌体或ECP与tHsp70体外非共价结合后，浓度为100μg/mL的tHsp70试验组可显著提高巨噬细胞的吞噬活性(P＜0.05)。tHsp70(100μg/mL，10μg/mL和1μg/mL)单独作用同样可以提高巨噬细胞吞噬活性，浓度为100μg/mL的tHsp70试验组最显著(P＜0.01)。
(4)免疫相关基因表达分析
实时荧光定量PCR检测结果显示(图3)，tHsp70-抗原复合物(tHsp70浓度为100μg/mL)及单独tHsp70(100μg/mL)刺激罗非鱼腹腔巨噬细胞24h均可极显著提高其IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因表达水平(P＜0.01，相对于菌体或ECP单独作用)，10μg/mL和1μg/mL两个浓度作用不明显(P＞0.05)。相对于无刺激物对照组，菌体和ECP也可以提高腹腔巨噬细胞IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因的表达(P＜0.01)。罗非鱼腹腔巨噬细胞12h，24h，48h和72h四个时间点基因表达结果显示(图4)，tHsp70-菌体复合物组IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四个基因的在四个时间点的表达量均极显著高于菌体组和无刺激对照组(P＜0.01)。从12h开始菌体组IL-8和Hsp70表达量超过无刺激对照组(P＜0.05)；CXCR4和PGRN从48h开始菌体组表达量才超过无刺激对照组(P＜0.05)。另外，IL-8表达峰值出现在48h，而Hsp70，CXCR4和PGRN三个基因一直呈上升趋势。
实施例4：罗非鱼热休克蛋白70提高外周血淋巴细胞的免疫功能
(1)罗非鱼热休克蛋白70蛋白按照实施例1表达与纯化步骤获得。
(2)tHsp70-抗原复合物制备按照实施例2中重组分泌表达鱼热休克蛋白70与抗原体外结合方法获得。实验共设12个试验组：tHsp70-thallus复合物组(菌体量均为1.0×106cell)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70-ECP复合物组(ECP量均为1μg)，tHsp70设100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL 3个浓度；tHsp70刺激组设100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL 3个浓度；另设thallus(1.0×106cell)、ECP(1μg)及无刺激物3个对照组，每组设3个试验平行孔。
(3)外周血淋巴细胞分离与培养
取100g健康罗非鱼，MS-22麻醉，尾静脉采血3mL，加入8mL含肝素20IU/mL的HBSS轻轻混均，300g，离心10min洗涤2次。弃上清，加入HBSS至6mL。稀释的血液缓慢加到等体积65％percoll(Sigma，USA)液面上，4℃，400g离心30min。吸取白细胞层，用5倍体积HBSS洗涤2次。细胞重悬于1mLHBSS，加入4.5mL灭菌去离子水作用20s破裂红细胞，立即加入0.5mL 10×HBSS平衡，4℃，300g离心10min。用HBSS重悬细胞，4℃、300g离心10min，洗涤2次。最后用适量L-15完全培养基(含10％罗非鱼血清、5×10-5μM β-巯基乙醇、100IU/mL氨苄青霉素、100μg/mL硫酸链霉素)重悬细胞。取适量细胞悬液，台盼蓝染色计数。调整细胞密度为1.0×106/mL，加入96孔培养板，每孔100μL，28℃培养。
(4)外周血淋巴细胞增殖活性检测
将分离的PBL于96孔板中培养12h后加入相应的刺激物，刺激24h后按BrdU CellProliferation Assay(GE)操作说明，每孔加入10μl含BrdU(100μM)的完全培养基，继续培养18h。300g离心10min，吸去上清，60℃干燥1h。每孔加入固定液200μL，室温作用30min。吸去固定液，每孔加入200μL封闭工作液，室温作用30min。吸去封闭液，每孔加入100μL酶标抗BrdU单抗工作液，室温作用1h。每孔加入200μL冲洗工作液，冲洗3次，每次5min。每孔加入100μL底物工作液，室温作用5～30min，待反应充分后每孔加H2SO4(1M)25μL终止反应，并在5min内进行吸光度测定。
(5)免疫相关基因表达检测
将分离的PBL于96孔板中培养12h后加入相应的刺激物，刺激24h后对PGK、MMP9、ICER、MHC II四个基因进行定量检测。此外，对tHsp70-thallus复合物(菌体量为1×106，tHsp70浓度为100μg/mL)，菌体(1.0×106cell)和无刺激对照组的上述四基因进行了12h、24h、48h和72h四个时间点的表达定量分析。
将各试验组3个平行孔细胞收集于离心管，2000g离心10min，去除上清，加入1mL Trizol混合作用5min。加入200μL氯仿涡旋振荡15s，12000g，4℃离心15min。吸取上清转入新的离心管，加入500μL异丙醇混匀-20℃静置30min。12000g，4℃离心15min。弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤两次，7000g，4℃离心5min。弃上清，室温干燥沉淀，加入10μL TE，55℃水浴助溶5min。获得的RNA按荧光定量PCR剂盒
PrimeScriptTM RT-PCR Kit II中反转录说明进行反转录，反转录所得cDNA于-80℃备用。
PGK、MMP9、MHC II、ICER和内参基因β-actin引物序列分别为：
MMP9F 5’-GGGACACCACCAAAGACAACA-3’
MMP9R 5’-CTTCTGGAGGCTGGATGTGAA-3’；
PGK F 5’-TGTGAGCCGTCCCAAAGG-3’
PGK R5’-AGGCAACCCAGGAGCAGATT-3’；
MHC II F5’-GTGCTAAGCATACGCAATCGAG-3’
MHC II R5’-GCAATGCGATCGGCTAAGCAG-3’；
ICER F5’-CTGGAGACGCAGCCATTACA-3’
ICER R5’-AGTCAGCCGCTACTGGAGACA-3；
β-actin F5’-AACAACCACACACCACACATTTC-3’
β-actin R5’-TGTCTCCTTCATCG TTCCAGTTT-3’。
用ddH2O对cDNA进行5倍稀释，使用ABI 7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR扩增反应。反应体系(50μL)：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL，ROX Reference Dye II(50×)1μL，正反引物各2μL(10μM)，稀释后的cDNA模板4μL，ddH2O 16μL；反应程序：95℃预变性2min，95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环。
结果：
(1)淋巴细胞增殖检测
tHsp70-抗原复合物刺激外周血淋巴细胞48h，BrdU Cell Proliferation Assay Kit检测结果显示(图5)：浓度为10μg/mL的tHsp70和tHsp70-thallus均可极显著促进罗非鱼外周血淋巴细胞增殖(P＜0.01)；海豚链球菌菌体对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖活性也有显著增强作用(P＜0.05)，而ECP对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖活性有一定的抑制作用(P＝0.056)。但当ECP与浓度为10μg/mL的tHsp70体外非共价结合形成复合物后可减轻其对细胞增殖的抑制作用，浓度为100μg/mL和1μg/mL的tHsp70与抗原作用后其差异不明显。
(2)免疫基因表达分析
如图6所示，浓度为100μg/mL的tHsp70与海豚链球菌菌体或ECP体外非共价结合形成的tHsp70-抗原复合物及单独的tHsp70刺激罗非鱼外周血淋巴细胞24h均可以极显著提高其PGK，ICER，MMP9and MHC II四个基因的表达(P＜0.01)，10μg/mL和1μg/mL两个浓度对PGK，MMP9and MHC II三个基因的表达也有提高(P＜0.05)，100μg/mL与10μg/m、1μg/mL两个浓度的作用结果差异显著(P＜0.01)。罗非鱼外周血淋巴细胞12h，24h，48h and 72h四个时间点基因表达结果显示(图7)，tHsp70-菌体复合物组的PGK，ICER，MMP9and MHC II四个基因在4个时间点的表达量均极显著高于菌体组和无刺激对照组(P＜0.01)；从24h开始，菌体组与对照组4个基因表达量开始出现差异，48h后菌体组明显高于对照组(P＜0.05)。同时，ICER和MHC II两个基因在48h均达到表达峰值，而PGK和MMP9两个基因一直呈上升趋势。
实施例5：重组罗非鱼热休克蛋白70作为免疫增强剂和罗非鱼链球菌病疫苗免疫佐剂
(1)选健康的罗非鱼，体重60g～80g，由国家级罗非鱼良种场提供。用胰胨大豆琼脂(TSA)培养基随机对试验鱼的脑、肝和肾进行细菌分离，鉴定为阴性，并且试验鱼在塑料大桶(240L)中饲养连续7d未出现死亡方可试验。每天换水1/3，水温25℃～32℃，定时使用虹吸管进行吸污，使用增氧机通过气石不间断充气增氧。每天按体重2％的投喂量早上和晚上进行投喂。
(2)重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白(tHsp70)按照实施例1表达与纯化步骤获得。
(3)tHsp70-抗原复合物制备按照实施例2中重组分泌表达鱼热休克蛋白70与抗原体外结合方法获得。
(4)参考公开发表的学术报道，采用优化后的乳化复沉淀再包裹法进行免疫佐剂及抗原的海藻酸钠-壳聚糖微球包裹，试验分组包括tHsp70-thallus复合物组(tHsp70浓度为10μg/mL，菌体量为1.0×106cell)、tHsp70组(浓度为10μg/mL)、thallus组(菌体量为1.0×106cell)、空微球组、空白对照组，每组40尾罗非鱼，各免疫组分别免疫三次，免疫间隔为7天。实验鱼免疫前停止进食24小时，免疫时将制备的口服疫苗拌于日常投喂的罗非鱼配合饲料，晾干后进行投喂。
(5)罗非鱼链球菌病微球口服疫苗免疫效果检测
最后一次免疫10天后，使用罗非鱼链球菌CMS005菌株3倍半数致死量进行攻毒，攻毒后用鸡血平板对濒死和死亡试验鱼进行细菌分离，攻毒组死亡鱼均分离到链球菌，记录每个试验组的死亡数，持续到所有试验组连续5d未出现死亡的次日。计算各组的相对免疫保护率。
表1 重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白免疫罗非鱼的保护性结果
结果：
空白对照组死亡率达到70％，根据公式：免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率，计算不同免疫组的相对保护率，结果如表1所示，重组罗非鱼热休克蛋白70-菌体组、重组罗非鱼热休克蛋白70组、菌体组、空微粒组相对免疫保护率分别为78.57％、60.71％、53.57％、10.71％，表明罗非鱼热休克蛋白70具有良好的免疫增强剂和罗非鱼链球菌病疫苗免疫佐剂作用。
Claims (4)
1.一种罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂，其特征是重组罗非鱼热休克蛋白70作为佐剂在罗非鱼用口服疫苗的应用。
2.重组罗非鱼热休克蛋白70蛋白作为免疫佐剂用于罗非鱼病害防治的口服疫苗。
3.重组罗非鱼热休克蛋白70作为免疫增强剂用于罗非鱼养殖。
4.如权利要求1所述的罗非鱼用口服疫苗免疫佐剂，其特征是重组罗非鱼热休克蛋白70用于预防或治疗鱼类病害，特别是预防或治疗罗非鱼链球菌病感染的药物组合。
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