CN109097298A - 一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法 - Google Patents

Abstract

一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，属于生物技术领域。涉及多种蛭弧菌的富集法培养、宿主菌培养及其生物制剂的生产方法。其特征在于利用富集培养法培养的养殖水体中自然形成的蛭弧菌体系为生物制剂的蛭弧菌菌种来源，以养殖水体中的致病性弧菌经纯化、培养、离心、灭活后做为生产蛭弧菌制剂的宿主菌来源，生产一种含有多种蛭弧菌的生物制剂。这种方法生产的蛭弧菌制剂，由于含有多种蛭弧菌，具有活性高、作用迅速、对水体中的病原菌裂解普广等特性。

Description

一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法

技术领域

本发明属于微生物除菌技术领域，具体涉及一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法。

背景技术

目前消除养殖水体中致病菌的方法主要以各种消毒剂和抗生素对水体进行消毒净化处理，这种方法能够迅速杀灭水体中的致病菌，但也杀灭了水体中的有益微生物，破坏了水体的微生态系统。长久的使用消毒剂及抗生素，导致致病菌的耐药性逐年增强，使用消毒剂和抗生素最终不能有效的控制致病菌。

近年来，利用有益微生物控制水产养殖中的病原微生物越来越受到各方关注，尤其是噬菌蛭弧菌制剂，它具有有效的裂解养殖水体中的副溶血弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病性微生物，而且不使病原菌产生耐药性，对人和动物无害等优点，备受人们关注。

目前市场上的蛭弧菌制剂是以经过筛选纯化后的单一的、或人工复配的多株纯化后的蛭弧菌来生产，其工艺较为繁复，批次生产周期长、成本大。譬如专利申请号为201610513338.6的技术专利，提供了一种嗜菌蛭弧菌的生产方法，名称为“一种嗜菌蛭弧菌的生产方法”、专利申请号为93111749.6的技术专利，提供了一种嗜菌蛭弧菌的生产方法，名称为“生物制菌王及其生产方法”、专利号为00129401.6的技术专利，专利名称为“嗜菌蛭弧菌生物制剂及其生产方法”，提供了一种无宿主菌生产噬菌蛭弧菌的方法。上述生产蛭弧菌制剂所用蛭弧菌都是经过纯化后获得的单一的蛭弧菌菌株做为菌种，而养殖水体中通常同时具有多种致病菌，单一蛭弧菌菌株对多种致病菌的裂解能力是有限的，故存在应用效果不明显等问题。本发明克服了上述缺点，以本技术制备的蛭弧菌制剂应用于养殖水体，对于多数致病性微生物具有较强的裂解效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种以养殖水体中富集培养采集的多种蛭弧菌用于生产蛭弧菌制剂的方法。

本发明的具体方案如下：一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：宿主菌的分离：以TCBS选择性培养基培养分离并纯化养殖水体水样中的弧菌，并做为制备噬菌蛭弧菌制剂的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液的制备：将步骤一纯化后的弧菌在液体培养基中培养至弧菌生长的稳定期后，得到发酵液；发酵液经离心分离去掉发酵液培养基，将余下弧菌菌体的菌泥以等体积的灭菌海水稀释，做水浴热灭活处理，获得灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：将过滤除菌后的养殖水体水样加入步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，摇床培养至液体由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：取步骤三制备的蛭弧菌富集培养液与步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，制备双层平板，培养至出现噬菌斑并融合后，加入灭菌海水浸泡，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液。

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤四的蛭弧菌母液与灭活宿主菌悬浮液进一步扩大培养，得到蛭弧菌母液扩大液；按比例将灭活宿主菌浓悬液、蛭弧菌母液扩大液加入过滤除菌海水中，即为噬菌蛭弧菌制剂。

进一步的，所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其具体工艺流程如下：

步骤一：宿主菌的分离：取养殖水体水样接种于TCBS弧菌选择性培养基，涂布均匀后置于35℃的恒温培养箱中倒扣培养24小时，从出现的弧菌菌落中，挑取蓝绿色单菌落的弧菌在TCBS平板上连续划线接种培养3～5次，直到出现显微镜观察菌体形态一致、菌落形态一致的菌落，再接种于NB斜面试管培养24小时，即为本制剂的弧菌的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液制备：将步骤一纯化后的宿主菌菌种以NB培养基试管扩大培养，取经24小时培养后的试管菌种，无菌操作注入稀释液，洗下试管斜面上的菌苔，接种于经121℃灭菌的弧菌增菌液体培养基，置于120r/min、35℃摇床培养24～36小时，进入菌弧生长的菌数稳定期即为得到需要的弧菌发酵液；将弧菌发酵液置于6000r/min离心15分钟，去掉发酵液培养基部分，将余下的弧菌菌泥以等体积的灭菌海水稀释为宿主菌浓菌悬液，进行水浴热灭活处理，即为灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：取养殖水体水样，经0.22um孔径的细菌滤器过滤除菌后，接种步骤二中制备的灭活宿主菌浓悬液，置于120r/min、25℃～30℃的摇床培养5～7天，培养液由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：制备双层平板：将琼脂加热溶于自然海水中，琼脂浓度为5g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，装入三角瓶中即为上层培养基；将琼脂加热溶于自然海水，琼脂浓度为15g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，倒入平板中，每只平板倒入15mL，即为下层平板；将上述上层培养基和下层平板置于121℃灭菌30分钟后，下层平板冷却待用，将装有上层培养基的三角瓶置于45℃水浴锅中待用；将步骤三噬菌蛭弧菌富集培养液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例加入水浴45℃的上层培养基，混合均匀后倒入冷却的下层平板中，使上层培养基均匀分布在下层平板内的下层培养基的上方，将平板移入28℃恒温箱培养5～7天，培养24小时后开始出现大小不一的噬菌斑，5～7天噬菌斑融合后，在平板中加入灭菌海水浸泡4小时，将浸泡液移入无菌试管中，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：蛭弧菌母液扩大液的制备：取灭菌海水、步骤四制备的蛭弧菌母液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于150r/min、28℃的摇床培养5～7天，液体清澈后即为蛭弧菌母液扩大液；取过滤除菌的海水、以上制备的蛭弧菌母液扩大液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于25℃～28℃静置培养5～7天，即为噬菌蛭弧菌制剂。

进一步的，步骤一所述的宿主菌菌种为养殖水体水样中分离并纯化的副溶血弧菌。

进一步的，步骤二所述的弧菌增菌液体培养基配方为：胰蛋白胨5g/L～20g/L、鱼蛋白胨5g/L～20g/L、酵母膏1g/L～10g/L氯化钠20g/L～40g/L，溶剂为自来水。

进一步的，步骤二所述的灭活宿主菌浓悬液在灭活前以平板计数法按常规操作活菌计数，其含菌量为1000亿/mL～12000亿/mL。

进一步的，步骤二所述的水浴热灭活处理中，水浴的灭活温度为80℃～105℃，灭活时间为5～10分钟。

进一步的，步骤三所述的过滤除菌后的养殖水体水样加入灭活宿主菌浓悬液的体积比为50～250∶0.2～5。

进一步的，步骤四中噬菌蛭弧菌富集培养液、灭活宿主菌浓悬液与水浴45℃的上层培养基体积比为2～10∶1～5∶30～150。

进一步的，步骤五所述的蛭弧菌母液扩大液，其扩大培养的具体原料添加量为：蛭弧菌母液、灭菌海水、灭活宿主菌浓悬液体积比为2～8∶50～150∶0.2～2。

进一步的，步骤五中所述噬菌蛭弧菌制剂制备时各原料的添加量为：过滤除菌海水、蛭弧菌扩大液、灭活宿主菌浓悬液的体积比为5～20∶0.1～2∶0.01～1。

本发明的特征在于：利用养殖水体中自然形成的多种蛭弧菌体系，经富集培养、双层平板培养，获得的多株蛭弧菌为本制剂的蛭弧菌菌种，以养殖水体中分离纯化培养后的副溶血弧菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂。具有生产工艺简单、生产成本低、裂解活性高、作用迅速、对于养殖水体中多数致病菌具有强烈的裂解作用等特点。

具体实施方式

实施例一：

一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，具体步骤如下：

步骤一：宿主菌的分离：取养殖中期的海水虾塘水面20厘米以下的水0.1毫升，接种于TCBS弧菌选择性培养基，涂布均匀后置于35℃的恒温培养箱中倒扣培养24小时；出现的蓝绿色菌落为副溶血弧菌；挑取单菌落的副溶血弧菌在TCBS平板上连续划线接种培养3～5次，直到出现显微镜观察菌体形态一致、菌落形态一致的菌落，接种于NB试管培养24小时，即为本制剂的副溶血弧菌的宿主菌菌种；

所述的TCBS弧菌选择性培养基的培养的条件为：控制温度为35℃、培养时间为24～36小时。

步骤二：宿主菌浓悬液制备：将步骤一纯化后的副溶血弧菌宿主菌菌种以NB培养基试管扩大培养，取经24小时培养后的试管菌种，无菌操作注入5毫升的稀释液，此处稀释液为灭菌海水，洗下试管斜面上的菌苔，接种于经121℃灭菌的弧菌增菌液体培养基，弧菌增菌液体培养基的配方为：胰蛋白胨5g/L、鱼蛋白胨5g/L、酵母膏1g/L、氯化钠20g/L、水1000mL，每只三角瓶接种量为0.2mL；置于120r/min、35℃摇床培养24～36小时，进入弧菌生长的菌数稳定期得到副溶血弧菌发酵液；将副溶血弧菌发酵液分别置于6000r/min离心15分钟，去掉发酵液培养基部分，余下的副溶血弧菌菌泥以等量体积的灭菌海水稀释为宿主菌浓菌悬液，置于105℃水浴10分钟进行水浴热灭活处理，即为灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：取虾塘水100毫升，经0.22um孔径的细菌滤器过滤除菌后，置于250毫升无菌三角瓶中，接种步骤二中制备的灭活宿主菌浓悬液0.4mL，将三角瓶置于120r/min、25℃～30℃的摇床培养5～7天，培养液由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：制备双层平板：将琼脂加热溶于自然海水中，琼脂浓度为5g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，装入三角瓶中即为上层培养基；将琼脂加热溶于自然海水，琼脂浓度为15g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，倒入平板中，每只平板倒入15mL，即为下层平板；将上述上层培养基和下层平板置于121℃灭菌30分钟后，下层平板冷却待用；将装有上层培养基的三角瓶置于45℃水浴锅中待用；

蛭弧菌母液的制备：取10mL试管一只，将步骤三噬菌蛭弧菌富集培养液0.5mL、步骤二制备的的灭活宿主菌浓悬液0.2mL加入试管中混合均匀，加入步骤四中水浴45℃的上层培养基8mL，混合均匀后倒入冷却的下层平板中，使上层培养基均匀分布在下层平板内下层培养基的上方，将平板移入28℃恒温箱培养5～7天，培养24小时后开始出现大小不一的噬菌斑，5～7天噬菌斑融合后，在平板中加入5mL灭菌海水浸泡4小时，将浸泡液移入无菌试管中，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：蛭弧菌母液扩大培养：取步骤四制备的蛭弧菌母液5mL、灭菌海水94mL、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液1mL，加入250mL的无菌三角瓶中混合均匀，置于150r/min、28℃的摇床培养5～7天，液体清澈后即为蛭弧菌母液扩大液；取过滤除菌海水10L、以上制备的蛭弧菌母液扩大液100mL、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液10mL混合均匀，置于25℃～28℃静置培养5～7天，即为噬菌蛭弧菌制剂。

步骤五中所述的过滤除菌海水使用滤膜的孔径为0.22um。

做如下检测比对：

1、随机选取市场上不同公司生产的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例一所得的噬菌蛭弧菌制剂编号为样4；将副溶血弧菌接种于NB试管斜面，培养24小时后，在斜面试管中注入5毫升灭菌生理盐水洗下菌苔，充分摇匀即为实验用副溶血弧菌悬液；取四只1000毫升容量的烧杯分别加入1000毫升灭菌海水，4只烧杯上分别标记为样1、样2、样3、样4；吸取0.1毫升副溶血弧菌悬液分别加入4只烧杯中混合均匀，由4只烧杯中分别吸取0.1毫升混合液涂布4个TCBS平板，置于35℃恒温箱中培养24小时，分别数取4个TCBS平板中副溶血弧菌菌落数，并作记录；分别吸取样1、样2、样3、样4中制剂各0.1毫升加入对应标记的烧杯中，将4只烧杯置于28℃的恒温箱中培养24小时。分别吸取1、样2、样3、样4烧杯中的液体0.1毫升，分别接种于4只TCBS平板中，涂布均匀后置于35℃恒温箱中培养24小时，数取4只平板中的菌落数并作记录；培养完成后计算出每个样品在接种前后每个烧杯中每毫升液体中的副溶血弧菌含量，以接种后各产品样品对副溶血弧菌的清除率来判定产品实际应用效果；各样品接种各制剂培养前后液体中副溶血弧菌菌数的变化如下表一：

项目	样1	样2	样3	样4
					接种前(cfu/mL)	5680	5250	6010	5800
接种24h后(cfu/mL)	1920	1680	4950	790
					接种后细菌清除率(％)	66.1	68	17.6	86.3

上表一效果验证数据显示，在同样条件下接种各样品后，该专利的富集培养法生产的噬菌蛭弧菌制剂对副溶血弧菌的清除率最高。

2、随机选取市场上不同公司生产的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例一所得的噬菌蛭弧菌制剂编号为样4；以霍乱弧菌接种于NB试管斜面，培养24小时后，在斜面试管中注入5毫升灭菌生理盐水洗下菌苔，充分摇匀即为实验用霍乱弧菌悬液；取四只1000毫升容量的烧杯分别加入1000毫升灭菌海水，4只烧杯上分别标记为样1、样2、样3、样4；吸取0.1毫升霍乱弧菌悬液分别加入4只烧杯中混合均匀，由4只烧杯中分别吸取0.1毫升混合液涂布4个TCBS平板，置于35℃恒温箱中培养24小时，分别数取4个TCBS平板中霍乱弧菌菌落数，并作记录；分别吸取样1、样2、样3、样4中制剂各0.1毫升加入对应标记的烧杯中，将4只烧杯置于28℃的恒温箱中培养24小时。分别吸取1、样2、样3、样4烧杯中的液体0.1毫升，分别接种于4只TCBS平板中，涂布均匀后置于35℃恒温箱中培养24小时，数取4只平板中的菌落数并作记录；培养完成后计算出每个样品在接种前后每个烧杯中每毫升液体中的霍乱弧菌含量，以接种后各产品样品对霍乱弧菌的清除率来判定产品实际应用效果，接种各产品样品培养前后液体中霍乱弧菌菌数的变化如下表二：

项目	样1	样2	样3	样4
					接种前(cfu/mL)	4860	4780	5120	4830
接种24h后(cfu/mL)	3700	3900	1800	980
					接种后细菌清除率(％)	23.8	18.4	64.8	79.7

上表二效果验证数据显示，在同样条件下接种各样品后，该专利的富集培养法生产的噬菌蛭弧菌生物制剂对霍乱弧菌的清除率最高。

3、随机选取市场上不同公司的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例一所得的噬菌蛭弧菌制剂编号为样4；在夏季高温时，对虾养殖池塘致病菌多发季节里，选取已有致病菌滋生的、水面面积相同的对虾养殖池塘4个，分别编号为A组、B组、C组、D组；以TCBS、AHM、麦康凯琼脂三种选择性培养基按常规操作分别检测4组对虾养殖池塘中副溶血弧菌、霍乱弧菌、噬水气单胞菌、大肠杆菌的含量，并做记录；将样1、样2、样3、样4产品样品对应加入A、B、C、D四个养殖池塘，使各样品的终浓度在池塘水体中达到1ppm，48小时后以TCBS、AHM、麦康凯琼脂三种选择性培养基按常规操作分别检测4组对虾养殖池塘中副溶血弧菌、霍乱弧菌、噬水气单胞菌、大肠杆菌的含量，并做记录；按常规细菌计数方法计算出各组池塘水施用蛭弧菌制剂前后，每毫升中4种致病菌的含菌数量；根据各池塘水体施用蛭弧菌生物制剂后4种致病菌被清除的数量百分率，判定4种生物制剂样品的使用效果，施用各蛭弧菌生物制剂样品前后4种致病菌菌数变化如下表三：

上表三验证效果数据显示：在病原菌已经滋生的虾塘中，本发明生产的噬菌蛭弧菌生物制剂实际应用效果都明显好于其他3个产品，对养殖水体中常见的四种病原菌均有较好的清除效果。

Claims (10)

1.一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：宿主菌的分离：以TCBS选择性培养基培养、分离并纯化养殖水体水样中的弧菌，并做为制备噬菌蛭弧菌制剂的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液的制备：将步骤一纯化后的弧菌在液体培养基中培养至弧菌生长的稳定期后，得到发酵液；发酵液经离心分离去掉发酵液培养基，将余下弧菌菌体的菌泥以等体积的灭菌海水稀释，做水浴热灭活处理，获得灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：将过滤除菌后的养殖水体水样加入步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，摇床培养至液体由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：取步骤三制备的蛭弧菌富集培养液与步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，制备双层平板，培养至出现噬菌斑并融合后，加入灭菌海水浸泡，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤四的蛭弧菌母液与灭活宿主菌浓悬液进一步扩大培养，得到蛭弧菌母液扩大液；按比例将灭活宿主菌浓悬液、蛭弧菌母液扩大液加入过滤除菌海水中，即为噬菌蛭弧菌制剂。

2.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其具体工艺流程如下：

步骤一：宿主菌的分离：取养殖水体水样接种于TCBS弧菌选择性培养基，涂布均匀后置于5℃的恒温培养箱中倒扣培养24小时，从出现的弧菌菌落中，挑取蓝绿色单菌落的弧菌在TCBS平板上连续划线接种培养3～5次，直到出现显微镜观察菌体形态一致、菌落形态一致的菌落，接种于NB斜面试管培养24小时，即为本制剂的弧菌的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液制备：将步骤一纯化后的宿主菌菌种以NB培养基试管扩大培养，取经24小时培养后的试管菌种，无菌操作注入稀释液，洗下试管斜面上的菌苔，摇匀后再接种于经121℃灭菌的弧菌增菌液体培养基，置于120r/min、35℃摇床培养24～36小时，培养至菌弧生长的菌数稳定期后，即为得到需要的弧菌发酵液；将弧菌发酵液置于6000r/min离心15分钟，去掉发酵液培养基部分，将余下的弧菌菌泥以等体积的灭菌海水稀释，即为宿主菌浓菌悬液，进行水浴热灭活处理，即为灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：取养殖水体水样，经0.22um孔径的细菌滤器过滤除菌后，接种步骤二中制备的灭活宿主菌浓悬液，置于120r/min、25℃～30℃的摇床培养5～7天，培养液由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：制备双层平板：将琼脂加热溶于自然海水中，琼脂浓度为5g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，装入三角瓶中即为上层培养基；将琼脂加热溶于自然海水，琼脂浓度为15g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，倒入平板中，每只平板倒入15mL，即为下层平板；将上述上层培养基和下层平板置于121℃灭菌30分钟后，下层平板冷却待用，将装有上层培养基的三角瓶置于45℃水浴锅中待用；将步骤三噬菌蛭弧菌富集培养液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例加入水浴45℃的上层培养基，混合均匀后倒入冷却的下层平板中，使上层培养基均匀分布在下层平板内的下层培养基的上方，将平板移入28℃恒温箱培养5～7天，培养24小时后开始出现大小不一的噬菌斑，5～7天噬菌斑融合后，在平板中加入灭菌海水浸泡4小时，将浸泡液移入无菌试管中，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：蛭弧菌母液扩大液的制备：取灭菌海水、步骤四制备的蛭弧菌母液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于150r/min、28℃的摇床培养5～7天，液体清澈后即为蛭弧菌母液扩大液；取过滤除菌的海水、以上制备的蛭弧菌母液扩大液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于25℃～28℃静置培养5～7天，即为噬菌蛭弧菌制剂。

3.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，步骤一所述的宿主菌菌种为养殖水体水样中分离并纯化的副溶血弧菌。

4.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，步骤二所述的弧菌增菌液体培养基配方为：胰蛋白胨5g/L～20g/L、鱼蛋白胨5g/L～20g/L、酵母膏1g/L～10g/L氯化钠20g/L～40g/L，溶剂为自来水。

5.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤二所述的灭活宿主菌浓悬液在灭活前以平板计数法按常规操作活菌计数，其含菌量为1000亿/mL～12000亿/mL。

6.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤二所述的水浴热灭活处理中，水浴的灭活温度为80℃～105℃，灭活时间为5～10分钟。

7.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤三所述的过滤除菌后的养殖水体水样加入灭活宿主菌浓悬液的体积比为50～250∶0.2～5。

8.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤四中噬菌蛭弧菌富集培养液、灭活宿主菌浓悬液与水浴45℃的上层培养基体积比为2～10∶1～5∶30～150。

9.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤五所述的蛭弧菌母液扩大液，其扩大培养的具体原料添加量为：蛭弧菌母液、灭菌海水、灭活宿主菌浓悬液体积比为2～8∶50～150∶0.2～2。

10.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于：步骤五中所述噬菌蛭弧菌制剂制备时各原料的添加量为：过滤除菌海水、蛭弧菌扩大液、灭活宿主菌浓悬液的体积比为：5～20∶0.1～2∶0.01～1。