CN116218683B - 一种高山被孢霉及其在三七生物防治以及促生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高山被孢霉菌(Mortierella alpina)，该菌株能显著抑制三七根腐病主要病原菌的生长，与对照相比，5个三七根腐病菌的生长被显著抑制，其中对恶疫霉菌D‑6(Phytophthora cactorum)的拮抗抑制率达34.06％。通过使用高山被孢霉B28‑1菌株50mL分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理48h后，叶部接种三七黑斑病原菌Alternaria panax，结果发现病斑面积显著降低。通过使用高山被孢霉B28‑1菌株不同浓度的分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，均可提高三七存苗率，使存苗率达到80％以上，其中在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高存苗率，同时也均可降低根腐病发病率；在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高单株鲜重；以及地下部干重。具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株，具体涉及一种高山被孢霉及其在三七生物防治以及促生中的应用。
背景技术
三七是云南文山地区主要的经济作物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，由于三七具有严重的连作障碍，导致可供种植三七的土地越来越少。随着三七种植年限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量，其中最主要的病害为根腐病。
根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原真菌侵染三七植株根部导致的，土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。
被孢霉是一类气生菌丝非常发达的真菌，菌丝体内含有大量多糖物质和蛋白，所以，它除了可以生产y一亚麻酸、花生四烯酸等有机酸之外，还可以经过直接发酵产生糖化酶和多种蛋白酶。被孢霉除了作为产油微生物被利用在工业生产中，此外它还是根际微生物中常见的有益微生物。根际有益微生物不仅能够促进植物生长并且能提高植物的抵抗力水平，促生作用的机制主要是使植物获得水分无机盐、营养物质的能力提高。微生物能分泌植物激素类物质，引起抗生促进作用、重寄生作用及提高植物产生抗性的能力。有益微生物在植物病害预防和菌肥生产方面也有着巨大发展潜力。然而目前鲜有高山被孢霉菌Mortierella alpina对于三七生防应用的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高山被孢霉菌株及其在三七生物防治以及促生中的应用。
具体的，本发明第一个方面，提供一种高山被孢霉B28-1，该霉菌的保藏编号为CGMCC No.40006；分类命名为：高山被孢霉菌Mortierella alpina；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2021年12月10日。
本发明的第二个方面，提供一种采用权利要求1所述的高山被孢霉菌株制备的菌悬液。
本发明的第三个方面，提供上述菌株和/或其菌悬液在用于防治三七根腐病和黑斑病主要病菌中的应用。
本发明的第四个方面，提供上述菌株和/或其菌悬液在用于促进三七生长中的应用。
本发明的第四个方面，提供上述菌株和/或其菌悬液在用于缓解三七培养过程中土壤连作效应的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的高山被孢霉B28-1菌株能显著抑制三七根腐病主要病原菌的生长，与对照相比，5个三七根腐病菌的生长被显著抑制，其中对恶疫霉菌D-6(Phytophthoracactorum)的拮抗抑制率达34.06％。通过使用高山被孢霉B28-1菌株50mL分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理48h后，叶部接种三七黑斑病原菌Alternaria panax，结果发现病斑面积显著降低。通过使用高山被孢霉B28-1菌株不同浓度的分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，均可提高三七存苗率，使存苗率达到80％以上，其中在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高存苗率，同时也均可降低根腐病发病率；在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高单株鲜重；以及地下部干重。
附图说明
图1为高山被孢霉B28-1菌株在PDA培养基上的形态学特征，其中a为菌落形态，b为分生孢子梗形态，c为分生孢子形态。
图2为高山被孢霉B28-1菌株在以三七粗皂苷为唯一碳源上生长情况，其中a为缺碳培养基，b为以皂苷为唯一碳源的培养基。
图3为高山被孢霉B28-1菌株与三七主要根腐病菌对峙培养14天后的平板。
图4为高山被孢霉B28-1菌株增强三七植株对黑斑病的抗性；＊＊表示经t检验法检验与对照相比在P＜0.01水平差异显著。
图5为高山被孢霉B28-1对三七存苗率、发病率及生物量的影响；不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。
图6为高山被孢霉B28-1对三七连作土中种子出苗率及种子腐烂率的影响；不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1高山被孢霉B28-1菌株的分离及鉴定
(1)菌株的分离与纯化
称取三七根际土10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，25℃摇床振荡培养30min，然后进行10倍梯度稀释至10-1、10-2。吸取稀释液0.1mL放入添加有硫酸链霉素(100ppm)的PDA平板上均匀涂布，在28℃恒温培养箱中倒置培养1-3d，定期观察；待培养皿中长出疑似菌落后，立即进行挑取并转移到新鲜的PDA平板上进行编号保存；采用菌丝末端法进行纯化，得到如图1所示的纯培养物。所述PDA平板组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
(2)菌株的鉴定
提取分离纯化后菌株的基因组DNA，采用以下3对引物进行PCR扩增：
①上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′，和下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.
将上述扩增序列在NCBI数据库中进行比对，用BLAST比对后与高山被孢霉Mortierella alpina相似度最高，结合形态学鉴定，确定分类命名为高山被孢霉B28-1(Mortierella alpina)，菌株命名为B28-1。
所述高山被孢霉B28-1菌株在葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养8d，如图1所示，该菌株可长满直径为9cm的培养皿，菌落白色，呈花瓣状，菌丝发达致密，分生孢子梗不分枝，无隔，顶端分生孢子梗等特殊菌丝通过断裂成熟后形成分生孢子，分生孢子小而多，呈球形或椭圆形。
该高山被孢霉菌(Mortierella alpina)B28-1保藏信息如下：保藏编号为CGMCCNo.40006；分类命名为：高山被孢霉菌Mortierella alpina；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2021年12月10日。
实施例2高山被孢霉B28-1菌株生化特性
将高山被孢霉B28-1菌株置于粗皂苷培养基中培养，培养基组成为：3g NaNO3，1gKH2PO4，0.5g KCI，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g FeSO4·7H2O，10g粗皂苷，17g琼脂，1000mL蒸馏水，溶解，混匀，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.0。以不加粗皂苷的培养基为对照。生长情况如图2所示。所述高山被孢霉B28-1菌株在以三七粗皂苷为唯一碳源的培养基上生长，能较好的利用皂苷来促进自身生长，菌落形态清晰，边缘整齐，菌饼处可产生密集孢子，而缺乏碳源的培养基上菌落形态模糊，菌丝稀薄，产生少量孢子。
实施例3所述高山被孢霉B28-1菌株在三七根腐病防控中的应用
(1)所述高山被孢霉B28-1菌株对三七根腐病主要病原菌的拮抗能力测定
采用平板对峙法将高山被孢霉B28-1菌株与三七根腐病主要病原真菌进行共培养。供试三七病原菌株有：恶疫霉菌D-6(Phytophthora cactorum)、毁灭柱孢菌RS6(Cylindrocarpon destructans)、茄腐镰刀菌F3(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌Z4(Fusarium oxysporum)、雪腐镰刀菌M(Monographella cucumerina)共5株。将直径为5mm的高山被孢霉B28-1菌株和供试三七病原菌菌饼接种在PDA培养基上，彼此之间的距离约为5.5cm。每处理6次重复，对照为在一侧接种病原菌，在一侧接种琼脂块，于28℃恒温培养箱培养，待同一皿中的两株菌落边界开始有交集时，测量两个菌饼之间的菌落半径，计算抑制率。
抑制率(％)＝(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径×100
结果如表1和图3所示，高山被孢霉B28-1菌株能显著抑制三七根腐病主要病原菌的生长，与对照相比，5个三七根腐病菌的生长被显著抑制，其中对恶疫霉菌D-6(Phytophthora cactorum)的拮抗抑制率达34.06％。
表1高山被孢霉B28-1菌株对三七主要根腐病菌的拮抗能力测定
实施例4高山被孢霉B28-1菌株在诱导植株抗性防控三七黑斑病中的应用
制备高山被孢霉B28-1菌株分生孢子悬浮液，制备方法包括以下步骤：
1)将高山被孢霉B28-1菌株接种于PDA培养基上培养，得到高山被孢霉B28-1菌株菌落；
2)在步骤1)的培养皿中加入20mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到高山被孢霉B28-1分生孢子悬浮液。调节悬浮液的浓度为1×105CFU/mL。
通过使用高山被孢霉B28-1菌株50mL分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理48h后，对叶部接种的三七黑斑病原菌Alternaria panax进行检测，结果如图4所示，病斑面积显著降低。
实施例5所述高山被孢霉B28-1菌株在促进三七生长中的应用
制备高山被孢霉B28-1菌株分生孢子悬浮液，包括以下步骤：
1)将高山被孢霉B28-1菌株接种于玉米粉培养基上培养，得到高山被孢霉B28-1菌株菌落。所述玉米粉培养基组成为：40g/L的玉米粉、10g/L葡萄糖、2g/L KNO3、1g/LNaH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、20g/L琼脂。
2)在步骤1)的培养皿中加入20mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到高山被孢霉B28-1分生孢子悬浮液。调整悬浮液的浓度为1×105～1×107CFU/mL。
在装有灭菌土的花盆中种入三七种子，自然条件下培养3个月，待其出苗均匀后，挑选健康且长势均一的盆栽，每盆12棵三七植株，然后将高山被孢霉B28-1分生孢子悬浮液分别稀释至105、106、107CFU/mL浇灌于花盆中的三七根部，每盆50mL，以加入相同体积的灭菌水作为对照，每个处理7盆，每隔21天用制备的分生孢子悬浮液灌根一次，共浇灌菌液3次，最后一次灌根的7天后记录植株的存苗率，并将三七根系洗净记录根腐病发病率，然后擦干表面水分，称重记录植株单株鲜重及烘干后的地下部干重。
结果如图5所示，通过使用高山被孢霉B28-1菌株不同浓度的分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，均可提高三七存苗率，使存苗率达到80％以上，其中在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高存苗率，同时也均可降低根腐病发病率；在灌根浓度为105、106CFU/mL时可显著提高单株鲜重；以及地下部干重。
实施例6所述高山被孢霉B28-1菌株在缓解三七连作障碍中的应用
制备高山被孢霉B28-1菌株分生孢子悬浮液，包括以下步骤：
1)将高山被孢霉B28-1菌株接种于玉米粉培养基上培养，得到高山被孢霉B28-1菌株菌落。所述玉米粉培养基组成为：40g/L的玉米粉、10g/L葡萄糖、2g/L KNO3、1g/LNaH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、20g/L琼脂。
2)在步骤1)的培养皿中加入20mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到高山被孢霉B28-1分生孢子悬浮液。调整悬浮液的浓度为1×105～1×107CFU/mL。
在将种植过一年三七的连作土土壤过筛，每个组培瓶中装入60g土壤，将高山被孢霉B28-1分生孢子悬浮液分别稀释至105、106、107CFU/mL浇灌于组培瓶中，每瓶10mL，以加入相同体积的灭菌水作为对照，同时每瓶播种健康饱满的三七种子10颗，每个处理设置10个重复。待其发芽及生长期间，每隔7天对三七的出苗情况进行统计，4个月后对三七种子腐烂率进行统计。
结果如图6所示，通过使用高山被孢霉B28-1菌株不同浓度的分生孢子悬浮液对三七种子进行灌根处理，均可提高连作土中的三七出苗率，降低种子腐烂率，其中当菌液浓度为1×107CFU/mL时可显著提高连作土中的三七出苗率，相比对照提高17.75％的出苗率
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种高山被孢霉（Mortierella alpina）B28-1，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo. 40006。
2.一种采用权利要求1所述的高山被孢霉（Mortierella alpina）B28-1制备的菌悬液。
3.如权利要求1所述的高山被孢霉（Mortierella alpina）B28-1或权利要求2所述的菌悬液在用于防治三七根腐病和黑斑病主要病菌中的应用。
4.如权利要求1所述的高山被孢霉（Mortierella alpina）B28-1或权利要求2所述的菌悬液在用于促进三七生长中的应用。
5.如权利要求1所述的高山被孢霉（Mortierella alpina）B28-1或权利要求2所述的菌悬液在用于缓解三七培养过程中土壤连作效应的应用。
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