CN113308392B - 一株诺尼内生暹罗芽胞杆菌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌，命名为Bacillus siamensisQN₂MO‑1，藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021305。该菌株具有稳定广谱拮抗活性，对番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、菜心炭疽病菌、胶孢炭疽菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、芒果叶疫病、小麦赤霉病菌、板栗疫病菌、芒果拟盘多毛孢叶枯病、水稻稻瘟病菌、芒果炭疽病菌等有较强抑菌作用，而且其发酵液可有效抑制病原菌丝对离体叶片、果实等的侵染，增加生防制剂有效成分安全来源，为番茄枯萎病等多种植物病症的防治拓展新领域，具有良好的开发应用前景。

Description

一株诺尼内生暹罗芽胞杆菌的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株诺尼内生暹罗芽胞杆菌的应用。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是目前世界上消费量最大的蔬菜之一，富含番茄红 素与维生素c等营养元素，被誉为人类的天然“抗氧化剂”，因含糖量高也是餐桌上常见的明星 水果，并具有一定的药用价值，市场需求量大，经济效益高，全球种植范围广泛。但设施栽培 密闭性、连年重茬、重肥重药等管理模式使病害频发，严重限制番茄产业的发展。番茄枯萎病 (Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.lycopersici(Sacc)Snyder etHansen)即其中之一，具强专化性 的土传维管束病害(Grattidge et al.，1982)，多发于番茄开花结果期，局部一经侵染整株显病， 使番茄品质和产量“断崖式”下跌。

在农业可持续发展观念的强化和化学防治难以奏效的双重冲击下，植物内生细菌因其种类 繁多而且来源广、数量大，可促进植物生长、防治病害和修复土壤等优点，得到了越来越多关 注和越来越广的研发空间。

素有“不烂果”之称的海滨木巴戟(Morinda citrifolia L.)，俗称“诺尼”(Noni)，其食药用 功效研究至今已2000多年历史，具有多种抗菌、抗氧化生物活性，有研究表明，药用植物体 内含有大量功能内生菌，是新的活性物质和抗生素分离的重要微生物来源，前人已在诺尼果实 等部位分离鉴定出300余种蒽醌类、黄酮类等化合物。目前国际上对功能植物诺尼的研究多为 人体保健方向，还鲜少有针对诺尼内生细菌在农业上的应用研究报道，且仅局限于分类鉴定(白 飞荣等，2015)。而植物微生物在防控土传病害上的研究至今已有70余年的历史(Bahme et al.， 1987)，利用“以菌治菌”的生物防治理念是发展农业经济的趋势所在，大田作物及工业原料作 物中广泛存在的芽胞杆菌是自然界中植物内生拮抗菌代表之一。暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)是于2010年被发现分离自泰国螃蟹腌制品的芽胞杆菌属新种(Sumpavapol P et al， 2010)，具有强耐受性、粘附性和稳定性，在宿主植株的病害防效上有较大的可研空间。因此， 开展诺尼内生细菌功能研究可为生防菌株开发利用提供可行性依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌Bacillus siamensis QN₂MO-1，具有稳定广谱拮抗活性，对多种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用。

本发明的第一个方面是提供一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌，命名为：Bacillussiamensis QN₂MO-1(下文简称“QN₂MO-1”)，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址在中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021305。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌的发酵液、或 发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌、或者本发明 第二个方面所述的发酵液或发酵上清液或粗提蛋白在拮抗番茄枯萎病菌、和/或香蕉枯萎病菌4 号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和 /或草莓炭疽病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或胶孢 炭疽菌、和/或玉米弯孢霉叶斑病菌、和/或芒果叶疫病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或板栗疫 病菌、和/或芒果拟盘多毛孢叶枯病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌、或者本发明 第二个方面所述的发酵液或发酵上清液或粗提蛋白在制备防治番茄枯萎病、和/或香蕉枯萎病、 和/或黄瓜枯萎病、和/或辣椒炭疽病、和/或草莓炭疽病、和/或荔枝炭疽病、和/或香蕉炭疽病、 和/或菜心炭疽病、和/或胶孢炭疽病、和/或玉米弯孢霉叶斑病、和/或芒果叶疫病、和/或小麦 赤霉病、和/或板栗疫病、和/或芒果拟盘多毛孢叶枯病、和/或水稻稻瘟病、和/或芒果炭疽病 的生防制剂中的应用。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌的培养方法， 将诺尼内生暹罗芽胞杆菌QN₂MO-1接种至培养基中进行培养，其中，所述培养基含有氮源 0.2-2g/100ml，碳源0-2g/100ml，无机盐0.2-2g/100ml。

优选地，将氮源、碳源和无机盐溶于无菌水中，调节pH，即可得到所述培养基。

优选地，所述培养基含有氮源0.4-1.6g/100ml，例如0.4g/100ml、0.6g/100ml、0.8g/100ml、 1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述培养基含有碳源0或0.4-1.6g/100ml，例如0、0.4g/100ml、0.6g/100ml、 0.8g/100ml、1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述培养基含有无机盐0.2-2g/100ml，例如0、0.4g/100ml、0.6g/100ml、0.8g/100ml、1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述氮源为胰蛋白胨、氯化铵、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸铵、天门冬酰胺、硝酸 钾中的一种或多种。进一步优选地，所述氮源为氯化铵、硝酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖中的一种或多种。 进一步优选地，所述碳源为蔗糖、麦芽糖或D-果糖中的一种或多种。

优选地，所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化 锰、磷酸三钙中的一种或多种。进一步优选地，所述无机盐为磷酸氢二钾和/或氯化钠。

其中，所述培养基的pH为5.5-8.0，例如5.5、5.8、6.0、6.1、6.4、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.6、8.0等。优选地，培养基pH为5.8-7.6。进一步优选地，培养基pH为6-6.5。

其中，接种量为1％-11％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、19％、11％ 等。优选地，接种量为4％-10％。进一步优选地，接种量为3％-5％。

其中，培养时摇床转速为100-200rpm，例如100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm等。优选地，摇床转速为120-180rpm。进一步优选地，转速为140rpm。

其中，培养时间为12-72h，例如12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h等。优选地，培养时间为18-54h。进一步优选地，培养时间为36-48h。

在一个优选的实施方式中，氮源为1g/100mL的硝酸钾、碳源为0.6g/100mL的D-果糖、 无机盐为0.4g/100mL的氯化钠，培养基pH为6.4，接种量为4％，摇床转速为180rpm，培养 时间为36h，该培养条件用于制备菌株发酵上清液。

在一个优选的实施方式中，氮源为1g/100mL的氯化铵、碳源为0.5g/100mL的蔗糖、无机 盐为1g/100mL磷酸氢二钾，pH 6.5，接种量为5％，摇床转速为140rpm，培养时间为36h，该 培养条件用于制备菌株发酵液。

本发明的第六个方面是提供一种用于如本发明第一个方面所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌 发酵培养的培养基，其特征在于，所述培养基含有氮源0.2-2g/100ml，碳源0-2g/100ml，无机 盐0.2-2g/100ml，pH为5.5-8.0。

优选地，将氮源、碳源和无机盐溶于无菌水中，调节pH，即可得到所述培养基。

优选地，所述培养基含有氮源0.4-1.6g/100ml，例如0.4g/100ml、0.6g/100ml、0.8g/100ml、 1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述培养基含有碳源0或0.4-1.6g/100ml，例如0、0.4g/100ml、0.6g/100ml、0.8g/100ml、1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述培养基含有无机盐0.2-2g/100ml，例如0、0.4g/100ml、0.6g/100ml、0.8g/100ml、 1.0g/100ml、1.2g/100ml、1.4g/100ml、1.6g/100ml等。

优选地，所述氮源为胰蛋白胨、氯化铵、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸铵、天门冬酰胺、硝酸 钾中的一种或多种。进一步优选地，所述氮源为氯化铵、硝酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖中的一种或多种。 进一步优选地，所述碳源为蔗糖、麦芽糖或D-果糖中的一种或多种。

优选地，所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化 锰、磷酸三钙中的一种或多种。进一步优选地，所述无机盐为磷酸氢二钾和/或氯化钠。

其中，所述培养基的pH为5.5-8.0，例如5.5、5.8、6.0、6.1、6.4、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.6、8.0等。优选地，培养基pH为5.8-7.6。进一步优选地，培养基pH为6-6.5。

在一个优选的实施方式中，所述培养基中氮源为1g/100mL的硝酸钾、碳源为0.6g/100mL 的D-果糖、无机盐为0.4g/100mL的氯化钠，培养基pH为6.4，接种量为4％，摇床转速为 180rpm，培养时间为36h，该培养基用于制备菌株发酵上清液。

在一个优选的实施方式中，所述培养基中氮源为1g/100mL的氯化铵、碳源为0.5g/100mL 的蔗糖、无机盐为1g/100mL磷酸氢二钾，pH 6.5，该培养基用于制备菌株发酵液。

本发明的QN₂MO-1具有稳定广谱拮抗活性，对番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病菌4号生理小 种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病 菌、香蕉炭疽病菌、菜心炭疽病菌、胶孢炭疽菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、芒果叶疫病菌、小麦 赤霉病菌、板栗疫病菌、芒果拟盘多毛孢叶枯病菌、水稻稻瘟病菌、芒果炭疽病菌等17种常 见作物病原真菌有较强的抑菌作用，而且其发酵液可有效抑制病原菌丝对离体叶片、果实等的 侵染，增加生防制剂有效成分安全来源，为番茄枯萎病等多种植物病症的防治拓展新领域，具 有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为QN₂MO-1的抑菌试验结果。

图2为不同氮源对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果，其中，A为对发酵液 的抑菌率影响结果，B为对上清液的抑菌率影响结果。

图3为不同碳源对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果，其中，A为对发酵液 的抑菌率影响结果，B为对上清液的抑菌率影响结果。

图4为不同无机盐对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果，其中，A为对发酵 液的抑菌率影响结果，B为对上清液的抑菌率影响结果。

图5为不同接种量对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果。

图6为不同培养时间对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果。

图7为不同摇床转速对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果。

图8为不同pH值对QN₂MO-1的发酵液及上清液的抑菌率影响结果。

图9为DPS均匀实验抑菌结果。

图10为各级硫酸铵饱和度的抑菌活性，其中，0-20％、20-30％、30-50％、50-70％、70-80％ 等饱和浓度梯度是为表示缓慢递增过程，“0-20％”表示饱和度提至20％，“20-30％”表示饱和度 提至30％，“30-50％”表示饱和度提至50％，“50-70％”表示饱和度提至70％，“70-80％”表示饱 和度提至80％)。

图11为不同粗蛋白浓度的抑菌活性。

图12为离体叶片实验结果照片。

图13为不同处理对番茄离体叶片病斑的影响结果。

图14为离体果实感病实验结果照片。

图15为QN₂MO-1菌落扫描电镜图。

图16为构建的QN₂MO-1菌株的系统发育树，标尺以0.001表示相似度的百分比，分支点 上的数字表示自聚值(％)；括弧内字符串表示数据库中菌株的序列号。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌，命名为：Bacillus siamensis QN₂MO-1，于2021 年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021305。本发明的暹罗芽胞杆菌Bacillus siamensis QN₂MO-1(下文简称“QN₂MO-1”) 从诺尼活株果实中分离、筛选得到。

1实验材料

1.1实验材料

供试菌株为本申请发明人分离于海南省澄迈县桥头镇诺尼种植基地(北纬N 19°58′35″， 东经E 109°55′35″)诺尼活株果实的QN₂MO-1。

1.1.1菌株分离筛选：

①对诺尼果实进行灭菌处理。用75％乙醇浸泡5min，后用次氯酸钠(棕色瓶)处理20min， 再用10％的碳酸氢钠浸泡10min，无菌水冲洗5次，在灭菌滤纸上晾干并标注。

②进行样品印迹实验(Ting Ding et al，2017)。采用组织印迹法将果实表面贴放于LB培 养基中5min，28℃培养3d作为无菌检查。

③样品研磨。已灭菌果实徒手切成薄片后置于灭菌研钵中研磨至糊状，取汁液1mL于 离心管中，加入4mLLB培养基，室温180r/min培养1h，涡旋振荡。

④菌株分离。配制浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3的样品悬浮液，充分振荡后各取200μL滴于LB培养基上，涂布均匀，重复3次，常温下倒置培养2d，观察菌落形态。用平板划线 法多次纯化特征相异的单菌落至纯培养。

1.1.2菌株分类鉴定

1.1.2.1形态学与生理生化学鉴定

将菌株活化，37℃培养2d，参考《常见细菌鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》对其菌 落形态特征及酶学特性、碳氮源利用、耐受性等进行生理生化鉴定(东秀珠等，2001)。

①菌株形态学特征

该菌落在LB培养基上呈椭圆形，呈淡黄色，不透明，表面平整，边缘锯齿状，中央隆起， 椭圆或短杆状，属于革兰氏阳性菌。描电镜下观察呈棒状，形态短小(图15)。随着培养时间 延长，菌落趋向干燥扁平、边缘褶皱不规则。

②生理生化特征

生理生化实验测定结果所示，QN₂MO-1在淀粉水解、明胶液化和H₂S产出中呈阳性反应， V-P实验中QN₂MO-1代谢可发酵葡萄糖产丙酮酸，在硝酸盐还原试验中可还原硝酸盐为亚硝 酸盐；但酶脂、脲酶、MR甲基红实验和纤维素水解实验表现中均呈阴性反应。

碳源利用试验发现，QN₂MO-1可利用肌醇、D-果糖、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉、蜜二糖、松三糖、海藻糖、α-乳糖、无水乳糖、D-甘露醇等碳源，不可利用麦芽糖、木聚糖、甘露醇、D-半乳糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖；在氮源利用试验中可利用天门冬酰胺、组氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、甘氨酸、草酸铵、苯丙氨酸、硝铵酸、硫氨酸和甲硫氨酸，但是不可利 用精氨酸、丝氨酸、乙酸铵、氯化铵、酪氨酸、半胱氨酸和四水合钼酸铵。

经pH和NaCl耐受性实验可知，QN₂MO-1菌株培养在28℃-37℃、pH值为5至10的环境中可正常生长，最适pH值为8.0；最适盐耐浓度为4％，并且当培养基NaCl含量高于10％则无法生长。

1.1.2.2分子生物学鉴定

将活化菌株接种于LB中，用细菌通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rDNA基因(陈倩倩等，2016)。PCR 扩增反应体系(25μL)：DNA模板1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2xTaqPCR MasterMix 12.5μL，ddH₂O 10.5μL，反应条件包括94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃ 退火1min，72℃延伸2min，72℃后延伸10min，4℃保藏。取5μL PCR产物于1％琼脂糖 凝胶电泳预检测，并送至华大测序。将序列与Genebank数据库进行Blast比对，选取同源性 较高序列，运用MEGA 7.0软件邻接法进行聚类分析和构建系统发育树(东秀珠等，2001)。

在GeneBank和EzBioCloud数据库中进行比对分析，通过MEGA 7.0软件邻接距离矩阵法 将选取的13株与QN₂MO-1同源性较高的16S rDNA基因序列共建系统发育树(图16)。结果 表明，菌株QN₂MO-1与Bacillus siamensis KCTC 13613^T(AJVF01000043)有较高同源性，处于 同一分支，bootstrap值39％，且相似率为99.04％。根据16S rDNA序列分析及进化学结果，综 合形态特征观察结果和生理生化特征分析结果，初步鉴定该菌为暹罗芽胞杆菌，命名为Bacillus siamensis QN₂MO-1。

1.2培养基

LB培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠l0 g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.5。

1.3供试病原真菌

共17种，番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.lycopersici(Sacc)Snyder et Hansen)、香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumSchlecht.f.sp.cubense(E.F.Sm.) Snyd.et Hans,Foc 4)、香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.cubense (E.F.Sm.)Snyd.et Hans,Foc 1)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp.cucumerinum Owen.)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae Brooks)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae Berk.et Curt.)、菜心炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)、胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularialunata(Wakker) Boed)、芒果叶疫病菌(Alternaria tenuissima)、小麦赤霉病菌(FusaHumgraminearum Sehw)、 板栗疫病菌(Cryphonectraa paraitica)、芒果拟盘多毛孢叶枯病菌(Pestalotiopsis mangiferae (P.Henn.)Steyaert)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr)、芒果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides Penz.)。

1.4不同处理菌液的制备

发酵液原液：吸取25mL种子液加入500mL LB液体培养基中，37℃下180r/min摇床培 养2d。

菌悬液：将发酵液原液于离心机中12000r/min高速离心1h，去上清留沉淀，将沉淀悬于 等量无菌水中。

发酵液上清液：配置1L的发酵液原液，按量分装入50mL的离心管内，置于4℃、的离心机中12000rpm，高速旋转30min，吸取上清，并用0.22μm孔径过滤器除菌。

病原菌原液：将病原菌菌饼置于PDA固定培养基中心点位置28℃培养至平板边缘活化， 取5mm大小的菌饼置于装有PDA液体培养基的三角瓶内，将摇床转速设置为180r/min，28℃ 恒温下摇瓶培养7d。

病原菌孢子悬液：病原菌平板培养7d后在无菌环境下刮取孢子，滴加含0.1％浓度的吐温 -80无菌水，过滤，28℃恒温箱中培养7h。

2方法和结果

2.1数据处理分析软件

采用Microsoft Excel 2007进行数据统计处理；在单因素方差分析软件中进行实验数据差 异性分析，运用邓肯氏新复极差检验法(DMRT法)进行各处理间差异显著性比对；运用DPS 数据处理系统(Version 9.50)进行均匀实验设计的实验因子优化；运用Image J(Version 1.38) 软件进行图片区域和像素统计分析。

2.2内生拮抗能力测定

采用平板对峙培养法评估目标菌株对病原真菌的拮抗能力，以17种供试病原真菌为靶标 菌株，将直径为5mm的病原菌菌饼无菌接种于PDA平板的中心位置，以十字交叉法分别在 距中心点25mm处点接目标菌，每皿接4处，设3个重复，以不接目标菌为对照，常温下培养观察目标菌株的是否产生抑菌带。

对产生明显抑菌带的目标菌株持续观察，待对照病原菌长满培养皿，采用十字交叉法使用 直尺测定病原菌菌饼大小和抑菌带宽，并计算目标菌株的抑菌效果。

计算公式(张妙宜等，2017)，(下同)：

病原菌菌落直径(cm)＝测量菌落直径平均值(cm)-5.0；

对QN₂MO-1菌株进行17种供试病原真菌广谱实验(结果见图1和表1)，发现该内生细 菌均表现出明显抑制效果，抑菌率在60.78％-84.51％，对枯萎病抑菌效果强弱依次是番茄枯萎 病>香蕉枯萎病>黄瓜枯萎病，对番茄枯萎病的抑菌率达63.33％。说明该菌株对香蕉、荔枝、 橡胶、芒果、辣椒、草莓、板栗、小麦、水稻、玉米、番茄、黄瓜和菜心等13种以上作物寄 主的真菌病害有一定防治作用，辐射真菌病原包括尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、炭疽盘长孢菌、 禾谷镰孢菌、拟多毛盘孢菌、稻梨孢菌等，是一株具有明显广谱性的拮抗功能菌株。

表1 QN₂MO-1菌株的抑菌谱

注：表中abcdef分别表示在邓肯氏新复极差法检验p＜0.05水平上的显著差异性。

2.3菌株拮抗能力单因素优化

为确定目标菌株抑制番茄枯萎病的最优培养条件，分别对其进行碳源、氮源、无机盐3 个培养因子和接种量、培养时间、转速、pH值4个培养条件的优化，分析在以上因子影响下 目标菌株发酵液及发酵上清液的抑菌率。采用琼脂打孔法进行抑菌圈试验，在PDA固体培养 基中心点距平板边缘25mm位置用打孔器(孔径7mm)“十字”对称打四孔，每板每孔各加入 100μL的待测发酵液和发酵上清液，平板中心接入5mm大小的番茄枯萎病病原菌菌饼，以无 菌水为空白对照，设3个重复。37℃培养至对照培养基布满病原真菌，分别测量抑菌带宽并计 算发酵液原液和发酵上清液的抑菌率。

(1)不同氮源对抑菌效果的影响

以氮源为胰蛋白胨LB培养基为对照，分别以氯化铵、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸铵、天门 冬酰胺、硝酸钾为筛选氮源替代对照培养基中的胰蛋白胨，进行菌株发酵培养，并测定菌株在 不同氮源环境培养下对番茄枯萎病的抑制作用，确定发酵培养基的最适氮源。

氮元素是蛋白质及核酸物质构成的基本，氮源是微生物培养和发酵过程中最基础的营养物 质条件。分别对菌株可生长的不同氮源进行筛选，发现不同处理的QN₂MO-1菌株培养中菌体 及代谢物的抑菌效果有所不同，结果见图2。如图2A中所示，氯化铵、硝酸钾、牛肉浸膏、 硝酸铵、天门冬酰胺、蛋白胨、胰蛋白胨等7种不同氮源的发酵液的抑菌率分别为82.35％、 81.76％、75.29％、73.53％、71.18％、63.53％、66.47％，抑菌效果强弱为氯化铵〉硝酸钾〉牛 肉浸膏〉硝酸铵〉天门冬酰胺〉胰蛋白胨〉蛋白胨，除氯化铵和硝酸铵抑菌率达80％以上，其 余氮源的发酵液存在显著性差异；在发酵上清液抑菌效果图(图2B)中，氯化铵、硝酸钾、 牛肉浸膏、硝酸铵、天门冬酰胺、蛋白胨、胰蛋白胨等7种不同氮源的发酵上清液的抑菌率分 别为47.06％、54.12％、50.59％、48.25％、53.53％、52.94％、47.06％，抑菌效果最佳的氮源为 硝酸钾，而胰蛋白胨和氯化铵则在筛选氮源中效果稍弱。

(2)不同碳源对抑菌效果的影响

以未添加碳源的LB培养基为对照，并且分别以其为基础添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳 糖、可溶性淀粉、D-果糖为筛选碳源，进行菌株培养和拮抗实验，确定菌株发酵培养的最适碳 源。

碳元素是组成生物体有机物的基础元素，是构于糖类及其它生物大分子的基本要素，是微 生物生长及能量代谢活动的重要物质，对微生物培养和发酵起保障作用。发酵液琼脂打孔抑菌 实验中，对照组以及葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖等6种不同碳源的发 酵液的抑菌率分别为77.06％、65.88％、83.53％、78.82％、67.06％、74.71％、71.76％，QN₂MO-1 拮抗菌株在发酵培养中对供试碳源的选择，以蔗糖为最优，其次是麦芽糖，而可溶性淀粉、 D-果糖、乳糖、葡萄糖等碳源的抑菌率效果均比未添加碳源的培养基差，抑菌率在 65.88％-83.53％范围内(图3A)。发酵上清液琼脂打孔抑菌实验中，对照组以及葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖等6种不同碳源的发酵上清液的抑菌率分别为56.71％、 55.29％、56.47％、57.65％、52.35％、56.47％、71.18％，碳源为D-果糖时的拮抗效果与其它碳 源相较差异性显著，抑菌率高达71.18％，而其它碳源的抑菌效果为52.35％-57.65％(图3B)。

(3)不同无机盐对抑菌效果的影响

以氯化钠为无机盐的LB培养基为对照，分别以磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钙、七水 硫酸亚铁、氯化锰、磷酸三钙为筛选对象替代氯化钠，以确定菌株的最适无机盐因子。

无机盐是组成细胞化合物的矿物质营养素，是有效调节细胞渗透压和维持胞内酸碱平衡的 影响因子，是构成菌体的元素之一。在氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钙、七水硫酸 亚铁、氯化锰、磷酸三钙等7种无机盐筛选中，发酵液的抑菌率分别为80.59％、85.29％、67.06％、 68.82％、73.53％、71.18％、75.88％(图4A)，发酵上清液的抑菌率分别为59.41％、48.82％、 44.71％、42.94％、32.94％、45.29％、37.06％(图4B)，发酵液和发酵上清液的最佳无机盐环 境分别是磷酸氢二钾和氯化钠，抑菌率分别为85.29％和59.41％。

(4)接种量对抑菌效果的影响

在LB培养基上，分别以1％、3％、5％、7％、9％、11％的接种量为培养水平，确定菌株 的最适接种量。

接种量可影响菌株发酵的生长速率，适宜的接种量菌株繁殖达到最大化，可以直接影响微 生物代谢产物的合成时间，减少被污染的可能。接种量的大小对发酵液及发酵上清液抑制番茄 枯萎病的需求趋势基本一致，较低或较高接种量都不利于菌株生长代谢，当菌量不足菌株无法 发挥出正常的代谢水平，当菌量过高时反而会因菌群氧气争夺影响微生物数量和质量。分别以 1％、3％、5％、7％、9％、11％接种量的种子液培养发酵时，发酵液对番茄枯萎病病原真菌的 抑菌率分别为74.12％、75.29％、87.06％、73.53％、74.71％、75.88％，发酵上清液对番茄枯萎 病病原真菌的抑菌率分别为61.76％、62.94％、68.82％、64.12％、61.76％、56.47％(图5)，当 以5％接种量的种子液培养发酵时，菌株为抑制番茄枯萎病病原真菌繁殖达到高峰期。

(5)培养时间对抑菌效果的影响

在LB培养基上，分别以12h、24h、36h、48h、60h、72h为菌株的发酵时间，确定最适培养时间。

培养时间是微生物发酵培养的重要因素，不同细菌的培养周期各不相同，一般细菌在适宜 温度下的生长周期为18-48小时，个别厌氧菌则需要的时间更长。为将菌株的拮抗功能最大化， 分别对菌株发酵培养时间12h、24h、36h、48h、60h、72h进行发酵液及发酵上清液的拮抗能 力测定(结果见图6)，发现发酵培养时间为12h、24h、36h、48h、60h、72h时，发酵液的抑 菌率分别为68.24％、68.82％、77.06％、71.18％、75.29％、73.53％，发酵上清液的抑菌率分别 为58.24％、59.41％、62.35％、58.24％、56.47％、55.29％，菌株抑菌曲线总体为先增后降，在 36h时达到最大值，并在48h之后相对稳定，说明该菌株在培养时间上有益于后期的菌肥培养。

(6)转速对抑菌效果的影响

在LB培养基上，分别以100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm为 摇床转速筛选水平，培养并测定抑菌率。

转速是影响微生物发酵过程中溶氧量的关键因素，适宜的转速对菌株呼吸耗氧和复氧作用 提供饱和度条件，延长菌株的生长周期。从图7的实验结果可知，转速为100rpm、120rpm、 140rpm、160rpm、180rpm、200rpm时，发酵液的抑菌率分别为73.53％、75.29％、77.65％、 75.29％、73.53％、72.35％，发酵上清液的的抑菌率分别为63.53％、62.94％、66.47％、58.82％、 63.53％、58.82％；QN₂MO-1发酵培养对转速的要求趋向于平稳，在100-200rpm的转速区间， 发酵液抑菌率为72.35％-77.65％，发酵上清液则为58.2％-64.12％，均在140rpm转速时达到最 大值。

(7)pH值对抑菌效果的影响

在LB培养基上，分别设置培养基pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，培养后进行拮抗实验，确定菌株发酵环境的最适pH值。

pH酸碱度的调节是细胞代谢过程中营养物质的通路之一，在液态环境中，pH可对细胞溶 酶体膜的通透性发生改变，从而分解细胞外的营养物质，也是新陈代谢活动中酶活性的重要调 节因素，在发酵过程中培养环境pH并不是恒定不变的，以操作的实际情况出发，只观察初始 酸碱环境对菌株发酵后的抑菌率影响，从图8可以看出，pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 时，发酵液的抑菌率分别为71.18％、73.53％、74.12％、70.59％、68.24％、67.65％，发酵上清 液的的抑菌率分别为58.82％、59.41％、68.24％、64.12％、63.53％、61.76％；菌株在pH5.5-pH8.0 的酸碱环境中均有一定的抑菌活性，而能使发酵液及发酵上清液的发挥最佳抑菌水平的pH值 均为6.5，其抑菌率分别为74.12％和68.24％。

通过菌株QN₂MO-1拮抗能力的单因素优化，发现发酵液和发酵上清液因菌体及代谢产物 对环境的要求存在一定差异性，对基础培养基的要求略有不同，而对培养条件的要求则保持一 致。在pH 6.5的环境下，以5％接种量、140rpm匀速培养36h，发酵液培养的最佳抑菌优化效 果是以氯化铵、蔗糖、磷酸氢二钾为基础培养基，而发酵上清液则是以硝酸钾、D-果糖、氯化 钠为最佳培养基，最佳抑菌率分别为87.06％和64.71％。

2.4菌株拮抗能力DPS均匀实验优化

为了使各实验因子在实验范围内均匀散布，并提高实验效率及节约费用开支，结合微生物 培养发酵因素的界限值，对菌株拮抗能力单因素优化结果进行分析后，运用DPS数据处理软 件进行菌株培养条件的均匀设计优化，设计7因子7水平的参数值，在DPS软件中得到均匀 设计表U₇(7⁷)的7个实验方案(N1-N7)，见表2，将氮源、碳源、无机盐按照表中的比例 添加至无菌水中，调节pH即为N1-N7实验方案的培养基，其中碳氮源无机盐是根据“2.3菌 株拮抗能力单因素优化”结果得出，氮源为硝酸钾、碳源为D-果糖、无机盐为氯化钠(应当理 解的是，本实验为举例说明，采用“2.3菌株拮抗能力单因素优化”中的其他碳源、氮源、无机 盐，也都具有一定抑菌效果)。根据实验方案进行菌株发酵培养，以未接菌培养基为空白对照， 测定菌株发酵上清液对番茄枯萎病的拮抗能力，重复3次，再进行DPS软件线性回归方程分 析，使拮抗能力达到最佳稳定水平，确定最终的培养优化。

表2菌株培养条件均匀试验设计表

根据均匀设计优化方案的培养条件进行实验优化，利用琼脂抑菌圈法测定菌株发酵上清液 的最优抑菌效果。实验结果如图9所示，优化方案的抑菌效果明显比CK对照好，抑菌率在 51.25％-65.00％之间(表3)，其中以方案N1最佳，经方差分析呈显著性差异。根据DPS数据 处理系统进行一元线性回归方程分析，得到影响因子的优化值分别为：x1＝36、x2＝180、x3＝6.4、 x4＝4、x5＝1、x6＝0.6、x7＝0.4，即表示培养时间为36h、转速为180rpm、pH为6.4、接种量 为4％、氮源为1g/100mL的硝酸钾、碳源为0.6g/100mL的D-果糖、无机盐为0.4g/100mL 的氯化钠。将

Y＝64.5138071-0.06784440186x1+0.07881757736x2+2.8175276196x5-11.425829268x6-8.481 763665x7

代入优化方案的参数值进行验证，得出最佳抑菌率为68.83％，故推断出线性分析值与均 匀实验方案验证结果相匹配，说明可使用均匀实验来优化发酵上清液，为后期菌株粗提蛋白的 分离筛选作准备，以使菌株代谢产物达到最大拮抗效果。

表3上清液培养条件均匀试验结果

注：表中ab分别表示在邓肯氏新复极差法检验p＜0.05水平上的显著差异性。

2.5菌株代谢产物的抑菌作用机理

2.5.1菌株代谢产物的抑菌活性测定

利用硫酸铵分级沉淀法，在离心条件为4℃、12000rpm、30min的离心机中分批次高速 离心1L发酵液，弃沉淀后，向上清液分次缓慢放入相应量的硫酸铵至20％、30％、50％、70％、 80％溶液终浓度，搅拌至清澈，得到不同饱和浓度的上清液于4℃冰箱中静置沉淀24h。用50mL 的离心管分装后置于离心机中4℃、8000rpm离心40min，分别收集上清液及沉淀。上清液用 细菌过滤器除菌，得到硫酸铵处理上清液，沉淀待用，测定硫酸铵处理上清液活性(张妙宜等， 2017)。

在烧杯中将以上各级沉淀加入少量10mmol/L PBS缓冲液直至溶解，置入已加入相同浓度 PBS缓冲液的透析袋于4℃静置过夜，透析除盐后的溶液两等份，一份用过滤器除菌，得到发 酵液粗蛋白液，测定抑菌率，确定菌株粗蛋白的硫酸铵最适提取浓度；另一份采用真空冷冻干 燥仪脱水为干粉，加无菌水制成母液浓度为20mg/mL的粗蛋白溶液，将母液配制成1g/L、2 g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L和4g/L的稀释液并过滤，以粗蛋白最适饱和度进行不同粗蛋白 浓度的琼脂打孔抑菌圈试验，以无菌水为对照，重复3次，确定发酵液最适的粗蛋白抑菌浓度。

利用硫酸铵分级沉淀法对优化培养的QN₂MO-1发酵液进行各级饱和浓度粗提物的抑制番 茄枯萎病效果测定，以获得菌株粗提物的最适提取浓度。从图10可以看出，以PBS磷酸缓冲 液为对照(CK)，当CK番茄枯萎病菌饼长满整个培养皿时，各级硫酸铵饱和度的粗提物均表 现出一定的抑菌效果(图10A)，20％和30％饱和度的抑菌活性差异性并不显著，分别为48.43％ 和49.61％，将硫酸铵饱和度提至50％时，抑菌率达到56.08％的峰值，随之加大硫酸铵量则抑 菌率呈下降趋势，在70％饱和度时降至51.57％，在80％饱和度时降至45.49％(图10B)，由 此，确定了50％硫酸铵饱和度为QN₂MO-1菌株粗提物的最适提取浓度。对不同硫酸铵饱和度 的上清液进行抑菌活性测定，检测结果均为零，说明产生拮抗能力的活性物质基本为能被硫酸 铵沉淀的物质，即为蛋白类物质。

以50％的最适硫酸铵饱和度对QN₂MO-1粗提蛋白进行不同浓度的活性测定，结果见图11， QN₂MO-1粗提蛋白的浓度为1g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L和4g/L时，对番茄枯萎病 菌的抑菌率分别为48.04％、48.63％、51.76％、52.55％、58.43％、52.94％；随着粗蛋白浓度增 加，抑菌呈递增趋势，在最适浓度3.5g/L时抑菌率达到58.43％，随之出现拐点，在4g/L浓 度减少到52.94％(图11B)。

2.6番茄叶片离体实验

每个处理取6片采摘大小一致、外观舒展无损伤的番茄新成叶，轻轻洗净晾干，在无菌环 境中置于无菌培养皿内75％乙醇浸泡5min，再用无菌水清洗3次，重复以上表面消毒操作2 次。将叶片正面朝下放置在铺有无菌滤纸的培养皿中晾干叶片表面水份。采用“针刺法接种” 方式将5根捆绑固定并灭菌的0.5mm大小针头蘸取终浓度为1.0×10⁷cfu/mL的番茄枯萎病病 原菌悬液，刺在叶脉左右对称的相应位置，每片刺8处接种点。均匀摇晃提前制备的按发酵液 优化方案培养的目标菌液(1.0×10⁵cfu/mL)，吸取10μL滴加在各个接种点处，以等量体积的 不接菌的改良LB培养基(采用“2.3菌株拮抗能力单因素优化”的最优结果：氯化铵1g、蔗 糖0.5g、磷酸氢二钾1g，无菌水100mL，pH 6.5)为阳性对照、以无菌水为阴性对照，在滤 纸上滴加2mL无菌水确保微环境湿度，每皿1片叶片，每个处理重复3次，封口后于28℃恒 温箱暗培养。观察每天的离体叶片发病情况，待水对照组完全感病拍照(照片中需放置直尺)， 运用Image J(Version 1.38)软件测算叶片及病斑灰度面积(pix)，运用Excel 2007和方差分 析软件进行实验数据换算及分析(付行政，2011)。

计算“病斑占比率”公式：

结果见图12，QN₂MO-1发酵液可有效抑制番茄枯萎病在叶片中蔓延，病菌菌丝在叶片表 面被有效隔断，进入叶片内部的量甚微；而培养基组病原菌接种的叶片针刺部位明显枯萎变黄， 病原菌通过叶脉侵染整个叶片，仅剩叶缘及叶柄周边未发病；水处理则整片叶子发黄变褐，萎 蔫症状十分严重。测算结果表明：发酵液处理组的番茄叶片病斑面积为0.57cm²，仅为培养基 组的1/20左右，方差分析结果差异性显著，而水处理组的叶片病斑面积高达13.43cm²，基本 占据了整片番茄叶。三个处理的病斑占比分别为3.15％、64.59％、92.17％(图13)。由此可知， 经过优化培养的QN₂MO-1发酵液对番茄感病离体叶片的抑菌效果显著。

2.7番茄果实离体实验

每个处理摘取新鲜无损的番茄果实各3颗，用番茄枯萎病病原菌进行果实感病处理，分别 滴加等量的目标菌液(制备方法见“2.5番茄叶片离体实验”)、改良LB培养基(同“2.5番茄 叶片离体实验”)、无菌水，于28℃培养至果实出现病菌，果实样品取出在无菌环境打浆，用 无菌纱布过滤，以下称“滤液”。

(1)吸取10μL病原菌悬液于无菌载玻片上，用生物显微镜(40×)进行显微镜病菌孢子 数量统计，重复3次。

(2)吸取100μL滤液在PDA平板中均匀涂布培养，用全自动菌落计数器进行病菌菌情 况精细统计。

(3)将含最终标记浓度的抗生素溶液加入溶解至温度适宜的LB培养基中混匀到板，吸 取100μL待测液用无菌涂布棒均匀涂布，37℃培养7d，观察菌株是否生长，如在高浓度抗生 素平板上生长则说明该菌株在测试环境中可生长，置于全自动菌落计数器上计算菌株标记生长 个数，进行数据统计分析。

与离体叶片同等操作后，发现发酵液在番茄果实中有一定的效果(图14)，发酵液处理组 的果实表面并未发现菌丝，其他两组在蘸取番茄枯萎病菌悬液针刺的部位周边出现菌丝，而且 发生明显萎蔫，特别是水对照组。为对等量处理后的果实内病原孢子和QN₂MO-1标记菌株进 行定量检测，利用生物显微镜观察发酵液组的血球计数板上病原孢子数比培养基组少了 50.27％，并且仅是水对照组的36.33％。采用微生物稀释涂布平板法进行病原菌的培养验证， 在全自动菌落计数器上统计得出(表4)，水处理组的病原菌数量级为1.04E+05cfu/mL，而发 酵液组降至0.14E+05cfu/mL，培养基组则是0.18E+05cfu/mL。以同样的平板涂布法验证目 标菌株在接病果实内的标记情况，菌落计数器软件显示经接种发酵液的果实中QN₂MO-1细菌 数量级为5.20E+04cfu/mL，菌落平均直径为1.07mm，最小直径为0.15mm，最大直径为 5.03mm。由此可知，经过优化培养的QN₂MO-1发酵液对番茄感病离体果实的抑菌效果显著。

表4不同处理果实的病原菌变化

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上 描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本 发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在 本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌、或者诺尼内生暹罗芽胞杆菌发酵液或发酵上清液或粗提蛋白在拮抗番茄枯萎病菌、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或胶孢炭疽菌、和/或玉米弯孢霉叶斑病菌、和/或芒果叶疫病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或板栗疫病菌、和/或芒果拟盘多毛孢叶枯病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用，所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌命名为：Bacillus siamensis QN₂MO-1，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021305；所述的粗提蛋白为所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白。

2.一种诺尼内生暹罗芽胞杆菌、或者诺尼内生暹罗芽胞杆菌的发酵液或发酵上清液或粗提蛋白在制备防治番茄枯萎病、和/或香蕉枯萎病、和/或黄瓜枯萎病、和/或辣椒炭疽病、和/或草莓炭疽病、和/或荔枝炭疽病、和/或香蕉炭疽病、和/或菜心炭疽病、和/或胶孢炭疽病、和/或玉米弯孢霉叶斑病、和/或芒果叶疫病、和/或小麦赤霉病、和/或板栗疫病、和/或芒果拟盘多毛孢叶枯病、和/或水稻稻瘟病、和/或芒果炭疽病的生防制剂中的应用；所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌命名为：Bacillus siamensis QN₂MO-1，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021305；所述的粗提蛋白为所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白。

3.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诺尼内生暹罗芽胞杆菌的培养方法为，将诺尼内生暹罗芽胞杆菌Bacillus siamensis QN₂MO-1接种至培养基中进行培养，其中，所述培养基含有氮源0.2-2g/100ml，碳源0-2g/100ml，无机盐0.2-2g/100ml，pH为5.5-8.0，接种量为1%-11%，摇床转速为100-200rpm，培养时间为12-72h。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基含有氮源0.4-1.6g/100ml，碳源0或0.4-1.6g/100ml，无机盐0.4-1.6g/100ml，pH为5.8-7.6，接种量为4%-10%，摇床转速为120-180rpm，培养时间为18-54h；

所述氮源为胰蛋白胨、氯化铵、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸铵、天门冬酰胺、硝酸钾中的一种或多种；

所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖中的一种或多种；

所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化锰、磷酸三钙中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氮源为氯化铵、硝酸铵或硝酸钾中的一种或多种，所述碳源为蔗糖、麦芽糖或D-果糖中的一种或多种，所述无机盐为磷酸氢二钾和/或氯化钠，培养基pH为6-6.5，接种量为3%-5%，摇床转速为140rpm，培养时间为36-48h。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氮源为1 g/100mL的硝酸钾、碳源为0.6 g/100mL的 D-果糖、无机盐为0.4 g/100mL的氯化钠，培养基pH为6.4，接种量为4%，摇床转速为180rpm，培养时间为36 h，或者

所述氮源为1g/100mL的氯化铵、碳源为0.5g/100mL的蔗糖、无机盐为1g/100mL磷酸氢二钾，pH 6.5，接种量为5%，摇床转速为140rpm，培养时间为36h。

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