CN107937315A - 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用 - Google Patents

一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107937315A
CN107937315A CN201711405448.1A CN201711405448A CN107937315A CN 107937315 A CN107937315 A CN 107937315A CN 201711405448 A CN201711405448 A CN 201711405448A CN 107937315 A CN107937315 A CN 107937315A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dsf
burkholderia
bacterial strain
disease
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711405448.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107937315B (zh
Inventor
陈少华
冯芷萱
张炼辉
范兴辉
王惠杉
叶田
阳芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201711405448.1A priority Critical patent/CN107937315B/zh
Publication of CN107937315A publication Critical patent/CN107937315A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107937315B publication Critical patent/CN107937315B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种DSF群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用。本发明提供了一株伯克氏菌（Burkholderia anthina）菌株HN‑8，于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60289。本发明研究发现，伯克氏菌，尤其是菌株HN‑8，对群体感应信号分子DSF有显著且快速的降解作用，降解性能稳定，因此可通过降解DSF破坏群体感应通讯，在防治野油菜黄单胞菌引起的黑腐病、防治依赖DSF致病的病原菌危害具有巨大应用潜力。而且该菌还表现出对氨苄青霉素、羧苄青霉素和链霉素较高抗药性，不仅可避免农药或抗生素滥用及耐药性问题，同时为防治植物病害提供了新思路。

Description

一种DSF群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生防技术领域。更具体地，涉及一种DSF群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
群体感应(Quorum sensing,QS)是指微生物依赖一定的细胞密度进行细胞间的交流，协调群体行为的现象。这个协调的过程中包括信号分子的合成及分泌，信号分子的感知及信号的传导，目的基因表达的激活，最终启动一系列生物活动。DSF(Diffusible SignalFactor)信号分子是黄单胞菌(Xanthomonas)合成和分泌的一种新型群体感应信号，化学结构式为顺式11-甲基-2-十二碳烯酸。陆续的，DSF及其结构类似物在许多微生物中发现，比如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，叶缘焦枯病菌(Xylellafastidiosa)，洋葱伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，变异链球菌(Streptococcus mutans)。
大部分黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌是植物病原菌，能侵染至少124种单子叶植物和268种双子叶植物，研究报导，DSF介导的群体感应存在植物病原菌中对其致病扮演着重要角色，比如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)(BarberCE,Tang JL,Feng JX,et al.1997.A novel regulatory system required forpathogenicity of Xanthomonas campestris is mediated by a small diffusiblesignal molecule.Molecular Microbiology,24:555-566.)，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo)(Chatterjee S,Sonti RV.2002.rpfF mutants ofXanthomonas oryzae pv.oryzae are deficient for virulence and growth under lowiron conditions.Molecular Plant-Microbe Interactions,15:463-471.)，柑桔溃疡病黄单胞菌(Xanthomonas citri subsp.ctri,Xac)(Siciliano F,Torres P,Sendin L,etal.2006.Analysis of the molecular basis of Xanthomonas axonopodis pv.citripathogenesis in Citrus limon.Electronic Journal of Biotechnology,9:199.)和大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv glycines,Xag)(Thowthampitak J,ShafferBT,Prathuangwong S,et al.2008.Role of rpfF in virulence and exoenzymeproduction of Xanthomonas axonopodis pv.glycines,the causal agent ofbacterial pustule of soybean.Phytopathology,98:1252-1260.)。野油菜黄单胞菌可在全世界范围内造成甘蓝、芥菜和油菜等十字花科植物产生黑腐病，黑腐病被认为是对十字花科植物危害最大的植物病害，尤其是在热带和亚热带地区，危害更为严重。在野油菜黄单胞菌中，DSF群体感应信号分子调控三类生物学功能：一是促进黄单胞菌作出代谢调整，适应高群体密度环境；二是抑制生物膜形成；三是促进致病相关基因表达。研究表明，rpf是DSF合成过程中的必须基因，其中rpfF编码一种具有脱水和硫解的双重功能酶，参与DSF的合成，另rpfC和rpfG编码双组分感应系统，涉及DSF信号感知和信号转导(Bi H,Yu Y,DongH,et al.2014.Xanthomonas campestris RpfB is a fatty Acyl-CoA required tocounteract the thioesterase activity of the RpfF diffusible signal factor(DSF)synthase.Molecular Microbiology,93:262-275.)。
当DSF达到一定浓度发生群体感应表达致病因子，这一致病机制表明DSF可能成为防治依赖DSF致病的病原菌的新靶点，自然界的微生物在长期进化发展过程中已经表现出具有降解信号分子的功能，因此筛选DSF降解菌为生物防治植物病害提供了新思路。这种以生物防治替代化学防治一方面避免了农药或抗生素滥用及耐药性问题，对环境友好，另一方面具有操作简便、经济实用、环境友好、效率高且周期短等优点。
近年来从环境中筛选微生物或从中克隆降解酶降解AHLs(N-Acyl homoserinelactones)信号分子，干扰以AHLs作为信号分子的群体感应系统，防治AHLs介导致病的病原菌的研究最为深入，但筛选具有生防潜力的DSF高效降解菌株仍鲜有报道。因此，开发研究DSF降解菌及其制剂有着重要的研究价值和现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有植物病害生防技术的缺陷和不足，尤其是针对依赖DSF致病的致病菌的防治，提供一种新的具有高效降解群体感应DSF信号分子能力的菌种，即伯克氏菌。本发明研究发现，伯克氏菌对群体感应信号分子DSF有显著且快速的降解作用，且具有较好的抗生素耐药性，具有防治依赖DSF致病的病原菌巨大潜力，对解决农药或抗生素滥用及耐药性问题具有现实意义。
本发明的目的是提供一株可降解DSF信号分子的伯克氏菌(Burkholderiaanthina)菌株HN-8。
本发明另一目的是提供伯克氏菌在降解群体感应信号分子DSF及其类似物和防治DSF介导致病的植物病害方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株可降解DSF信号分子的伯克氏菌(Burkholderia anthina)菌株HN-8，该菌株于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO.60289。
该菌株从采集自广州华南农业大学试验田水稻根围土壤中，经人工筛选分离纯化获得，通过对该菌株的形态学特征、生理生化特性及16S rDNA系统发育分析，将该菌株鉴定为伯克氏菌(Burkholderia anthina)。
菌株HN-8的菌落形态特征为：在LB固体平板上培养48h，菌落为圆形，边缘整齐，凸起，黄色；在LB液体培养基中培养48h，呈扩散性混浊。
电镜观察细胞的形态特征为：细胞呈棒状。
该菌株HN-8的生理生化特性为：为革兰氏阴性菌，好氧，富有运动型。接触酶试验、氧化酶试验、酪素水解试验、明胶液化试验、ONPG试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验反应阳性，脲酶试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、溶血试验、精氨酸双水解酶试验、反应阴性；最适生长温度为30℃，最适pH为7.0。
所述菌株HN-8对氨苄青霉素、羧苄青霉素、链霉素的抗性达到400μg/mL或以上，对卡那霉素的抗性达到200μg/mL，对四环素的抗性达到50μg/mL，对庆大霉素和硫酸新霉素抗性达到10μg/mL，对利福平和氯霉素小于10μg/mL。
经过实验研究显示，该伯克氏菌菌株HN-8对群体感应信号分子DSF有显著且快速的降解作用，可在浓度高达5mM的DSF为唯一碳源的培养基中正常生长，在48h内能将初始浓度为2mM的群体感应DSF信号分子完全分解，在防治DSF介导的病原菌危害方面有巨大的应用潜力。
因此，伯克氏菌在降解群体感应信号分子DSF和/或DSF信号类似物中的应用，或在制备降解DSF和/或DSF信号类似物的产品中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
所述DSF信号类似物包括顺-2-十二碳烯酸、(2Z,3Z)-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸等。
伯克氏菌在防治DSF介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖DSF致病的致病菌的防治制剂方面的应用，也均应在本发明的保护范围之内。
优选地，上述任一所述的应用中，所述伯克氏菌为伯克氏菌菌株HN-8。
本发明还提供了一种防治依赖DSF致病的致病菌病害的方法，用伯克氏菌的菌悬液对植物进行喷雾处理，以预防依赖DSF致病的致病菌的侵染。优选地，伯克氏菌的菌悬液为菌株HN-8的菌悬液。
实验显示，伯克氏菌菌株HN-8对包括黄单胞菌(Xanthomonas)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)等在内的依赖DSF致病的病原菌的病害具有显著的生防作用，因此，上述任一所述的应用中，所述依赖DSF致病的致病菌包括：黄单胞菌(Xanthomonas)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)等。
优选地，应用时，所述的伯克氏菌降解DSF的最适pH为6.8～7.2，最适温度为28℃～30℃。即可以将伯克氏菌菌株HN-8的菌悬液的pH控制在6.8～7.2，在环境温度为28℃～30℃时对作物进行喷雾处理。
优选地，应用时，制备伯克氏菌的菌悬液所用的最适培养基为MSM培养基，其配方为：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L；Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；KH2PO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L，pH 7.2。
另外，一种含有菌株HN-8和/或其菌悬液的可降解群体感应信号分子DSF的降解菌剂，以及一种含有菌株HN-8和/或其菌悬液的依赖DSF致病的致病菌的生防制剂，也都应在本发明的保护范围之内。
具体优选地，所述降解菌剂和生防制剂是由菌株HN-8经过发酵所得的菌悬液制备而成。
实验显示，将该菌株的发酵上清和DSF共同培养，经过萃取和液相色谱分析发现DSF没有被明显降解的迹象，可知对DSF起降解作用的不是发酵产物。因此，使用发酵所得菌悬液来制备降解菌剂和生防制剂。
本发明同时还提供了菌株HN-8菌悬液的制备方法：具体是将菌株HN-8划线于LB固体培养基平板上，28℃～30℃下培养12～36h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中预培养至对数期，所得菌体用0.9％的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再将种子悬液按照体积比0.5％～5％(优选1％)的接种量接种至LB液体培养基培养至对数期，菌体用PBS缓冲液重悬得到菌株HN-8的菌悬液。菌悬液的浓度不做严格限制，具体可根据实际病害程度和应用效果进行调整。
优选地，LB培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH 6.8～7.2，121℃灭菌15～25min。LB固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5％(w/ν)的琼脂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种可高效降解群体感应信号分子DSF的伯克氏菌(Burkholderiaanthina)及其在生物防治中的应用。本发明研究发现，伯克氏菌对群体感应信号分子DSF有显著且快速的降解作用，且具有较好的抗生素耐药性，具有防治依赖DSF致病的病原菌巨大潜力，对解决农药或抗生素滥用及耐药性问题具有现实意义。
本发明还筛选得到了一株伯克氏菌菌株HN-8，具有DSF高降解活性，所述高降解活性是指在以DSF为唯一碳源的MSM培养基中，48h内能将初始浓度为2mM的群体感应DSF信号分子完全分解。实验表明，本发明的伯克氏菌HN-8与野油菜黄单胞菌XC1共同接种较单独接种XC1时对萝卜肉质根切片引起的黑腐病病害程度明显减轻，从而达到了对萝卜黑腐病防治的效果。
另外，菌株HN-8分离于水稻根围土壤，对环境能够较好的适应，且对环境友好，另外表现出对氨苄青霉素、羧苄青霉素和链霉素较高抗药性，达到400μg/mL，是作为生防菌的一个优势。
因此，本发明的伯克氏菌菌株HN-8具有对植物病原菌中群体感应DSF信号分子高降解活性、降解性能稳定、环境友好、对较多抗生素有较高抗性，在依赖DSF介导的致病的植物病原菌的防治中具有巨大的推广应用潜力，同时本发明可以减少抗生素滥用问题和农药残留污染问题，为生物防治植物病害提供了新思路。
附图说明
图1为本发明的菌株HN-8在LB固体培养基上的菌落形态图。
图2为本发明的菌株HN-8的扫描电镜图。
图3为本发明的菌株HN-8的系统进化树分析图。
图4为本发明的菌株HN-8在不同抗生素中的生长情况图。
图5为本发明的菌株HN-8在以DSF为唯一碳源的固体MSM培养基平板上降解DSF产生透明水解圈图。
图6为本发明的菌株HN-8对DSF降解的HPLC图(图A为未接种菌株HN-8的对照图，图B、C、D、E、F、G、H分别为菌株HN-8对2mM DSF降解12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h的高效液相色谱(HPLC)图)。
图7为本发明的菌株HN-8以DSF为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图。
图8为本发明的菌株HN-8单独接种及与野油菜黄单胞菌共同接种于萝卜肉质根切片72h后萝卜肉质根切片的发病情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1伯克氏菌菌株HN-8的获取与鉴定
1、菌株HN-8的分离、筛选
(1)土样采集：以采集自试验田的水稻根围土壤作为微生物源。
土样于2016年6月23日采集自广东省广州市华南农业大学实验田水稻根围土壤，表层至深层5cm的土壤都进行取样、装袋、保存作为微生物源进行菌株分离。
(2)菌株的富集培养：制备MSM培养基，将50mL的MSM培养基装到250mL三角瓶中灭菌，冷却后在无菌条件下加入DSF母液(甲醇为溶剂)，使DSF的最终质量浓度为50μM，同时加入土样5g，于30℃、200rpm摇床培养7d后，按10％的接种量转接到第二批DSF最终质量浓度为100μM的MSM培养基中。相同条件培养7d后，再按10％的接种量转接到DSF最终质量浓度为200μM的MSM培养基中，继续培养7d。以此类推，不断增加DSF的质量浓度。
MSM培养基的配方为：K2HPO4，10.5g/L；KH2PO4，4.5g/L；(NH4)2SO4，2.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4，0.005g/L；CaCl2，0.01g/L；MnCl2，0.002g/L；pH 7.2。
(3)菌株分离与纯化：采用稀释、平板涂布划线进行分离纯化。
取1mL终MSM培养基发酵液用无菌水将其浓度依次梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的发酵液，然后吸取100μL稀释好的各个浓度梯度的发酵液均匀地涂布在LB固体平板上，30℃培养，挑取长出的不同菌落形态的单菌落，在LB固体平板反复划线培养纯化，直至分离出单菌株。将单菌株-80℃保存，待HPLC测定DSF降解率进行筛选。
(4)菌株的筛选：利用以DSF作为唯一碳源的MSM基础培养基对从土样中分离得到的菌株进行筛选。
将分离纯化后的菌株单菌落接种于以DSF作为唯一碳源的50mL MSM基础培养基中，使得DSF最终质量浓度为5mM，在30℃、200rpm摇床培养48h后进行提取DSF和HPLC测定DSF残余量。
DSF的提取方法：每个样品取5mL至15mL离心管中，4000rpm离心5min，取上清液转移到50mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入5mL乙酸乙酯，摇匀，剧烈震荡3min，静置，分层，弃去下层溶液至15mL离心管中，上层液经漏斗过滤到50mL圆底烧瓶中，漏斗中铺有滤纸。下层溶液按上述方法再萃取1次。滤液并入圆底烧瓶，50℃恒温浓缩蒸干，用色谱甲醇分2次洗涤圆底烧瓶，定容至2mL，经0.45μM有机滤膜过滤至进样瓶，使用HPLC法测定其残余量。
HPLC测定DSF残余量条件：C18反向色谱柱，流速为1mL/min，柱温为35℃，流动相为甲醇：水＝80：20(ν：ν)，检测波长为210nm，进样量20μL。
按照下式计算DSF降解率：降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，A1为降解菌处理后DSF残留浓度，A0为对照处理后的DSF残留浓度。
最终获得DSF降解率最高的菌株，命名为HN-8。
2、菌株HN-8的鉴定及系统进化分析
(1)菌株HN-8的菌落形态特征为：在LB固体平板上培养48h，菌落为圆形，边缘整齐，凸起，黄色(图1)。在LB液体培养基中培养48h，呈扩散性混浊。
(2)电镜观察细胞的形态特征为：细胞呈棒状(图2)。
(3)该菌株HN-8的生理生化特性为：为革兰氏阴性菌，好氧，富有运动型。接触酶试验、氧化酶试验、酪素水解试验、明胶液化试验、ONPG试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验反应阳性，脲酶试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、溶血试验、精氨酸双水解酶试验、反应阴性；最适生长温度为30℃，最适pH为7.0。其生理生化鉴定结果如表1所示。
表1菌株HN-8生理生化鉴定结果
注：－：阴性反应；+：阳性反应。
(4)16S rDNA序列及系统进化分析：获得菌株HN-8的16S rDNA基因序列，长度为1414bp，然后与NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，发现所述菌株HN-8与Burkholderia anthina strain W92B(GenBank登录号为：NR 104975.1)具有很好的同源性，相似度达到99％，其系统进化树如图3所示。
综上所述，通过对菌株HN-8的形态学特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列的鉴定，菌株鉴定结果为伯克氏菌(Burkholderia anthina)，并于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60289，保藏地址是广东省微生物研究所。
实施例2菌株HN-8的抗生素敏感性分析
为了能够更好地研究实施例1所获得菌株HN-8的生防潜力，我们对该菌株HN-8的抗生素敏感性进行了研究。
结果如图4所示，该菌株对氨苄青霉素(AMP)、羧苄青霉素(CARB)、链霉素(STR)的抗性达到400μg/mL或以上，四环素(TET)的抗性达到200μg/mL，对卡那霉素(KAN)的抗性达到50μg/mL，对庆大霉素(GEN)、硫酸新霉素(NS)抗性达到10μg·mL-1，对利福平(RIF)、氯霉素(CM)的抗性小于10μg/mL。
抗生素敏感性结果表明，菌株HN-8具有很好的抗生素耐药性，尤其是对氨苄青霉素、羧苄青霉素、链霉素的耐药性，这一结果不仅有利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考，同时对于菌株HN-8作为生防菌是一个很大的优势。
实施例3菌株HN-8降解DSF的水解圈实验
本实施例利用以DSF作为唯一碳源的固体MSM培养基平板来测定菌株HN-8降解DSF产生水解圈情况。
1、制备MSM固体培养基，加入一定量的DSF母液作为唯一碳源，使得DSF终浓度为5mM。挑取菌株HN-8单菌落接种于LB培养基中预培养至对数期，所得菌液于4000rpm离心5min后，弃去上清液，菌体用0.9％的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液。取0.5μL种子悬液点板于以5mM DSF为唯一碳源的固体MSM平板上，将培养基平板放于30℃恒温培养，72h后观察水解圈情况。为了保证实验结果的可靠和准确，以只点板无菌生理盐水作为空白对照，点板Escherichia coli DH5α作为阴性对照。
2、菌株HN-8降解DSF的水解圈实验结果如图5所示，菌株HN-8有明显的DSF水解圈，而对照没有水解圈，说明菌株HN-8能够以DSF作为唯一碳源进行生长并降解DSF。
实施例4菌株HN-8生长和降解DSF关系曲线的测定
1、挑取菌株HN-8单菌落接种于LB培养基中预培养至对数期，所得菌液于4000rpm离心5min后，弃去上清液，菌体用0.9％的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以1：100的接种量接种到50mL MSM基础培养基中，并添加DSF母液，使其最终浓度为2mM，30℃，200rpm下培养24h，定时取样。采集不同时间点的样品，进行分光光度计测定OD600值表示菌株HN-8的生长情况，HPLC测定DSF的残留量表示菌株HN-8对DSF的降解情况。
2、HPLC检测结果如图6所示(其中图6中A图为未接种菌株HN-8的对照图，图B、C、D、E、F、G、H为菌株HN-8对DSF 12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h降解图)，菌株HN-8对DSF 12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h降解率分别达到5.6％、8.9％、23.5％、52.83％、89％、97.25％和100％，相应的菌株HN-8以DSF为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图如图7所示。
由图7可知，DSF的降解与菌株生长呈正相关，在DSF的存在下，12～42h为菌株生长的对数期，没有明显的稳定期，42h后菌株生长下降，对数期的24～36h阶段该菌株对DSF的降解最快，菌株培养至48h，DSF完全分解。
结果表明，伯克氏菌HN-8对DSF有显著且快速的降解作用，在防治DSF介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。
实施例5菌株HN-8对萝卜黑腐病的生防效果研究
1、本实施例以野油菜黄单胞菌为例，研究菌株HN-8对依赖DSF致病的致病菌的生防效果。
分别挑取菌株HN-8与依赖DSF致病的致病菌野油菜黄单胞菌XC1单菌落，分别接种于LB培养基中预培养至对数期，所得菌液于4000rpm离心5min后，弃去上清液，菌体用0.9％的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以1：100的接种量接种到LB培养基中，30℃、200rpm培养至对数期，菌体用PBS缓冲液重悬至OD600＝1.0，得到菌株HN-8和野油菜黄单胞菌XC1的菌悬液。
将菌株HN-8菌悬液与野油菜黄单胞菌XC1菌悬液混匀得到混合菌液。另外白萝卜肉质根用蒸馏水清洗干净，待外表干燥进行切片，肉质根横切获取厚约0.3cm的圆片，分别放入培养皿(内置已用无菌水浸润的棉花)。取100μL混合菌液，接种到萝卜肉质根切片上，接种的混合菌液中菌株HN-8和野油菜黄单胞菌XC1的OD600都为0.2，用涂布棒将其涂匀，30℃培养48h，观察发病情况。单独接种菌株野油菜黄单胞菌和单独接种菌株HN-8分别作为阳性对照和阴性对照。
2、结果如图8所示，菌株HN-8与野油菜黄单胞菌XC1共同接种较单独接种XC1时萝卜黑腐病病害程度明显减轻。实验结果表明，菌株HN-8对野油菜黄单胞菌XC1引起的黑腐病具有显著的生防效果，而且是安全不致病的菌种。
上述实施例主要阐述的菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

Claims (10)

1.一株可降解DSF群体感应信号分子的伯克氏菌（Burkholderia anthina）菌株HN-8，其特征在于，该菌株于2017年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO.60289。
2.伯克氏菌在降解群体感应信号分子DSF和/或DSF信号类似物中的应用，或在制备降解DSF和/或DSF信号类似物的产品中的应用。
3.伯克氏菌在防治DSF介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖DSF致病的致病菌的防治制剂方面的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述伯克氏菌为权利要求1所述伯克氏菌菌株HN-8。
5.一种防治依赖DSF致病的致病菌病害的方法，其特征在于，用伯克氏菌的菌悬液处理植物。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述依赖DSF致病的致病菌为：黄单胞菌（Xanthomonas）、洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）或绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述伯克氏菌的菌悬液的pH为6.8～7.2。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，制备伯克氏菌的菌悬液所用的培养基为MSM培养基，其配方比例为：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L；Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；KH2PO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L，pH 7.2。
9.一种可降解群体感应信号分子DSF的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述伯克氏菌菌株HN-8和/或其菌悬液。
10.一种依赖DSF致病的致病菌的生防制剂，其特征在于，含有权利要求1所述伯克氏菌菌株HN-8和/或其菌悬液。
CN201711405448.1A 2017-12-22 2017-12-22 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用 Active CN107937315B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711405448.1A CN107937315B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711405448.1A CN107937315B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107937315A true CN107937315A (zh) 2018-04-20
CN107937315B CN107937315B (zh) 2020-02-21

Family

ID=61941786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711405448.1A Active CN107937315B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107937315B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108739860A (zh) * 2018-05-02 2018-11-06 华南农业大学 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其作为生防菌的应用
CN109077066A (zh) * 2018-08-31 2018-12-25 华南农业大学 一种AHLs淬灭菌及其在防治依赖AHLs致病的病原菌中的应用
CN112646754A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 云南农业大学 一种伯克氏菌及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177671A (zh) * 2007-12-05 2008-05-14 南京农业大学 一株防治植物病害的生防细菌菌株
CN101926829A (zh) * 2010-08-10 2010-12-29 中国水产科学研究院南海水产研究所 枯草芽孢杆菌降解细菌群体感应信号及作为抗菌剂的用途
CN101935640A (zh) * 2009-07-03 2011-01-05 中国农业大学 细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用
WO2012105805A2 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Cj Cheiljedang Corporation Probiotics for biological control against vibrio sp.
CN104789528A (zh) * 2015-03-31 2015-07-22 南京邮电大学 十二烷基癸烯酸bdsf在提升raw264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用
CN105779323A (zh) * 2014-12-23 2016-07-20 中国科学院生态环境研究中心 一株群体感应信号分子高效降解菌及其菌剂的生产方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177671A (zh) * 2007-12-05 2008-05-14 南京农业大学 一株防治植物病害的生防细菌菌株
CN101935640A (zh) * 2009-07-03 2011-01-05 中国农业大学 细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用
CN101926829A (zh) * 2010-08-10 2010-12-29 中国水产科学研究院南海水产研究所 枯草芽孢杆菌降解细菌群体感应信号及作为抗菌剂的用途
WO2012105805A2 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Cj Cheiljedang Corporation Probiotics for biological control against vibrio sp.
CN105779323A (zh) * 2014-12-23 2016-07-20 中国科学院生态环境研究中心 一株群体感应信号分子高效降解菌及其菌剂的生产方法
CN104789528A (zh) * 2015-03-31 2015-07-22 南京邮电大学 十二烷基癸烯酸bdsf在提升raw264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUPPIGER, A等: "Evidence for the widespread production of DSF family signal molecules by members of the genusBurkholderia by the aid of novel biosensors", 《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY REPORTS》 *
刘长建等: "Burkholderia属luxIR同源群体感应系统的研究进展", 《安徽农业科学》 *
唐庆华等: "洋葱伯克氏菌致病因子的研究进展", 《微生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108739860A (zh) * 2018-05-02 2018-11-06 华南农业大学 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其作为生防菌的应用
CN109077066A (zh) * 2018-08-31 2018-12-25 华南农业大学 一种AHLs淬灭菌及其在防治依赖AHLs致病的病原菌中的应用
CN109077066B (zh) * 2018-08-31 2020-10-23 华南农业大学 一种AHLs淬灭菌及其在防治依赖AHLs致病的病原菌中的应用
CN112646754A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 云南农业大学 一种伯克氏菌及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107937315B (zh) 2020-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107893040B (zh) 一种微生物群体感应信号分子降解菌及其在病害防治中的应用
CN104673715B (zh) 对镉具有固定效应并能促进植物生长的肠杆菌及其应用
CN107629978A (zh) 一种硝基还原假单胞菌及其在降解群体感应信号分子dsf中的应用
CN110129240B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治芹菜软腐病中的应用
CN109161506A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN104263682B (zh) 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用
CN107201322A (zh) 用于降解黄曲霉毒素b1的枯草芽孢杆菌及其应用
CN108048351A (zh) 一株酰基高丝氨酸内酯降解菌及其在病害防治中的应用
CN107964516A (zh) 一种不动杆菌及其在降解群体感应信号分子dsf中的应用
CN101993847B (zh) 一种细菌纤维素菌株
CN107937315A (zh) 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用
CN110713945B (zh) 一种烟碱拟杆菌及其在病害防治中的应用
CN109082396A (zh) 一种dsf群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用
CN105219667B (zh) 用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法
CN109266574B (zh) 一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中的应用
CN108739860B (zh) 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其作为生防菌的应用
CN114107092A (zh) 一株降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌戈登氏菌l191及其应用
CN108611294B (zh) 一种群体感应信号分子dsf淬灭菌及其应用
CN105132332B (zh) 一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌的应用
CN116218683B (zh) 一种高山被孢霉及其在三七生物防治以及促生中的应用
CN109306336B (zh) 以群体感应信号分子AHLs为靶标的病害防治菌株及其应用
CN115340966B (zh) 一种戈登氏菌及其应用
CN104087526B (zh) 一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法
CN105861356B (zh) 一种拉乌尔菌pan22x及其应用
CN104004693A (zh) 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant