CN106957804A - 防治滴灌灌水器堵塞的微生物控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，属于农用微生物菌剂和节能环保技术领域。本发明采用的菌株是从松树叶片分离筛选出来的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3374。本发明利用红枣加工废水作为液态发酵培养基，低成本培养枯草芽孢杆菌，并制备成菌剂。将菌剂添加到灌溉用水中用于滴灌，或反冲洗堵塞的滴灌灌水器，可以减缓滴灌灌水器的堵塞过程，或恢复已经发生堵塞的灌水器流量。滴灌用水中添加了菌剂还可以提高作物的产量和品质，显示出广阔的应用前景。

Description

防治滴灌灌水器堵塞的微生物控制方法
技术领域：
本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，属于农用微生物菌剂和节能环保技术领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，革兰氏染色阳性，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。枯草芽孢杆菌可通过成功定殖于植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而具有生防的效果。枯草芽孢杆菌还能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长。例如：美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBio GroupLtd.、日本的Idemistu Kosan Co.,Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌FZB24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国Bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。随着对枯草芽孢杆菌研究的不断深入，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值。
中国发明专利(申请号：201210328716.5)中公开了一枯草芽孢杆菌T-500菌株，保藏编号为CGMCC No.6058，对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，并对其引起的病害有较好的防控作用，发酵培养基组成包括：碳源(蔗糖或淀粉)、氮源(黄豆粉、豆饼粉、玉米桨中的一种或几种种混合)、微量元素(牛肉浸出膏、酵母膏或者鱼粉中一种或两种混合)。中国发明专利(申请号：201210229066.9)中公开了一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌CX31菌株，保藏编号为CCTCC No.M2012138，该菌株的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。中国发明专利(申请号：201110205587.6)中公开了一株内生枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.4844，对胡椒瘟病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为：PDA培养基。中国发明专利(申请号：201210215134.6)中公开了一株枯草芽孢杆菌RB菌株，保藏编号为CGMCC No.6268，并公开了该菌株在处理污泥、禽畜粪便或作物稿杆中的应用，该菌株的培养基采用玉米淀粉、红糖、麦麸、鱼粉、蔗糖和无机盐来制备。中国发明专利(申请号：201210127519.7)中公开了一株枯草芽孢杆菌)KW119菌株，保藏编号为CGMCC No.5789，其在鸡肠道内生境条件下产蛋白酶能力较高，其发酵培养基主要以豆粕为底物。中国发明专利(申请号：201110443948.0)中公开了一株枯草芽孢杆菌CH-001菌株，保藏编号为CCTCCNo.M2011111，它对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂，其培养基主要成分为羽毛粉和无机盐。中国发明专利(申请号：201010129783.5)中公开了一株枯草芽孢杆菌ANSB060菌株，保藏编号为CGMCC No.3440，并公开了其在动物饲料中的应用，其培养基主要成分为蛋白胨、葡萄糖和无机盐。中国发明专利(申请号：200410101021.9)中公开了一株枯草芽孢杆菌B115菌株，保藏编号为CGMCCNo.1210，并公开了其用于制备渔用微生态水质改良剂的方法，其培养基主要成分为豆饼粉、麸皮和玉米粉。
群体感应的一个典型行为是生物膜形成。当微生物个体达到一定密度时，群体感应信号分子的基因表达会产生黏液多糖，导致结构性生物膜的形成。较早的细菌群体感应研究文献集中在病原菌的研究方面，当细菌达到足够高的群体密度时，它们就能改变感染所需的基因表达以诱导大量的细胞合作进行宿主感染，它们也能躲避宿主的免疫反应，从而成功建立感染(Dangl,et al.,Nature.2001.411:826-833)。近年来，在环境微生物领域也开展了广泛的研究，比如：在滴灌系统中，灌水器流道内就非常容易形成微生物膜而引起堵塞(Yan,et al.,Journal of Environmental Sciences,2009,21(6):834-841.)。我们分离出一株高效降解群体感应信号分子的枯草芽孢杆菌N14菌株，用于防治灌水器流动内微生物膜的形成，从而减缓堵塞发生，取得了良好的效果。
红枣加工过程中会产生大量废水，尤其是蜜栈(亦称蜜枣)的加工，对红枣蒸煮和清洗，以及对蜜枣表面糖蜜的清洗产生的废水中有机物(主要是糖份)浓度非常高，COD浓度在30g/L以上，甚至经常超过100g/L。这些高浓度废水处理达标非常困难，处理成本高昂，如果处理不当极易带来严重的环境污染。而这些高浓度废水中不含重金属等有毒有害物质，因此开发资源化利用技术是处理此类废水的合理途径。本发明利用此类废水培养枯草芽孢杆菌N14菌株，获得了较高的活菌数产率。
发明内容：
本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，并提供一种能够资源化利用高浓度红枣加工废水培养该菌株的方法。
本发明所使用的菌株是由发明人从松树的叶片上分离筛选出来的一株具有高效降解信号分子能力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株，该菌株于2009年11月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3374，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所述的枯草芽孢杆菌的培养方法和菌剂制备过程如下：
1、红枣加工废水预处理及培养基的配制：将COD浓度大于10g/L的高浓度红枣加工废水的COD浓度调节为10～80g/L，再按照重量比加入0.1％～0.5％的硫酸铵和0.05％～0.2％的磷酸氢二钠，于100～115℃加热3～15分钟，再用生物质热电厂的草木灰饱和水溶液调节pH到7.0～8.0，得到液体培养基。
2、液体种子制备：向装有步骤1得到的液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于50～55℃，120～200转/分振荡培养20～36小时，得到枯草芽孢杆菌液体种子。
3、液态发酵：分别向装有步骤1得到的液体培养基的发酵罐中接种体积比为2％～10％的第2步得到的液体种子，于50～55℃，通无菌空气培养12～30小时；将培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数都达到3×109CFU/毫升以上。
4、液体菌剂制备：向第3步得到的发酵液中按照重量比加入0.3％～5％的甘油，得到液体菌剂，0～6℃低温保存。
本发明所得菌剂用于防控滴灌灌水器堵塞的方法如下：
1、在滴灌系统的灌溉用水中按照体积比为0.01％～0.1％加入枯草芽孢杆菌液体菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为3×105CFU/毫升～3×106CFU/毫升，用于正常滴灌，可降低灌水器堵塞发生概率。
2、对于滴灌系统流量已经明显下降的灌水器，即发生堵塞的灌水器，在灌溉用水中按照体积比为0.1％～0.5％加入枯草芽孢杆菌液体菌剂；将滴灌管浸入装有菌液的水槽中，确保灌水器完全被浸没；用抽吸泵连接滴灌管抽水，反冲洗灌水器；采用间歇式反冲洗方式，抽吸1-10分钟，停止抽吸浸泡15-30分钟，抽吸-浸泡交替进行，直至滴灌流量恢复正常。
具体实施方式：
由本发明提供的枯草芽孢杆菌能够高效降解群体感应信号分子，并且能促进植物生长，改善农作物品质。具体实施方式如下：
实施例1：枯草芽孢杆菌的培养和菌剂制备
(1)红枣加工废水预处理及培养基的配制：将COD浓度大于10g/L的高浓度红枣加工废水的COD浓度调节为50g/L，再按照重量比加入0.3％的硫酸铵和0.1％的磷酸氢二钠，于100℃加热5分钟，再用生物质热电厂的草木灰饱和水溶液调节pH到7.5，得到液体培养基。
(2)液体种子制备：向装有步骤1得到的液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于50～55℃，150转/分振荡培养24小时，得到枯草芽孢杆菌液体种子。
(3)液态发酵：分别向装有步骤1得到的液体培养基的发酵罐中接种体积比为5％的第2步得到的液体种子，于50～55℃，通无菌空气培养30小时；将培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数都达到3×109CFU/毫升以上。
(4)液体菌剂制备：向第3步得到的发酵液中按照重量比加入1％的甘油，得到液体菌剂，0～6℃低温保存。
实施例2：枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于预防滴灌灌水器堵塞
滴灌系统采用城市生活污水处理厂的二级出水，通过高5米的自动水位控制水箱(水位波动在20厘米以内)向滴灌系统供水，并在系统的入口加设120目筛网式过滤器、流量表、阀门等控制和测量设备。设置3套滴灌系统，第一套滴管系统只用二级出水；第二套系统的二级出水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为3×105CFU/毫升；第三套系统的二级出水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为1×106CFU/毫升。三套系统同时运行，5个月后，第一套系统灌水器堵塞率达到38％，第二套系统灌水器堵塞率为25％，第三套系统灌水器堵塞率为17％。结果表明，灌溉用水中加入菌剂可以显著降低滴管系统灌水器的堵塞率。
用以上3组滴灌系统进行滴灌小油菜，结果表明，添加菌剂灌溉的小油菜生物量明显大于不添加菌剂的小油菜，表明菌剂提高了小油菜的产量；添加菌剂灌溉的小油菜硝酸盐含量明显小于不添加菌剂的小油菜，表明菌剂提高了小油菜的品质。
实施例3：枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于恢复已堵塞的滴灌灌水器流量
对于滴灌系统流量已经下降了40％的灌水器，在灌溉用水中按照体积比为0.2％加入枯草芽孢杆菌液体菌剂；将滴灌管浸入装有0.2％菌液的水槽中，确保灌水器完全被浸没；用抽吸泵连接滴灌管抽水，反冲洗灌水器；采用间歇式反冲洗方式，抽吸2分钟，停止抽吸浸泡20分钟，抽吸-浸泡交替进行7-10次，滴灌流量可恢复到起始流量的85％以上。

Claims (3)

1.一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，其特征在于：N14菌株的培养方法和菌剂制备步骤如下：
(1)红枣加工废水预处理及培养基的配制：将COD浓度大于10g/L的高浓度红枣加工废水的COD浓度调节为10～80g/L，再按照重量比加入0.1％～0.5％的硫酸铵和0.05％～0.2％的磷酸氢二钠，于100～115℃加热3～15分钟，再用生物质热电厂的草木灰饱和水溶液调节pH到7.0～8.0，得到液体培养基；
(2)液体种子制备：向装有步骤(1)得到的液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于50～55℃，120～200转/分振荡培养20～36小时，得到枯草芽孢杆菌液体种子；
(3)液态发酵：分别向装有步骤(1)得到的液体培养基的发酵罐中接种体积比为2％～10％的第(2)步得到的液体种子，于50～55℃，通无菌空气培养12～30小时；将培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数都达到3×109CFU/毫升以上；
(4)液体菌剂制备：向第(3)步得到的发酵液中按照重量比加入0.3％～5％的甘油，得到液体菌剂，0～6℃低温保存。
2.权利要求1所述的菌剂用于防控滴灌灌水器堵塞的方法，其特征在于：
(1)在滴灌系统的灌溉用水中按照体积比为0.01％～0.1％加入枯草芽孢杆菌液体菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为3×105CFU/毫升～3×106CFU/毫升，用于正常滴灌，可降低灌水器堵塞发生概率；
(2)对于滴灌系统流量已经明显下降的灌水器，即发生堵塞的灌水器，在灌溉用水中按照体积比为0.1％～0.5％加入枯草芽孢杆菌液体菌剂；将滴灌管浸入装有菌液的水槽中，确保灌水器完全被浸没；用抽吸泵连接滴灌管抽水，反冲洗灌水器；采用间歇式反冲洗方式，抽吸1-10分钟，停止抽吸浸泡15-30分钟，抽吸-浸泡交替进行，直至滴灌流量恢复正常。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3374。
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