CN110960674A - 罗非鱼湖病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及罗非鱼湖病毒疫苗。本发明涉及包含罗非鱼湖病毒(TiLV)减毒株的疫苗组合物，其用于保护罗非鱼免受(TiLV)感染。本发明还涉及用于使用所述疫苗来保护罗非鱼免患TiLV诱导的疾病的方法。

Description

罗非鱼湖病毒疫苗

本申请是申请号为201580008562.3的中国专利申请的分案申请，原 申请是2015年2月11日提交的PCT国际申请PCT/IL2015/050158于2016 年8月12日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及用于保护鱼类免患病毒性疾病的疫苗。特别地，本发明涉 及用于在鱼(特别是罗非鱼(tilapine))中预防罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)诱导的疾病的疫苗组合物。本发明还涉及使用所述疫苗以 保护罗非鱼免患TiLV诱导的疾病的方法。

背景技术

在过去的几年中，在以色列加利利海(Sea of Galilee)(基内雷特湖 (KinneretLake))中的捕鱼量一直持续下降。有趣的是，尽管湖里生活 着约27种鱼(其中19种是地方性的)，涵盖以下科的成员：慈鲷科 (ciclidae)、鲤科(cyprinidae)、鲻科(mugillidae)和鲇科(claridae)， 但是罗非鱼的捕捞量减少特别显著。关于该湖泊的主要食用鱼加利略帚齿 非鲫(Sarotherodon galilaeus)，其年产量从2005年的316吨分别下降到 2007年的51吨、2009年的20吨和2010年的45吨。加利略帚齿非鲫(作 为食草鱼(grazing fish)有助于维持单细胞种群之间的生态平衡。因此， 除了任何经济的影响之外，圣彼得鱼(St.Peter’sfish)种群以及与另一些 湖泊的罗非鱼种群(例如吉利罗非鱼(Tilapia zilli)(普通罗非鱼)、奥利 亚口孵非鲫(Oreochromis aureus)(约旦罗非鱼)、弗氏妊丽鱼(Astatotilapiaflaviijosephi)和三列丽鲷(Tristamella simmonis/intermedia))的显著下降 代表对整个生态系统的明确威胁。下降的原因尚不清楚。

同样地，从2009年夏天开始，遍布以色列的养鱼场均记录到罗非鱼 的大规模损失事件。这些疾病爆发通过死亡波(wave of mortality)进行 区分，其从一个池到另一个池向心地传播。有趣的是，鱼发病和死亡保持 局限于罗非鱼(帚齿非鲫属(Sarthoredonspp.)和口孵非鲫属(Oreochromis spp.)及其杂种(hybrid))。发现与罗非鱼在一个群落饲养的数个物种(例 如鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲻鱼(Mugil cephalus)等)完全无症状，甚至在长期的共栖(cohabitation)后也是如此。而且，一旦死亡的初始波 停止，在同一个池中没有记录到更多的爆发。在湖泊的情况下，没有确定 死亡的任何明显原因。毒素的常规监测没有显示任何异常，也没有记录到 任何重大的生态变化；病原体的缜密检测无助于解决该谜团。

然而，加强监测已使人们认识到一个现象，即-在开阔水域和在农场 池塘二者中，通过黑色变色(black discoloration)、皮肤擦伤和眼部变性 (ocular degeneration)可观察到营养良好但虚弱的鱼。患病鱼的组织学 分析揭示存在增强的黑色素-巨噬细胞中心(melano-macrophage center， MMC)，这表明是一个持续的病理过程。

本发明人已经鉴定并分离了罗非鱼疾病的病原体(causal agent)，其 是一种新型的尚未鉴定的RNA病毒。该病毒(下文简称为罗非鱼湖病毒 (TiLV)在25个疑似的爆发中被检测到，从以色列各地养殖的罗非鱼以 及在加利利中海野生鱼中收集到。

相对于另一些免疫接种(immunization)途径，通过浴浸(bath immersion)免疫接种针对病毒感染的疫苗接种提供了数个优点。这些优 点是：每次进行鱼免疫的成本较低、对大量鱼进行大规模免疫接种、降低 应激、显著更高的鱼存活率以及没有对疫苗接种的不良反应。此外，浴浸 疫苗接种是用于对不能进行注射的较小的鱼进行大规模疫苗接种的有效 方法。或者，在淡水或海水水产养殖场通常对市售鱼疫苗采用IP注射， 原因是其可靠性和高效性，但是每只免疫接种鱼的成本高并且对鱼造成应 激。

与人疫苗相反，兽用产品(即，鱼疫苗)主要必须具有成本效益。认 为减毒的活疫苗是“低成本”生物制品，其可以以相对简单的设施来生产， 并且不需要使用昂贵的产品。此外，减毒的疫苗模拟自然感染，并且在免 疫接种后诱导较强的细胞免疫和体液免疫，其为鱼药的极佳选择。

商业疫苗可用于很多种病毒性和细菌性疾病。这些疫苗包括死疫苗、 减毒疫苗和亚单位疫苗。

因此，本发明的一个目的是提供可用于制备疫苗的活减毒TiLV毒株。

本发明的另一个目的是提供用于制备用于针对TiLV对罗非鱼进行免 疫接种的疫苗组合物的方法。

发明内容

在第一个方面中，本申请提供了疫苗组合物，其用于保护罗非鱼免受 罗非鱼湖病毒(TiLV)感染，所述疫苗组合物包含TiLV的减毒株。

在一些实施方案中，所述减毒株通过在组织培养物中连续传代 (sequentialpassage)获得。

在另一些实施方案中，所述减毒株通过在宿主中进行传代获得。

在一个具体的实施方案中，所述减毒株通过在组织培养物中至少12 次连续传代获得。在另一个具体的实施方案中，所述减毒株通过在组织培 养物中至少17次连续传代获得。在另一个具体的实施方案中，所述减毒 株通过在组织培养物中至少20次连续传代获得。

在另一些实施方案中，本发明的疫苗组合物还包含可接受的载体、稀 释剂或佐剂。

在本发明的另一个实施方案中，罗非鱼是慈鲷科成员。在一个具体的 实施方案中，罗非鱼选自以下物种或其任意杂种：帚齿非鲫属 (Sarotherodon)、非鲫属(Tilapia)和口孵非鲫属(Oreochromis)。

在另一个方面中，本发明提供了分离的TiLV，其以保藏登记号CNCM 1-4817保藏在法国巴斯德研究所的国家培养物和微生物保藏中心 (Collection Nationale deCultures de Microorganismes，CNCM)。

在另一个方面中，本发明提供了用于针对感染TiLV感染对罗非鱼进 行免疫的方法，所述方法包括向所述鱼施用包含TiLV减毒株的疫苗组合 物，其量足以诱导对随后TiLV感染的免疫力。

在本发明的方法的一些实施方案中，通过食物向鱼经口施用所述疫苗 组合物。在一个具体的实施方案中，所述疫苗组合物被保护性包衣包被。

在本发明的方法的另一些实施方案中，通过注射向鱼施用疫苗组合 物。在另一些实施方案中，将所述疫苗组合物溶解或浸入(immersing) 在水体中向鱼施用疫苗组合物。在另一些实施方案中，通过共栖在鱼中诱 导免疫力。在另一些实施方案中，通过将疫苗组合物喷洒到暂时从水体中 取出的鱼上来向所述鱼施用所述组合物。

本发明的方法的任何上述实施方案还可包括将经免疫接种的鱼在 31℃的温度下维持3至5天，然后转移到22℃下维持至少25天的步骤。

在另一个方面中，本发明提供了用于预防或治疗由TiLV引起的感染 的疫苗组合物，其中所述组合物包含TiLV的减毒株。

通过以下对本发明的实施方案的举例说明性且非限制性的描述将进 一步理解本发明的所有上述和其他特征和优点。

具体实施方式

本发明人最近鉴定出一种小的、以前未描述的RNA病毒，这是影响 加利利海中野生罗非鱼和以色列各地养鱼场中养殖罗非鱼的致命性疾病 的病原体。因为病毒是最初在加利利海的野生罗非鱼中发现，所以命名为 罗非鱼湖病毒(TiLV)。通过执行郭霍法则(Koch′s postulate)，获得了 (i)新分离的疾病、(ii)“神秘的”疾病和(iii)鱼类种群的下降之间的 联系。

基于以下数据，最终证明分离的病毒确实是疾病的原因。(i)该病毒 成功地从被感染的鱼中分离，但不能从未感染的标本中分离。(ii)将在细 胞培养物中传播的病毒接种到未感染的

鱼中可诱导致命性疾病。 (iii)对来自经实验性感染的鱼之样本提取物进行培养产生相同的病毒， 其在细胞培养物中再次繁殖。(iv)已成功应用了三个循环的这种“乒乓” 技术(ping-pong technique)。(v)将TiLV感染的鱼与未感染的鱼共栖也 诱导所述疾病(“自然的”传播)。(vi)在病鱼和在经感染的细胞培养物 中鉴定出特定的病毒RNA，而在未感染的鱼或未感染的培养物中则没有 鉴定出。

该病毒及其相关疾病的以下特性是值得注意的：(i)新出现的RNA 病毒传染性极高。(ii)它通过水传播。(iii)感染结果很大程度上取决于 环境和生态条件。(iv)病毒的培养在大的温度范围内是可行的。(v)显 然，TiLV具有相当窄的宿主范围，只感染罗非鱼，而与罗非鱼一起饲养 的其他物种则不受影响。(vi)目前为止所分析的病毒RNA片段序列与任何已知的病毒基因组都不具有显著的相似性，(vii)初次暴露下存活的鱼 中获得了获得性免疫。

TiLV在已建立的E-11系中繁殖，在感染后5至10天诱导细胞病变 效应。电子显微镜显示出55至70nm的裸露的二十面体颗粒。代表性文 库的筛选已允许鉴定TiLV-特异性序列，使得能够设计用于诊断的PCR 工具。PCR筛选证实在加利利海和遍布以色列的养鱼场二者中存在相同 的病毒。

在实验室中通常使用三种主要的方法来感染鱼：共栖、浴浸和注射攻 击(injection challenge)。虽然共栖和浴浸最接近地模拟自然暴露，但是 通过这些途径的感染率相对较低。

TiLV在诱导疾病中的作用是通过经实验腹膜内感染经噬斑纯化的较 低体外传代的病毒培养物或者通过与患病鱼共栖来证明的，其均造成了超 过80％死亡率的致命疾病。

共栖试验表明该疾病是传染性的，并且表明在受控条件下在感染后几 天内发生死亡，从而导致80％至100％的鱼死亡。在初次死亡中存活的鱼 对进一步的感染产生免疫，表现出获得适应性免疫。

对通过注射获得疾病和通过诱导更自然的非注射诱导疾病的参数进 行了鉴定。特别地，用来自病鱼的提取物和来自经感染的细胞培养物的上 清液两者攻击健康的无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)尼罗 罗非鱼(Oreochromis nilotica)。

在模拟真实自然条件(即26至28℃的温度)的环境条件下对注射和 共栖途径二者进行了测试。先对经感染的鱼的行为监测一段时间，之后进 行更详细的组织学分析。用标准技术(福尔马林固定、切片和染色)处理 来自天然的和实验性感染的鱼的器官样品，并用光学显微镜进行分析。

减毒株疫苗

活减毒疫苗使用已被减弱而使其无毒的活生物体，这意味着它们无法 造成疾病。可以以多种方式来实现减毒：

·在鱼中无毒的天然存在相关的生物体，包括宿主范围受限的生物体或 天然存在的无毒株。

·使有毒生物体在减弱所述生物体的条件下(例如在组织培养或苛刻的 物理条件下)进行多轮生长。

·化学诱变。

·对生物体进行遗传操作以降低毒力。

通常认为减毒株可作为有效的疫苗株，因为它们模拟天然的感染：它 们引起强烈的细胞和抗体应答，并且经常仅用一个剂量就可赋予持久免疫 力。减毒微生物成功地用于针对若干疾病对鱼进行免疫接种。因为幼鱼在 养鱼场中大量生长，一种保护它们免受病毒性疾病的最简单且最经济的方 法是通过水进行免疫接种。

减毒病毒株通常是通过选择从鱼中直接收集的无毒株，或通过在组织 培养物中对有毒株进行大量的连续传代获得。可以在最佳的病毒条件下 (温度、宿主、细胞系、介质化学组成等方面)或在次优条件下(即，在 愈加次优的温度或宿主生长)进行传代。在这两种情况下，在该步骤之后 进行选择/表征方法，目的在于鉴定具有高度免疫原性但表现出减弱的毒 力的病毒突变体。与化学诱变(使用例如5-氟尿嘧啶或羟胺的诱变物质) 或使用遗传操作(病毒重排(viral reassortant)、反向遗传学等)产生的 减毒株相反，这些突变体被定义为“天然存在的非毒性株”。

可通过任何上述方法制备根据本发明的活减毒病毒株。在本发明的一 个具体的实施方案中，通过在组织培养物中连续传代获得病毒剂。在本发 明的另一个实施方案中，通过在宿主中进行传代获得病毒剂。

术语“病毒”和“病毒株”和“株”是指但不限制于本文所描述的具 体分离物的密切相关毒株，即，与该分离的病毒株共有相似的基因型和/ 或表型特征的任何毒株。这包括保留相同的功能活性之病毒的稍微修饰的 形式或变体，即，氨基酸或核苷酸的添加、缺失或替换。

本文中使用的术语“无毒株”是指但不限制于不具有所有致病能力的 病毒。这种无毒病毒是用于所有类型的免疫接种(包括主动和被动免疫接 种)的减毒病毒。引起TiLV之能力降低的天然无毒对应物也涵盖在内。

本文中使用的术语“宿主”是指易受TiLV感染的鱼，特别是慈鲷科 成员。

为了确定获得减毒TiLV株所需的传代数，本发明人测试了数种(12、 17和20)传代数。

通过浴浸或i.p.注射，将30个健康的无特定病原(SPF)鱼(每条 10克)的群体暴露于本发明的不同的疫苗株。通过在接种疫苗后与患病 的鱼共栖30至45天，使这些群体受到由野生型株诱导的疾病的攻击。如 实施例2中所述，测定了经疫苗接种的鱼的存活率，并计算了相对存活百 分率(relative percent survival，RPS)。所得到的结果表明了疫苗株P17 和P20的效力，诱导经疫苗接种的鱼的显著免疫。所有的实验以25至28℃ (这是自然发生疾病的温度)的温度条件下一式三份地进行。

鱼的病毒性疾病通常是温度依赖的。例如，病毒性出血性败血症(viralhemorrhagic septicemia，VHS)在低于12℃的温度下发生，而锦鲤疱疹 病毒(Koiherpesvirus，KHV)感染则需要20至28℃的温度。因此，鱼 可以在非许可温度下被感染并产生免疫应答，而没有临床疾病。该方法已 在数个实例(包括病毒性出血性败血症(viralhemorrhagic septicemia， VHSV)、KHV和病毒性神经坏死(viral nervous necrosis，VNN))中被 证明成功地预防疾病。

在本发明的一个实施方案中，如上文中所述感染罗非鱼并将其在 22℃或31℃的温度下维持3至5天，之后分别转移到31℃或22℃温度下。

因此，在一个方面中，本发明提供了用于针对新发现的病毒(即TiLV) 对罗非鱼进行免疫接种的特定的疫苗。

本文中使用的术语“疫苗”是指能够针对由TiLV引起的感染产生免 疫应答的物质。该疫苗可包含活的或灭活的或死的(被杀死的)病毒或其 组合。

本文中使用的术语“免疫”或“免疫应答”是指一种免疫力，所述免 疫力可针对病毒感染引起体液和/或细胞介导的免疫应答，或干扰病毒的 活性、传播或生长。由本发明的疫苗免疫接种的鱼可能使感染性病毒受到 限制或不生长和传播。

本发明还涉及用于针对由TiLV引起的病毒感染对罗非鱼进行免疫接 种的方法，所述方法包括向易受感染的鱼施用包含活减毒TiLV的疫苗组 合物。以足以诱导针对随后TiLV感染之免疫力的量施用所述疫苗。

根据本发明的疫苗在共栖攻击模型中表现出显著的保护作用(RPS 值为55％至62％)。这些结果与市售疫苗非常相似，例如鲑鱼贫血病毒 (Salmon Anemia Virus，SAV)疫苗，其诱导65％的平均RPS。

使用非常类似于感染的自然模态的攻击模型(共栖)测试了本发明疫 苗组合物的效力。产生的数据强调了针对TiLV诱导的疾病对罗非鱼进行 免疫接种的工业可行性。

应指出，根据本发明的疫苗组合物适用于任何类型的易感染TiLV的 鱼，并且具体地是慈鲷科(俗称罗非慈鲷(tilapiine cichlids))的成员。 具有重要经济意义的罗非鱼的实例包括在口孵非鲫属、帚齿非鲫属和非鲫 属中包含的物种。在某些国家，使用2至4个罗非鱼物种的杂种也颇为盛 行，因此，由于所有可能的杂种，所以物种是无限的。因此，罗非鱼的任 何物种的任何杂种适用于根据本发明的免疫接种。

本文中定义的疫苗广义地是指能够在接种所述疫苗的鱼中刺激保护 性免疫应答的可施用形式的任何类型的生物制剂。

本文中将有效的免疫接种或疫苗接种剂量或用量定义为是在经疫苗 接种的鱼中将诱导针对随后的强毒株攻击的完全或部分免疫力的量。

本文中将有效的疫苗定义为针对TiLV感染提供等于或高于约50％ 的保护的疫苗。

减毒或失活定义为病原体的毒力的丧失。在减毒的情况下，毒力丧失 是逐渐的。具体的疫苗(减毒株或死制备物)的可用性是在感染区域水产 养殖可持续性的支柱。从技术上说，根据本发明的疫苗接种可通过经口施 用(通过食品)、通过水传播途径(即，在水体中分散疫苗，或通过预先 疫苗接种的鱼将减毒病毒排出至非疫苗接种的鱼)、注射(肠胃外施用， 包括皮内、肌内和腔内操作)或空气喷射方法进行。

在本发明的一个实施方案中，用死病毒或活减毒病毒对大量鱼群进行 疫苗接种通过饲料以口服施用来实现。该疫苗可以并入由保护性包衣包被 的食品内。

在另一个实施方案中，可通过注射或以个体施用来进行疫苗接种，其 在大规模下也是可行的，并且由(手动)疫苗接种专业人员或者优选地借 助于半自动化机器来实现。

在本发明的另一个实施方案中，大量鱼的疫苗接种通过将病毒或疫苗 组合物溶解或浸入在水体中从而向存在于水体中的整个鱼群体同时施用 减毒病毒来实现。

用于通过减毒疫苗对大量鱼群进行疫苗接种的另一个选择利用其可 在最终的宿主中进行(有限的)复制的优势。因此，在本发明的再一个实 施方案中，向有限数目的对象施用疫苗组合物，其中所述减毒病毒复制、 排出并传播到与所述经接种疫苗的鱼在同一群体中饲养的其他鱼。

在本发明的另一个实施方案中，通过用疫苗喷洒暂时从水中取出的鱼 来实现鱼的大量疫苗接种。

可通过将经TiLV感染的鱼与未感染的鱼共栖在易受感染的鱼中诱导 根据本发明的免疫力。

根据本发明的鱼免疫接种可以在任何天然或非天然的环境中发生，例 如池塘、湖、水族箱(aquarium)、养鱼场和淡水栖息地。

本发明的疫苗组合物可在鱼获得免疫能力(immune-competence)后 的任何时间有效地施用，对于罗非鱼而言，在孵化后的约2至14天施用。

与未接种疫苗的对照组的数目相比，证明经感染鱼的数量降低或存活 的鱼的数目提高，则认为在鱼群体中已经诱导了免疫力。

制备病毒剂或病毒株以用于通过以免疫有效量或剂量的制剂向鱼施 用。所述剂量还可包含本领域已知的可药用的载体、稀释剂和/或佐剂， 例如水、生理盐水、油(乳剂)、脂质体、包衣或包封剂。

本发明还涵盖活减毒病毒株用于制备用于针对TiLV引起的感染对罗 非鱼进行免疫接种之疫苗组合物的用途。所述组合物包含活减毒病毒作为 活性成分。

在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗由TiLV引起的感染的 疫苗组合物，其中所述组合物包含TiLV的减毒株。

在另一个方面，本发明涵盖TiLV的减毒株在制备用于针对TiLV引 起的感染对罗非鱼进行免疫之疫苗组合物的用途。所述组合物包含活减毒 病毒作为活性成分。

现在将参照具体实施例和材料对本发明进行描述。

实施例

材料和方法

细胞培养

使用8个已建立的鱼细胞系：(1)来自大鳞大麻哈鱼(chinook salmon，Oncorhynchus tshawytscha)的CHSE-214系(ATCC CRL 1681)；(2) 来自于蓝鳃太阳鱼(bluegill，Lepomis macrocturus)的BF-2系(ATCC CCL 91)；(3)来自云斑鮰(brownbullhead，Ictalurus nebulosus)的BB系 (ATCC CCL 59)；(4-5)来自鲤鱼(common carp，Cyprinus carpio)的 EPC和KF-1；(6)来自虹鳟鱼(rainbow trout，Salmo gairdneri)的RTG-2 系(ATCC CCL 55)；(7)来自黑头呆鱼(fat head minnow，Pimephales promelas)的FHM系(ATCC CCL 42)；(8)来自线鳢(striped snakehead， Ophicephalus striatus)的E-11。

如先前在别处所描述(Stenglein等，2012)，制备用于病毒培养的原 始罗非鱼细胞系，称为Til 13。简言之，通过麻醉剂过量处死50g经麻醉 的鱼，无菌地取出脑。然后用剪刀将脑剪碎，手动地匀浆并使其通过100 μm的筛网研磨器(mesh grinder)；然后清洗细胞，并在25℃下在12.5ml 的密封瓶(Becton-Dickinson，San Francisco，USA)中接种。原始培养基 含有80％的Leibovitz(L-15)培养基(Gibco，USA)、10％灭活的胎牛 血清(Gibco，US)和10％灭活的罗非鱼血清；培养基补充有L-谷氨酰 胺(300mg/l)、HEPES(1％)、青霉素(100μg/ml)、链霉素(100μg/ml) 和两性霉素B(0.25μg/ml)。在孵化的前21天期间，每周更换50％的培 养基。此后，将围绕每块(clump)的单层细胞用胰蛋白酶处理，并转移 到具有条件化培养基(50％旧培养基加上50％的新培养基)的新的25ml 瓶(Cellstar；Greiner bio-one，Germany)中。每隔一周将原代细胞的培 养物进行传代；认为在35次传代后细胞系是稳定的；在该时间点时略去 罗非鱼血清，停止条件化，每2至3周分开(split)细胞。

病毒和病毒培养

从位于以色列多个地方(上加利利(Upper Galillee)、约旦河谷和地 中海沿岸)的以色列六个不同的养殖场在2011年5月至2013年3月间发 生的疑似疾病暴发中获得共计25个TiLV分离物，以及来自加利利海多 种物种的野生罗非鱼。将养殖鱼的暴发定义为突然的和不明原因的死亡升 高(每天2％或更高)持续至少连续三天。如果在同一养殖场中两个监视 区(ward)同时受到影响，则这些被归类为单次疾病暴发。因此，每个 分离物代表不同的临床暴发。将来自野生鱼的病毒从显示眼部病变的商业 捕鱼中分离；这些分离物各自代表不同的捕获。为了将污染风险减到最小， 无菌地取出可疑鱼的脑和内脏(肾、肝、脾和心脏)并用9体积的Hanks 平衡盐溶液(Hanks’balanced salt solution，HBSS)手动地匀浆，在3000×g 下离心10分钟并将上清液通过0.22lμm的膜滤器(Starsdet，Germany) 进行过滤。将滤液储存于-80℃直至使用。

测试对病毒感染的敏感性

将覆盖25cm²瓶(Cellstar；Greiner bio-one，Germany)的85％至95％ 的单层用HBSS清洗两次，然后在细胞培养物中接种500μl的病毒滤液。 在25℃下孵育1小时后，用HBSS清洗瓶，并补充L-15培养基(2％FBS)， 并在25℃下孵育。每天观察CPE，持续21天。

病毒的滴定

将原始的含病毒的培养上清液(从圣彼得鱼的脑获得的毒株TiLV 4/2011)在E-11细胞中进行培养，并用HBSS以10倍的增量连续稀释； 将来自每个稀释度的50μl接种至96孔板中E-11单层上。每个经稀释的 样品使用四个孔。将板在25℃下孵育并每天观察CPE。7天后，通过Reed &Muench(1938)的方法计算50％组织培养物感染剂量(TCID₅₀ ml^-1)。 通过实时PCR获得病毒的绝对定量(见下文)。

病毒生长的滴定

因为很少认为鱼病毒的生长是温度依赖的，所以这反映了病原体在限 制的温度范围内导致疾病的能力。这种倾向根据鱼的种类和病毒而变化。 为了确定在不同温度下生长程度，在MOI(感染复数)为1.0(通过实时 PCR评估的绝对定量)的24孔板中的E-11单层培养物中接种毒株TiLV 4/2011，在15℃、20℃、25℃和30℃下保持21天。通过刮擦收集经感染的培养物，冻融，离心(3000×g 10分钟)，并用HBSS以10倍增量连续 稀释。如上所述测定TCID₅₀计数。通过实时PCR获得病毒的绝对定量(见 下文)。

从培养基中纯化病毒

用毒株TiLV 4/2011感染培养的E-11细胞，毒株TiLV 4/2011最初是 2011年6月从基内雷特湖收集的患病加利利罗非鱼(圣彼得鱼)中分离 出来的。通过以3000×g离心10分钟从经TiLV感染的细胞收获的培养基 中清除细胞和细胞碎屑。为了进一步浓缩病毒颗粒并将其从密度较低的颗 粒中分离出来，将上清液在2ml的30％(重量/体积)的蔗糖-TE缓冲垫 上分层，并用T865转子在65,000rpm下离心2小时(Sorvall Discovery 90SE)。为了进一步纯化，将沉淀重悬于TE缓冲液中并在蔗糖阶梯性梯 度(step gradient)上分层。梯度的每一层由TE中3ml的蔗糖组成，浓 度为70％、60％、50％、40％、30％、20％和10％[重量/体积(从底部至 顶部)]。用TST41.14转子在40,000rpm下(Sorvall Discovery 90SE) 超速离心2小时。使条带可视化，从管中吸出，并通过用T865转子在65,000 rpm下(SorvallDiscovery 90SE)离心2小时来再沉淀。将最终的沉淀重 悬浮于3ml的PBS中。采用100μl的等分试样接种E-11细胞并监测细 胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。将沉淀在-80℃冷冻直至进一步研 究。

从经纯化的病毒粒子中分离核酸

通过使用peqGOLD Trifast[(PEQLAB，Germany)，用于RNA]或 高纯度PCR模板制备试剂盒[(Roche，Germany)，用于DNA]从经纯化 的病毒粒子沉淀中提取核酸(RNA和DNA)。

实时定量PCR

将一步实时PCR测定设计为单管PCR探针水解(TaqMan)测定以 用于检测和定量感染的组织或培养的单层中的TiLV。

将特异性寡核苷酸引物和产荧光探针设计为靶向先前在大肠杆菌(E. coli)文库转化体中鉴定的450bp片段的特定的250bp片段。使用与上 文描述相同的方案，使用正向ME1引物GTTGGGCACAAGGCATCCTA，ME2 反向引物TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT和FAM探针AGGGAACGGCTATTG(全部以5’-3’方向书写；Hylab，Israel)。

试剂(qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)购自Quanta biosciences(ND，USA)。按照下列热循环参数运行PCR混合物：在50℃ 下逆转录10分钟，在95℃下酶失活1分钟，然后进行45个循环的95℃ 下10秒(变性)、60℃下退火并延伸30秒。PCR测定后，以0.5℃\秒的 加热速率进行熔解曲线(melt curve)步骤(进行10秒)以及进行连续荧 光测量。所有PCR产物均具有预测的分子量，这表明发生了特异性扩增。 在每个PCR运行中分别包含由TiLV cDNA和非模板反应混合物组成的阳 性和阴性对照。

实时PCR数据分析

为了定量TiLV cDNA浓度，通过分析设计为250bp片段的PCR产 物与含有TiLV450bp DNA的质粒的连续稀释产生标准曲线。通过评价 和分析ΔCt变化(cDNA模板的最终量＝25ng/孔)，记录250bp TiLV片 段的绝对病毒定量。使用2-ΔΔCt法，通过将TiLV浓度相对于β肌动蛋 白mRNA(反向和正向引物5’-GGGTCAGAAAGACAGCTACGTT-3’和 5′-CTCAGCTCGTTGTAGAAGGTGT-3’(Hassanin等，2009)的浓度归一 化从而获得每个细胞病毒粒子的相对定量(relative quntification，RQ)， 并将对照组中的调节表达作为参照(RQ＝1)。样品以一式两份进行定量， 并且将所有的值表示为平均值±平均值的标准误(SEM)。

β肌动蛋白以及EF-1α的表达在多个实验中保持恒定(p＞0.05)，而 18S rDNA的表达降低(P＜0.05)，从而表明所选择的β肌动蛋白适用于 作为归一化基因。

通过Applied Biosystems StepOneTM软件v2.0来分析数据，并将数 据表示为RQ。进行描述性统计(平均值±平均值的标准差)来描述体内 和体外实验中的RQ。

实验操作

疾病的实验性再现

罗非鱼物种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)(品系Chitrellada) 在28℃的恒定温度下于SPF设施(经UV处理的无病原体的环境)中生 长。以2％重量/重量的每日方案喂养鱼；由于每天稳定地换水，水参数(O₂＞ 5ppm；NH₄ ⁺＜1ppm；NaCl＜1ppt)保持不变。

用TiLV分离物4/2011进行所有的实验性感染。分离物4/2011是场 地株(fieldstrain)(第1代)，其通过一次传代扩增以建立高滴度的种库 (high-titer seed-stock)(第2代)，将其等分并在-80℃冷冻保存。在使用 前，将该病毒解冻并重新培养(第3代)。

分离物病毒株4/2011于2013年11月8日以登记号CNCM I-4817保 藏在法国巴斯德研究所的国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)。

实施例1：

疾病的实验性再现

为了人工再现疾病，向每条鱼(各自称重为30-35克)腹膜内注射 2.6×10⁵ TCID₅₀(50％组织培养感染剂量)。所有实验各组(每组30条鱼) 以一式三份进行。在实验过程中，鱼被关在200升的水族箱中，所述水族 箱被水可渗透的网格分为三个隔室，这使水在整个水族箱流通(但鱼不 能)；对照组始终保持在中间。在相同的条件下进行共栖试验，将感染的 鱼置于中间。将在初次腹膜内(IP)感染中存活的鱼合并。此后三周将鱼 分为两个一样的组(每组20条鱼)并通过IP注射再次进行感染。对照组 注射有未感染的E-11培养物。

通过一系列3个连续的“培养和感染”实验确切地证明该分离的病毒 是疾病的原因，其中来自患病鱼的脑的培养物用于再次感染未患病的鱼。

通过用单个噬斑分离的病毒注射鱼来完成这一系列的感染。

为了更真实地模拟养殖场条件和评估病毒的繁殖和传代在易受感染 的群体中的作用(将鱼置于封闭的环境中，如在集约化养鱼中)，如下进 行了一系列五个连续的感染：将一组(临床患病)实验性感染的鱼置于水 族箱的第一隔室，而将一组未感染的鱼置于第二隔室。一旦第一组未患病 的鱼染上疾病(20％死亡率)，则引入新的一组未感染的鱼(至第三隔室)， 并移出最开始的那一组，使得在其位置处引入新组。总共进行五次这些“乒乓”连续感染。

在整个生长和实验期间仔细地监测鱼的健康状况：每天两次监测外部 迹象和死亡率，共计进行21天。伦理问题、动物护理、实验操作和安全 法规符合以色列兽医机构实验动物护理小组委员会(Subcommittee on Laboratory Animal Care at the IsraeliVeterinary Services)建立的指南。

实施例2：

传代-减毒的活疫苗

开发了活减毒株的三种变体作为潜在的疫苗候选物。所有的变体由在 体外连续传代的TiLV分离物4/2011组成；根据上文中所述的方法，利用 细胞系Til 13在25cm²瓶中进行传代。

疫苗类型之间的差异在于传代的数目：第一疫苗株，称为P12，传代 12次；第二株，表示为P17，传代17次；而第三个株，称为P20，传代 20次。在175cm²瓶中进行最后传代(根据所述株进行12、17和20次)。 然后将瓶冻融并通过离心(3000×g 10分钟)除去细胞碎片。通过50％组 织培养物感染剂量(TCID₅₀ ml^-1)定量位于上清液中的病毒，通过Reed &Muench(1938)的方法以及通过实时PCR进行计算。每种疫苗都是 PBS稀释的以包含(以最终剂量100μl计)1.3×10²的TCID₅₀。

通过以下方式进行安全性研究，包括确定潜在的残留毒力和毒力的可 能回复：(i)注射(以三组，每组100条鱼)十倍剂量(即1.3×10³的TCID₅₀) 的P12、P17和P20病毒变体，和(ii)注射(以三组，每组100条鱼) 1.3×10²TCID₅₀的各个变体的5次来回传代(以最终剂量100μl计)。监 测死亡率和不良反应，进行30天。疫苗接种后6周和12周(n＝15每组， 每个采样)采用改进的Speilberg量表(Midtlyng和Lillehaug，1998)记 录死亡率和副作用(内脏的粘连和黑化)。

鱼和用于感染经疫苗接种的鱼的设置与先前在实施例1中“疾病的实 验性再现”下所描述的基本相同。简言之，用100μl含有P12、P17或 P20 TiLV病毒的PBS注射SPFChitrellada尼罗罗非鱼(每组30条鱼， 每个称重30-35克)的群体。为了方便操作，通过Metacaine(MS222， PHARMAQ Ltd，UK)使鱼镇静。通过手动地经腹膜内注射100μl的剂 量进行疫苗接种。此后，将经疫苗接种的鱼置于水族箱的第一隔室中(参 见实施例1中的水族箱描述)，而将未感染的鱼(相同的数目和尺寸)置 于第二隔室。疫苗接种后三周，将经感染的鱼引入至第三隔室。感染的鱼 包括通过与水族箱中患病的鱼共栖6小时而被感染的30条未感染的鱼， 其中毒力通过野生型病毒的4次传代而增强。每天监测水箱以观察疾病或 死亡的临床迹象。向对照鱼注射100μl来自未感染的Til-13培养物的非稀 释培养基。记录的死亡率数据用于计算相对存活百分率(Relative Percentage Survival，RPS)，如由Amend(1981)所描述的：

RPS＝1-[(处理组的死亡率(％))/(对照组的死亡率(％))]×100。

结果：通过疫苗接种的特异性TiLV保护

确定P12疫苗株含有7.0×10⁷的TCID₅₀ml^-1，对应于5.2×10⁷个实时 PCR列举的病毒颗粒，而P17疫苗株含有1.2×10⁸的TCID_s0ml^-1，对应于 8.0×10⁷个实时PCR列举的病毒颗粒。至于P20疫苗株，TCID 50ml^-1的 组成为8.9×10⁷，对应于8.7×10⁷个实时PCR病毒颗粒。

通过用野生型株攻击诱导的特异性死亡在第2至4天开始并持续5 至7天。所有的死鱼都是TiLV阳性。濒死迹象包括明显的嗜睡和轻微的 黑变病(melanosis)。除了轻微淤血之外，在内脏器官中没有观察到其他 整体病变。

不同组的经疫苗接种鱼的存活率和相对存活百分率(RPS)值示于表 1中。在用P17疫苗接种的鱼中，测定RPS值为58％(在不同组之间的 变化＝56％-61％；P＞0.05)；经P20疫苗接种的鱼的RPS为59％(组间 的变化＝55％-62％；P＞0.05)，其与用P17获得的相似。发现这些组的绝 对存活率分别为62％和64％，而在对照组和在P11疫苗接种的鱼中死亡率为63％。

安全性数据指出，对于P17和P20疫苗原型，5次来回传代和疫苗量 的十倍提高都不会引起不期望的影响(患病或死亡)。

表1：受TiLV攻击的通过P12、P17和P20疫苗进行疫苗接种的尼罗罗 非鱼的相对存活百分率(RPS)(％)

	存活	死亡率(％)	RPS(％)
				对照鱼	3	97	-
经P12疫苗接种的鱼	37	63	-
				经P17疫苗接种的鱼	62	28	58
经P20疫苗接种的鱼	64	26	56

Claims (26)

1.疫苗组合物，其用于保护罗非鱼免受罗非鱼湖病毒(TiLV)感染，所述疫苗组合物包含TiLV的减毒株。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述减毒株通过在组织培养物中连续传代获得。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述减毒株通过在宿主中传代获得。

4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述减毒株通过在组织培养物中至少12次连续传代获得。

5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述减毒株通过在组织培养物中至少17次连续传代获得。

6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述减毒株通过在组织培养物中至少20次连续传代获得。

7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其还包含可接受的载体、稀释剂或佐剂。

8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述罗非鱼是慈鲷科(Cichlidae)成员。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述慈鲷科成员选自以下物种或其任意杂种：帚齿非鲫属(Sarotherodon)、非鲫属(Tilapia)和口孵非鲫属(Oreochromis)。

10.分离的TiLV，其以保藏登记号CNCM 1-4817保藏在法国巴斯德研究所的国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)。

11.用于针对感染TiLV感染对罗非鱼进行免疫接种的方法，其包括向所述鱼施用包含TiLV减毒株的疫苗组合物，其量足以诱导对随后TiLV感染的免疫力。

12.根据权利要求11所述的方法，其中通过食物向所述鱼经口施用所述疫苗组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疫苗组合物被保护性包衣包被。

14.根据权利要求11所述的方法，其中通过注射向所述鱼施用所述疫苗组合物。

15.根据权利要求11所述的方法，其中通过将所述疫苗组合物溶解或浸入在水体中来向所述鱼施用所述疫苗组合物。

16.根据权利要求11所述的方法，其中通过共栖在所述鱼中诱导所述免疫力。

17.根据权利要求11所述的方法，其中通过将所述疫苗组合物喷洒到暂时从水体中取出的鱼上来向所述鱼施用所述疫苗组合物。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其还包括将经免疫接种的鱼在31℃的温度下维持3至5天，然后转移到22℃维持至少25天。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述减毒株通过在组织培养物中至少12次连续传代获得。

20.根据权利要求11所述的方法，其中所述减毒株通过在组织培养物中17次连续传代获得。

21.根据权利要求11所述的方法，其中所述减毒株通过在组织培养物中20次连续传代获得。

22.根据权利要求11所述的方法，其中所述减毒株通过在宿主中传代获得。

23.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述疫苗组合物还包含可接受的载体、稀释剂或佐剂。

24.根据权利要求13所述的方法，其中所述罗非鱼是慈鲷科成员。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述慈鲷科成员选自以下物种或其杂种：帚齿非鲫属、非鲫属和口孵非鲫属。

26.疫苗组合物，其用于预防或治疗由TiLV引起的感染，其中所述组合物包含TiLV的减毒株。