CN105779323A - 一株群体感应信号分子高效降解菌及其菌剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高效降解群体感应信号分子的枯草芽孢杆菌，及其菌剂的低成本生产方法和使用方法，属于农用微生物菌剂和节能减排技术领域。本发明采用的菌株是从松树叶片分离筛选出来的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8188。本发明利用甘薯淀粉废水作为液态发酵培养基，大规模培养枯草芽孢杆菌，并制备农用微生物菌剂，该工艺能耗低、生产成本低廉，操作简单，还可以使甘薯淀粉废水得到资源化利用，减少污染排放。本发明生产的菌剂用于滴灌系统的灌溉用水中，不仅可以延缓灌水器的堵塞，而且可以明显改善农产品的品质，显示出广阔的应用前景。

Description

一株群体感应信号分子高效降解菌及其菌剂的生产方法

技术领域：

本发明涉及一株高效降解群体感应信号分子的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SZX11菌株，及其菌剂的低成本生产方法，属于农用微生物菌剂和节能减排技术领域。

背景技术：

群体感应的一个典型行为是生物膜形成。当微生物个体达到一定密度时，群体感应信号分子的基因表达会产生黏液多糖，导致结构性生物膜的形成。较早的细菌群体感应研究文献集中在病原菌的研究方面，当细菌达到足够高的群体密度时，它们就能改变感染所需的基因表达以诱导大量的细胞合作进行宿主感染，它们也能躲避宿主的免疫反应，从而成功建立感染(Dangl,etal.,Nature.2001.411:826-833)。近年来，在环境微生物领域也开展了广泛的研究，比如：在滴灌系统中，灌水器流道内就非常容易形成微生物膜而引起堵塞(Yan,etal.,JournalofEnvironmentalSciences,2009,21(6):834-841.)。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，革兰氏染色阳性，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。枯草芽孢杆菌可通过成功定殖于植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而具有生防的效果。枯草芽孢杆菌还能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长。例如：美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBioGroupLtd.、日本的IdemistuKosanCo.,Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌FZB24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国Bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。随着对枯草芽孢杆菌研究的不断深入，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值。

中国发明专利(申请号：201210328716.5)中公开了一枯草芽孢杆菌T-500菌株，保藏编号为CGMCCNo.6058，对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，并对其引起的病害有较好的防控作用，发酵培养基组成包括：碳源(蔗糖或淀粉)、氮源(黄豆粉、豆饼粉、玉米桨中的一种或几种种混合)、微量元素(牛肉浸出膏、酵母膏或者鱼粉中一种或两种混合)。中国发明专利(申请号：201210229066.9)中公开了一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌CX31菌株，保藏编号为CCTCCNo.M2012138，该菌株的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。中国发明专利(申请号：201110205587.6)中公开了一株内生枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.4844，对胡椒瘟病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为：PDA培养基。

中国发明专利(申请号：201210215134.6)中公开了一株枯草芽孢杆菌RB菌株，保藏编号为CGMCCNo.6268，并公开了该菌株在处理污泥、禽畜粪便或作物稿杆中的应用，该菌株的培养基采用玉米淀粉、红糖、麦麸、鱼粉、蔗糖和无机盐来制备。中国发明专利(申请号：201210127519.7)中公开了一株枯草芽孢杆菌)KW119菌株，保藏编号为CGMCCNo.5789，其在鸡肠道内生境条件下产蛋白酶能力较高，其发酵培养基主要以豆粕为底物。中国发明专利(申请号：201110443948.0)中公开了一株枯草芽孢杆菌CH-001菌株，保藏编号为CCTCCNo.M2011111，它对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂，其培养基主要成分为羽毛粉和无机盐。中国发明专利(申请号：201010129783.5)中公开了一株枯草芽孢杆菌ANSB060菌株，保藏编号为CGMCCNo.3440，并公开了其在动物饲料中的应用，其培养基主要成分为蛋白胨、葡萄糖和无机盐。中国发明专利(申请号：200410101021.9)中公开了一株枯草芽孢杆菌B115菌株，保藏编号为CGMCCNo.1210，并公开了其用于制备渔用微生态水质改良剂的方法，其培养基主要成分为豆饼粉、麸皮和玉米粉。

综上所述，具有促进植物生长和拮抗植物病害的枯草芽孢杆菌的菌株较多，用于动物饲料的菌株也比较常见，其培养方法也各不相同，但是，未见高效降解群体感应信号分子的菌株，也未见采用高浓度甘薯加工废水培养枯草芽孢杆菌的报道。

我国是世界上最大的甘薯生产国，总产量稳定在1亿吨以上，占全世界的80％左右。在全国的农作物主产中，红薯仅次于水稻、小麦和玉米，居第4位。甘薯种植投入少，产出多，单位面积可食用的干物质居各种作物之首。甘薯抗灾力强，耐旱，耐贫瘠，丘陵山区也能种植，在其他作物较难生长的地方也能获得较好的产量。甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产1吨甘薯淀粉大约产出10吨左右高浓度有机废水，其中淀粉分离后的甘薯细胞液中有机物含量最高，COD可达20000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，处理不当，极易腐败发酵，使水质发黑发臭。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标排放，能源消耗非常大。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括：蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基进行资源化利用。

发明内容：

本发明的目的是提供一株高效降解群体感应信号分子的枯草芽孢杆菌，并提供一种能够资源化利用高浓度甘薯淀粉废水生产其菌剂的方法。

本发明所使用的菌株是由发明人从松树的叶片上分离筛选出来的一株具有促进植物生长、拮抗植物病原菌功能的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SZX11菌株，该菌株于2013年9月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.8188，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的枯草芽孢杆菌农用微生物菌剂的生产方法如下：

1、甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.1％～1％的草木灰(来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾)，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到7.0～8.5，于95～110℃微波加热3～15分钟。

2、液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于45～55℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子。

3、液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为2％～15％的液体种子，于35～50℃，通无菌空气培养12～30小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×10⁹CFU/毫升以上，所得发酵液中加入1％甘油，即得到液体菌剂。

4、液体菌剂在防治滴灌灌水器堵塞中的实用方法：向滴管系统的灌溉用水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，控制活菌浓度为10⁴～10⁶CFU/毫升。

具体实施方式：

由本发明提供的枯草芽孢杆菌能够高效降解群体感应信号分子，并且能促进植物生长，改善农作物品质。具体实施方式如下：

实施例1：甘薯淀粉废水生产枯草芽孢杆菌微生物菌剂

(1)甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.5％的草木灰(来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾)，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到8.0，于100℃微波加热5分钟。

(2)液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于50℃，150转/分振荡培养28小时，得到液体种子。

(3)液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为5％的液体种子，于45℃，通无菌空气培养16小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×10⁹CFU/毫升以上，所得发酵液中加入1％甘油，即得到液体菌剂。

实施例2：枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于防治滴灌灌水器堵塞

滴灌系统采用城市生活污水处理厂的二级出水，通过高5米的自动水位控制水箱(水位波动在20厘米以内)向滴灌系统供水，并在系统的入口加设120目筛网式过滤器、流量表、阀门等控制和测量设备。设置3套滴灌系统，第一套滴管系统只用二级出水；第二套系统的二级出水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为1×10⁵CFU/毫升；第三套系统的二级出水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，使水中的枯草芽孢杆菌浓度为5×10⁵CFU/毫升。三套系统同时运行，5个月后，第一套系统灌水器堵塞率达到37％，第二套系统灌水器堵塞率为23％，第三套系统灌水器堵塞率为19％。结果表明，灌溉用水中加入菌剂可以显著降低滴管系统灌水器的堵塞率。同时，灌溉用水中添加菌剂对植物的生长也有促进作用。

Claims (3)

1.一株具有高效降解群体感应信号分子的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SZX11菌株，其特征在于：该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.8188。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌农用微生物菌剂的生产方法，包括如下步骤：

(1)甘薯淀粉废水预处理：在高浓度甘薯淀粉废水中按照重量比加入0.1％～1％的草木灰(来自于生物质热电厂的固态废弃物，其主要成分为碳酸钾)，重复混合均匀，再用石灰水调节废水的pH到7.0～8.5，于95～110℃微波加热3～15分钟；

(2)液体种子制备：向装有预处理好的甘薯淀粉废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于45～55℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子；

(3)液态发酵：向装有预处理好的甘薯淀粉废水发酵罐中接种体积比为2％～15％的液体种子，于35～50℃，通无菌空气培养12～30小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×10⁹CFU/毫升以上，所得发酵液中加入1％甘油，即得到液体菌剂。

3.权利要求2所述的农用微生物菌剂的使用方法，其特征在于：向滴管系统的灌溉用水中加入枯草芽孢杆菌菌剂，控制活菌浓度为10⁴～10⁶CFU/毫升。