CN104862253B - 一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌nor‑36及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种消除废水中诺氟沙星残留的降解菌剂，属于生物高科技技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌NOR‑36，经鉴定为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter .calcoaceticus）。于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCC NO.10540，经鉴定是乙酸钙不动杆菌。主要生物学特性为革兰氏染色阴性，菌落光滑，短杆状，接触氧化酶阳性，硝酸盐还原酶阴性。降解菌产品直接施用可使水中诺氟沙星残留量降低90％上。

Description

一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR-36及其应用

技术领域

本发明属于生物高科技技术领域，具体涉及一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR-36及其应用。

背景技术

兽用抗生素是指以亚治疗剂量用于动物饲料中，以保障动物健康、或促进动物生长与生产、提高饲料利用率的抗生素。抗生素本身对人体是无害的，但如果过量使用将使病源细菌产生耐药性，导致抗生素对其失效。抗生素的过量使用使药物耐药性、畜产品药物残留等都成为了不可忽视的严重问题，尤其是破坏动物的免疫机能。同时抗生素属于难生物降解物质，一旦造成抗生素污染，很容易在环境中富集，诱导耐药菌株产生，对环境微生态造成严重的影响。

氟喹诺酮类药物在我国畜牧水产养殖业中已广泛应用，但在使用中发现，氟喹诺酮类药物会产生一系列的不良反应，如皮肤过敏反应及光敏反应、软骨毒性、循环系统反应、中枢神经系统(CNS)反应、胃肠道反应等，直接影响了畜牧和水产养殖业的发展。诺氟沙星是当前广泛应用于临床的第三代喹诺酮抗生素(氟喹诺酮类)的代表药物之一。由于诺氟沙星的喹诺酮环的稳定性和抗水解能力使其成为持久性污染物,目前已多次在水体中被检测出来。微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，已在很多方面得到应用，所以筛选出诺氟沙星降解菌对于处理诺氟沙星生产废水具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，利用微生物的方法来降解废水中的污染物，适用于现代废水处理工艺，使废水达标排放，同时降低生产和使用成本。

本发明提供一种消除诺氟沙星残留的降解菌，其菌株NOR-36是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCC NO.10540，经鉴定是乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter.calcoaceticus）。生物学特性为革兰氏染色阴性，菌落光滑，短杆状，接触氧化酶阳性，硝酸盐还原酶阴性。本发明提供了甲基杆菌NOR-36在诺氟沙星降解中的应用。在实验室摇瓶培养条件下使浓度为500ug/L的诺氟沙星降解率达90％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明提供了含有所述乙酸钙不动杆菌NOR-36的菌剂。

本发明还提供了所述乙酸钙不动杆菌NOR-36生产菌剂的方法。

所述乙酸钙不动杆菌NOR-36生产菌剂的方法，包括：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

所述生产菌剂的方法，具体为：

1） 将诺氟沙星残留的乙酸钙不动杆菌NOR-36的试管种接种于添加哌嗪的LB培养基中，振荡培养至对数期；

2） 将步骤1）培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液；

3） 将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂；

4） 步骤3）所述菌剂直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

步骤1）中所述的LB培养基配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,哌嗪5g/L，pH7.0。

步骤2）所述的种子罐所用的培养基配方为：哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，（NH₄）₂SO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 1g/L%，CaCO₃ 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值7.2-7.5。

步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。

所述菌剂在诺氟沙星降解中的应用。

本发明所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36能使水体中诺氟沙星的残留量降低90％以上，降低诺氟沙星在环境中富集并影响环境微生态的风险。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国的污水处理厂尤其是畜禽养殖废水处理厂大面积推广使用。本发明是利用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高水环境质量安全具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在降低水中化学需氧量浓度、氨氮浓度以及总磷浓度等常规污染物的同时，降低出水中诺氟沙星浓度。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。

附图说明

图1 本发明所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36的结晶紫染色照片；

图2 接种量对本发明所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36降解效果的影响；

图3 pH对本发明所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36降解效果的影响；

图4 诺氟沙星降解菌效果验证。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR-36的筛选和分离

取从生产诺氟沙星的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0ml加入100ml诺氟沙星浓度为50mg/L的含有哌嗪的LB培养基中，其配方为：含5g/L哌嗪，NaCl10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L, pH 7.0，于160r/min，30℃条件下振荡培养，每隔7天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。

取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含诺氟沙星的浓度为500ug/L无机盐固体培养基(配方为：每升含500ug哌嗪，1.50g K₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄×7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，20.00g 琼脂， pH 7.0)上，30℃培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为：哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入3.0ml的无菌水摇匀，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入100ml诺氟沙星浓度为500ug/L的哌嗪-无机盐液体培养基中(配方为：每升含500ug哌嗪，1.50g K₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄×7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，20.00g 琼脂， pH 7.0)，于160r/min，30℃条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。

将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为：哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L, 酵母粉5.00g/L,琼脂20.00g/L,pH7.0, 30℃恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态（1000X）。其结晶紫染色照片如图1所示。生物学特性为革兰氏染色阴性，菌落光滑，短杆状，接触氧化酶阳性，硝酸盐还原酶阴性。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为乙酸钙不动杆菌属（Acinetobacter.calcoaceticus）；命名为：NOR-36。

实施例2 乙酸钙不动杆菌NOR-36的摇瓶降解实验

2.1 接种量对NOR-36降解效率的影响

在含500ug/L诺氟沙星的无机盐培养基中，其配方为：每升含500ug/L哌嗪，1.50 gK₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄×7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按1%、2%、3%、4%、5%、的接种量接种NOR-36于培养液中，于30℃振荡培养，72小时取样测定。结果由图2可以看出，按1%进行接种时，降解率为91%，随着接种量的提高，诺氟沙星降解率有小幅增加，考虑到菌体生长和经济的原因，采用1%的接种量即可达到要求。

2.2 pH对NOR-36降解效率的影响

pH 值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素，微生物生长有一个适宜的pH 值范围，超过适宜生长的 pH 值范围， 大多数微生物都不能很好人的生长。

在含500ug/L诺氟沙星的无机盐培养基中，其配方为：每升含500ug哌嗪，1.50 gK₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄×7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按1%的接种量接种NOR-36于培养液中，pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0，于30℃振荡培养，72小时取样测定。结果由图3可以看出，pH过高或过低都会影响NOR-36对诺氟沙星的降解，最优pH范围为7。

实施例3 含有乙酸钙不动杆菌NOR-36菌剂的制备

将实施例1筛选和分离的诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR-36的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml 含哌嗪的LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为：哌嗪5g/L，酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl10.00g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，（NH₄）₂SO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl1g/L%，CaCO₃ 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4 诺氟沙星降解菌效果验证

配制人工废水，其组成如下：葡萄糖2.5g/L，氯化钠1g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L。取2个相同的反应器（5L）分别编号为1#和2#，向2个反应器中分别加入4L上述人工废水，并同时接种400ml活性污泥。向1#反应器中加入500ml灭活的菌液，向2#反应器中加入500ml未灭活的菌液，每隔2h取样，测定废水中的化学需氧量（COD）浓度。结果见图4，在诺氟沙星降解菌存在的条件下可以消除诺氟沙星对活性污泥的抑制作用，显著降低人工废水的化学需氧量。

Claims (10)

1.一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter.calcoaceticus)菌株NOR-36，其保藏编号为CGMCC NO.10540。

2.权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36在诺氟沙星降解中的应用。

3.含有权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36的菌剂。

4.权利要求3所述菌剂在诺氟沙星降解中的应用。

5.含有权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌NOR-36的菌剂的制备方法，其特征在于，包括：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体为：

1)将诺氟沙星残留的乙酸钙不动杆菌NOR-36的试管种接种于添加哌嗪的LB培养基中，振荡培养至对数期；

2)将步骤1)培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，即种子液；

3)将步骤2)所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的LB培养基配方为：NaCl10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,哌嗪5g/L，pH7.0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为：哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 1g/L％，CaCO₃0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值7.2-7.5。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述种子罐和步骤3)所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，步骤2)和3)的整个工艺流程培养时间为48-60小时。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述菌剂直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。