CN101890159B - 罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗及其制备方法，该疫苗是将从发病罗非鱼体内分离出的海豚链球菌和无乳链球菌分离纯化、液体活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤，以及将灭活完全的菌体按等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。通过使用可调连续注射器对罗非鱼进行胸腔或腹腔免疫，能有效防治罗非鱼链球菌病的发生，可应用于罗非鱼养殖中。

Description

罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种罗非鱼疾病的预防用疫苗，具体说涉及罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法。
背景技术
罗非鱼原产热带、亚热带，属暖水性鱼类，具有繁殖力强、生长速度快、粗食、抗病力强等优点，是当前水产养殖业的重要养殖品种之一。随着全球性海洋捕捞渔业资源的衰退，国际市场对水产养殖产品的需求越来越大。我国罗非鱼养殖业发展迅速，产量以平均每年14.75％左右的速度递增，稳居世界首位。据中国水产流通与加工协会罗非鱼分会提供的数据，2008年我国罗非鱼产量120万吨，约占全球罗非鱼总产量的55％，其中出口量22.44万吨，是我国水产品出口创汇主要品种之一。
近年来随着片面地重视规模化发展和高产，造成罗非鱼养殖病害频频暴发，养殖发病率高达75％。其中最主要的病害为链球菌病，并且有逐年递增的趋势。按2008年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达15-30亿元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约我国罗非鱼产业继续向前发展的瓶颈。然而，目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。疫苗免疫是预防和控制罗非鱼链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一，必需及早研制。研究发现，罗非鱼链球菌病的流行菌种主要为S.iniae链球菌和S.agalactiae链球菌。
发明内容
本发明的目的是为了控制罗非鱼链球菌病的传播与爆发，提供一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，该方法利用分离到的高免疫原性强毒力链球菌菌株，通过培养基和培养条件的优化培养提高主要保护性抗原的产量，以及采用的灭活方法可以减少灭活制备过程抗原的损失，组分的配伍设计科学合理，对目前养殖罗非鱼的常见品种均能起到保护作用，有效地预防链球菌引发的链球菌病。
本发明采取的技术方案是：
将从病鱼体内分离出的链球菌菌株分离纯化、液体活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤，以及将灭活完全的菌体按等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。
所述链球菌菌种包括：海豚链球菌和无乳链球菌。
申请人已将所述菌种送到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2009年11月23日，无乳链球菌保藏编号为CCTCCNO：M209278，提议的分类命名为无乳链球菌KS029，streptococcus agalactiae KS029；海豚链球菌保藏编号为CCTCCNO：M209279，提议的分类命名为海豚链球菌CMS005，streptococcus iniaeCMS005。
本发明制备方法的步骤为：
(1)将从病鱼体内分离的海豚链球菌和无乳链球菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；
(2)分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为20-24小时；
(3)按2％或3％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆液体培养基中，培养温度28±0.5℃，培养时间24-48小时，当链球菌生长到108或109CFU/ml，停止反应；
(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.1-0.5％福尔马林溶液，灭活24-48小时；
(5)0.22μm滤膜超滤后用磷酸盐缓冲溶液将所得菌体稀释成浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml；
(6)根据罗非鱼的发病规律及程度，将以上两种灭活菌以等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。
罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的使用方法：将制备好的二联链球菌疫苗，使用连续注射器对罗非鱼进行胸腔或腹腔注射疫苗，剂量0.2-0.4毫升/尾，浓度在5×107-5×108CFU/ml。
本发明的有益效果：
1.本发明的罗非鱼二联链球菌灭活疫苗使用安全，无药物残留，免疫防治效果显著，能够有效防治罗非鱼链球菌病的发生，免疫保护率达85％以上；
2.二联苗设计科学合理，免疫效果好于单一链球菌灭活疫苗；
3.使用可调连续注射器对罗非鱼进行胸腔或腹腔免疫，接种方便，大大提高了免疫效率和接种疫苗剂量准确性；
4.本发明的疫苗其制备方法操作简单，成本低廉，且疫苗可用于罗非鱼养殖、疾病的防治，具有很高的商业价值。
具体实施方式
1.将从病鱼体内分离的海豚链球菌和无乳链球菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；
2.分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为20-24小时；
3.按2％或3％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆液体培养基中，培养温度28±0.5℃，培养时间24-48小时，当链球菌生长到108或109CFU/ml，停止反应；
4.取出步骤(3)培养的菌液，加入0.1-0.5％福尔马林溶液，灭活24-48小时；
5.0.22μm滤膜超滤后用磷酸盐缓冲溶液将所得菌体稀释成浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml；
6.最后根据罗非鱼的发病规律及程度，将以上两种灭活菌以等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。
该疫苗的保存方法是：疫苗成品保存于4℃，疫苗原液保存于-20℃。
7.疫苗的安全性检查方法有三种：一是将灭活的菌体接种到胰蛋白胨大豆液体培养基中振荡培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为24-48小时，如培养液无混浊情况出现，即无细菌生长表明灭活完全；二是将灭活的菌体接种到胰蛋白胨大豆固体培养基培养，培养温度28±0.5℃，培养时间为24-48小时，无菌落出现表明灭活完全；三是将灭活好的疫苗腹腔注射50-100克的罗非鱼，注射剂量0.4-0.6毫升/尾，养殖观察15-20天，如鱼无发病症状和死亡，表明该疫苗灭活完全且安全。
8.罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的使用方法：将制备好的二联链球菌灭活疫苗，用可调连续注射器胸腔或腹腔注射0.2～0.4毫升/尾，实施注射免疫。鱼体大小在25克以上均可以进行注射，鱼体体重为25-150克时注射0.2-0.3毫升/尾，体重150克以上时注射0.3-0.4毫升/尾，注射疫苗浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml。

Claims (2)

1.一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：将从发病罗非鱼体内分离出的链球菌菌株分离纯化、液体活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤，以及将灭活完全的菌体按等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗；
所述链球菌菌种包括：海豚链球菌CCTCCNO：M209279和无乳链球菌CCTCCNO：M209278。
2.根据权利要求1所述的罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)将从病鱼体内分离的海豚链球菌和无乳链球菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；
(2)分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为20-24小时；
(3)按2％或3％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆液体培养基中，培养温度28±0.5℃，培养时间24-48小时，当链球菌生长到108或109CFU/ml，停止反应；
(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.1～0.5％福尔马林溶液，灭活24-48小时；
(5)0.22μm滤膜超滤后用磷酸盐缓冲溶液将所得菌体稀释成浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml；
(6)根据罗非鱼的发病规律及程序，将以上两种灭活菌以等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗。
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