CN115261233B - 一株西红花茎腐病生防真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株西红花茎腐病生防真菌及其应用，属于植物病害生防技术领域。所述西红花内生真菌是从鸢尾科植物番红花健康球茎中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为产紫篮状菌ZCMU‑Z6(Talaromyces purpurogenus ZCMU‑Z6)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211369，保藏日期为2021年11月4日。本发明同时公开了所述真菌的用途：能有效抑制西红花球茎腐烂病病原菌的生长，平板对峙培养抑制率达48.4％；能够破坏病原真菌的形态结构；能够降低西红花球茎腐烂病病情指数。本发明的真菌对西红花球茎腐烂病防治效果明显，为西红花真菌类病害的生物防治领域提供广阔的应用前景。

Description

一株西红花茎腐病生防真菌及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生防技术领域，具体为一株西红花茎腐病生防真菌-产紫篮状菌ZCMU-Z6(Talaromyces purpurogenus ZCMU-Z6)菌株及其在防治西红花球茎腐烂病中的应用。

背景技术

西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效，长期坚持服用可提高人体免疫力，具有较高的药用价值；此外，西红花还可大量用于日用化工、食品、染料工业，是美容化妆品与香料制品的宝贵原料，球茎又可作为高档观赏花卉出售，具有较高的经济价值。目前，西红花从种植栽培到采收加工均为人工管理，随着种植面积不断扩大，西红花球茎腐烂病逐年加重，严重者烂球率可达60％以上，严重影响西红花药材的质量和产量，使其价格居高不下，难以满足市场需求。

植物内生真菌(Endophyte)是指生活在植物组织内，对植物组织不引起明显病害的一类真菌。广义而言，还包括腐生菌、对宿主无明显伤害的潜伏性病原真菌和菌根真菌。内生真菌与宿主植物间的关系非常复杂，有别于寄生、病原和腐生等关系，通常被认为是互利共生的关系；一方面，宿主为内生真菌提供生长需要的场所及养分；另一方面，内生真菌在宿主生长发育和系统演化过程中起重要作用。研究表明，内生真菌可增强植物对某些病原微生物的抗病能力，有望成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌。目前，西红花球茎腐烂病的生物防治菌株和产品匮乏，仅有少数几株芽孢杆菌、荧光假单胞菌、曲霉菌和木霉菌可开发用于防治西红花球茎腐烂病。此外，球茎腐烂病病原菌的寄主十分广泛，如三七、白术、黄芪、人参等，严重影响药用植物的产量和品质。

前期研究初步发现，球茎腐烂病是一种主要由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、炭疽菌(Anthracnose sp.)等真菌交叉侵染引起的真菌性病害。西红花生长早期球茎腐烂病主要由镰刀菌(F.oxysporum)浸染引起，而炭疽菌(Anthracnose sp.)等真菌在生长后期的交叉侵染会使病情加重。镰刀菌属的病原菌具有极其广泛的宿主范围，包括棉花、番茄、香蕉、草莓、马铃薯、辣椒、豆类、豌豆、鹰嘴豆和甜瓜，是作物生产系统中最常见的土传病原体。西红花球茎腐烂病为维管束系统性病害，病原菌侵染植物宿主后可降解植物细胞壁、改变细胞膜透性、抑制植物球茎与根的生长，阻碍宿主植物吸收水分，导致植物萎蔫死亡。病原菌主要以菌丝体、厚垣孢子的形式随寄主病残体在土壤中越冬，在土壤中能存活6～8年以上，这使得西红花球茎腐烂病防治十分困难。目前，西红花球茎腐烂病的防治多依赖于田间轮作和喷洒化学药剂等措施，存在浪费土地资源、农残超标、环境污染、致病菌抗药性等问题，且上述防治措施效果不佳。

因此，分离鉴定有效的生物防治菌株，并开发高效的防治方法，是西红花球茎腐烂病病害防治的发展方向和有效途径。

发明内容

本发明的目的是克服现有西红花球茎腐烂病病害防治技术的缺陷和不足，提供一种对西红花球茎腐烂病病害具有较好抑制作用的生防菌株，为生物农药的开发利用和化学合成杀菌剂的生产替代提供新的技术支持。

本发明的目的是提供一株新鉴定的产紫篮状菌ZCMU-Z6。

本发明的另一目的是提供所述产紫篮状菌ZCMU-Z6在防治西红花球茎腐烂病病害方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从健康西红花球茎中筛选鉴定出一株西红花茎腐病生防真菌，分类命名为产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)。保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211369，保藏日期为2021年11月4日。

西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6能抑制西红花球茎腐烂病病原菌尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、溜曲霉(A.tamarii)、黑曲霉(A.niger)的生长。在平板对峙实验中能形成明显的抑菌带，在温室盆栽实验中不影响西红花的生长，并能有效防止病原菌对植株的侵染。说明本发明的菌株ZCMU-Z6可被用于开发针对西红花球茎腐烂病的生物农药。

所述西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6通过平板对峙抑制西红花病原菌生长，抑制西红花病原菌的抑菌率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100％。

该菌株的鉴定与开发利用有利于减少化学药剂的使用，也为利用生物防治方法防治西红花球茎腐烂病提供生防菌株资源。

一种上述西红花内生菌在防治西红花球茎腐烂病中的应用，所述应用为：将西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6制备的孢子悬浮液通过灌根方式对西红花病株进行施用来提高西红花抗病性。

所述的灌根方式可以为温室盆栽实验。

所述的灌根方式可以为田间实验。

西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6的孢子悬浮液按照如下方法制备：(1)取西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6菌种，在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，25℃、65％湿度条件下暗培养5-7d；

(2)无菌条件下，用灭菌刮刀刮取菌丝，用无菌水冲洗菌丝并用纱布过滤，再用无菌水将滤液定容至25mL；

(3)无菌条件下，吸取100μl孢子悬浮液，用血球计数板调整孢子浓度为2.0～2.5×10⁶个孢子/mL即得。

西红花茎腐病生防真菌ZCMU-Z6的孢子悬浮液施用量为5mL/次/7d，持续30d，计算病情指数。

所述病情指数根据公式：病情指数＝[Σ(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最高级代表数值]×100％计算所得。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株产紫篮状菌ZCMU-Z6，对大多数球茎腐烂病病原菌具有广谱的、显著的抑制作用，能减轻西红花球茎腐烂病的发生。

本发明研究表明，产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株能够在PDA平板上抑制尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、溜曲霉(A.tamarii)、黑曲霉(A.niger)的生长，并能够破坏溜曲霉(A.tamarii)的形态结构，接种试验发现菌株ZCMU-Z6能高效抑制病原菌对西红花球茎的侵染，降低西红花球茎腐烂病的发病率。此外，菌株ZCMU-Z6本身无球茎致病性，可用于开发针对真菌病害的生物农药，为利用生物防治西红花球茎腐烂病提供新思路、新方法。

附图说明

图1：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)在PDA固体培养基上的菌落形态(A：正面B：反面)；

图2：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)在光学显微镜下的菌丝形态(A：100μm；B：20μm)；

图3：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)RPB2基因PCR扩增序列电泳检测结果图；

图4：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)系统进化树(NJ法)；

图5：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)对西红花球茎腐烂病病原菌的抑制作用(其中，抑制率*P<0.05，**P<0.01；溜曲霉(A.tamarii)，Z1；黑曲霉(A.niger)，Z2；尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，Z3；产紫篮状菌(T.purpurogenus)，Z6)；

图6：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)抑制西红花球茎腐烂病病原菌的效率(溜曲霉(A.tamarii)，Z1；黑曲霉(A.niger)，Z2；尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，Z3)；

图7：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)破坏病原菌溜曲霉(A.tamarii)的孢子及孢子梗扫描电镜观测结果图；其中，A、B分别为平板对峙培养正面、反面的照片；C-E为对峙培养交界处400×、1000×、2000×的电镜图；

图8：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)种球回接致病性检测结果图；

图9：制备的产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)活体孢子悬浮液实物图；

图10：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)孢子悬浮液有效缓解西红花球茎腐烂病症结果图；

图11：产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)孢子悬浮液有效缓解西红花球茎腐烂病情指数结果图(*P<0.05,**P<0.01)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法、设备。

本发明的内生真菌从浙江建德采集的西红花球茎样品中分离获得。

实施例1产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株的分离与筛选

1.样本采集及菌株培养：从浙江省建德市西红花产业基地取材，将球茎剥去种皮，流水冲洗20min洗去泥沙；在无菌条件下将球茎用75vol％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，每次1min；随后将球茎放于15wt％的次氯酸钠溶液中浸泡20min(期间不停摇晃，确保球茎充分接触次氯酸钠溶液)，浸泡完成后无菌水冲洗5次，每次5min，彻底洗去球茎表面的次氯酸钠完成消毒；将消毒好的球茎用无菌滤纸擦干，在垫有无菌滤纸的无菌培养皿上将球茎切成大小为1～2cm²，厚度为1～2mm的片状，置于PDA培养基，25℃恒温培养箱培养5～7d；之后采用梯度稀释划线纯化的方法，将不同表型的菌落分别进行梯度稀释划线纯化：取5个无菌1.5mL离心管，依次加入1000μL、900μL、900μL、900μL、900μL无菌水，用无菌枪头刮取PDA培养基上的适量菌落(约50mg)于第一个离心管中，充分摇匀后吸取100μL至第二个离心管中，摇匀后吸取100μL于第三个离心管中，依此分别将5个离心管稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 5个浓度梯度；取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个浓度梯度分别划线于PDA培养基，每个浓度重复划线3次；将PDA培养基放置于25℃恒温培养箱中，2～3d后挑取10^-4或10^-5浓度(选择一个单斑较为明显的平板即可)的PDA培养基上的单斑的边缘部分于新的PDA培养基上；将新挑取的PDA培养基放置于25℃恒温培养箱中，培养5～7d后进行第二轮纯化，直至挑取的单菌落生长速度一致，边界清晰，即可初步判定该真菌已纯化完全。将纯化好的的真菌保存于PDA斜面培养基上，4℃冰箱保存备用；同时用无菌水将平板上纯化完全的真菌孢子冲下来后，将孢子悬浮液(图9)保存至甘油管中，-80℃冰箱长期保存。

2.球茎腐烂病拮抗菌株筛选：西红花球茎腐烂病拮抗菌株筛选采用平板对峙培养的方法进行；将已纯化的真菌从斜面培养基上接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱培养7d；分别用无菌打孔器切取直径为5mm大小的菌饼备用；实验组将致病菌菌饼放于PDA平板培养基的左侧，在其右侧等距放上内生菌菌饼；不接种内生菌的PDA平板为对照组；每个处理重复3次，于25℃恒温培养箱中培养7d后测量菌落半径，计算内生菌对病原菌的抑制率。抑制率＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100％

筛选获得具有球茎腐烂病拮抗作用的菌株ZCMU-Z6，其平板对峙培养结果如图5-6所示，抑制效果如表1所示。结果表明，产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株能够在PDA平板上有效抑制溜曲霉(A.tamarii)、黑曲霉(A.niger)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的生长。

表1内生真菌菌株ZCMU-Z6与致病真菌的平板对峙抑菌效率

注：Z1-溜曲霉(A.tamarii)、Z2-黑曲霉(A.niger)、Z3-尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、ZCMU-Z6-产紫篮状菌(T.purpurogenus)

进一步利用扫描电镜对产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)与病原菌溜曲霉(A.tamarii)的对峙培养交界处进行观察，结果如图7所示，对峙区致病菌溜曲霉(A.tamarii)孢子梗出现干瘪扭曲的现象，孢子出现不同程度的破碎，而拮抗菌株Z6无显著变化，说明产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株能破坏病原菌溜曲霉(A.tamarii)菌丝、孢子梗及孢子，表明产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)能抑制病原真菌的生长，降低其侵染能力。

实施例2产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株的鉴定

1.形态鉴定

如图1-2所示，菌株ZCMU-Z6在PDA平板上，25℃培养，初期菌落中间呈淡黄色，外周一圈白色绒毛状，培养至7d形成直径为5.1～6.0cm的菌块，菌落正面为黄色毛毡状，菌落中间呈现墨绿色毛毡状，有颗粒感，背面为淡橘色。光学显微镜下观察该菌，可见典型帚状分枝，双轮生，菌丝有隔，分生孢子为球形或椭球形，呈链状。

2.分子鉴定

为了明确实施例1获得的真菌菌株ZCMU-Z6的分类，对菌株ZCMU-Z6的RPB2序列进行分析，用于真菌分子生物学鉴定。结果如图3所示，表明，ZCMU-Z6菌株RPB2序列长为1090bp，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，和产紫篮状菌(T.purpurogenus)JX965307.1相似度高达99.13％；说明该菌株属于产紫篮状菌这一大类，根据邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树如图4所示。

实施例3产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株种球回接验证

取健康球茎，使用实施例1中的方法对球茎进行表面消毒后用解剖刀在其表面制造5mm×5mm伤口，在培养5d的产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)PDA平板上打取直径5mm菌饼置于球茎表面伤口中，同时以PDA培养基做空白对照(CK)，溜曲霉(A.tamarii)做阳性对照(PC)，25℃培养7d，结果如图8所示，接种溜曲霉(A.tamarii)菌株的球茎7d后出现腐烂症状而接种产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株和空白对照组球茎均未出现腐烂症状，表明产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株不具有致病性。

实施例4产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株对西红花植株球茎腐烂病的防治效率测定

产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)菌株对西红花植株球茎腐烂病的防治效率测定通过温室盆栽实验进行验证：使用与实施例1中的方法对球茎进行表面消毒后围绕其表面人为制造1cm深的伤口，种植基质(营养土：珍珠岩：蛭石＝3:1:1)灭菌3次后，将处理后的球茎种植于其中，一组浇灌无菌水作为空白对照(CK)，一组浇灌溜曲霉(A.tamarii)孢子悬浮液为处理组1(T1)，一组浇灌溜曲霉(A.tamarii)与产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)等比例混合后的孢子悬浮液(孢子浓度均为2.0～2.5×10⁶个孢子/mL)为处理组2(T2)。孢子悬浮液施用量为5mL/次/7d，每组十棵，三次重复，持续施用30d后计算各组病情指数。

结果如图10-11所示，T2组发病率明显低于T1组且与CK组无显著差异，表明施用产紫篮状菌ZCMU-Z6(T.purpurogenus ZCMU-Z6)能显著降低植株球茎腐烂病病情指数。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种等同的变型或替换，这些等同的变型或替换菌包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一株西红花茎腐病生防真菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1090

<212> DNA

<213> Talaromyces purpurogenus ZCMU-Z6

<400> 1

ggttgtgatc ggggaatgga atgatactgg cgcagatacc tagaatcata cttggatgaa 60

tctcgcagtg agtccagata tgagccctct gactcaaaat agaacggaca cgcttgttcg 120

gatcactgtt gtcttcgggc aaagaataac cggcttggag ttgttttgaa atttcaagat 180

cttcaggaga catggcaatc atgatagttt cttcttcttc agcatcaaca tattcaatga 240

cacctgattt gacaagaccc tcccaaccgt agtattgttc cctacgttct tcggggtcga 300

ggtctggtgg aagctcgcga tctgcttcaa gtctgcgaat atgatctttg ttcagcacca 360

gggaaccgca gttttcgctt cgtgggtcgt tgtcgataac gaagagtggt cgacagacac 420

gaccagcatc agtgaagatc ttgaattccc ggtcacgaat gtcacgaacc agactaactt 480

cgtgcgaaat catgttccgt cgacgtagtg attggacagt gctgaccaag tgggcagggt 540

cacgatgaat accgacccaa acaccattga caaagacctt ggtggcatga ggtgtaacta 600

gtggttcgaa ttcctcgagc acttccatgt ttcgttggat catgaaatca acaatcggct 660

cgctaggtga acctacggtg atggaacaca tcaaagccag gttcttgact agaccacaag 720

cttgaccctc gggagtctcg gcaggacaaa ccagacccca gtgagtgttg tgtagctgac 780

gaggcttagc gatctttcca tcacgaccaa tcggagtatt ggtacgtctc aaatgagaca 840

aagtagagga aaaggtatat cgactgagaa cctgagagac acctgctttg gagctcattg 900

ccttcttctg ttcaccccag tttccggtag cgagagcata tttcaaacca cctgtcagag 960

tggctggctt gagacccacg ttgaggacca cctcacgatt tgtttcaacg catctctgga 1020

cataacgagt aagatctctt gtaacacggg tgaaaagagt tcggaaaagc gtagcaagta 1080

gtgaccagcc 1090

Claims (8)

1.一株西红花茎腐病生防真菌，其特征在于，分离于鸢尾科植物番红花健康球茎，于2021年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211369，其分类命名为产紫篮状菌(Talaromyces purpurogenus) ZCMU-Z6。

2.一种权利要求1所述的西红花茎腐病生防真菌在抑制西红花球茎腐烂病病原菌生长和/或破坏西红花球茎腐烂病病原菌结构中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述西红花球茎腐烂病的病原菌包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、黑曲霉(Aspergillus niger)。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述西红花茎腐病生防真菌通过平板对峙培养抑制球茎腐烂病病原菌的生长，抑制率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100％。

5.一种权利要求1所述的西红花茎腐病生防真菌在防治西红花球茎腐烂病中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：

将西红花茎腐病生防真菌制备的孢子悬浮液通过灌根的方式对西红花植株进行施用来提高西红花抗病性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，西红花茎腐病生防真菌的孢子悬浮液是按照以下步骤制备：

(1)取西红花茎腐病生防真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，25℃、65％湿度条件下暗培养5-7d；

(2)无菌条件下，刮取菌丝，用无菌水冲洗菌丝并用纱布过滤，再用无菌水将滤液定容至25mL；

(3)无菌条件下，吸取100μL孢子悬浮液，调整孢子浓度为2.0～2.5×10⁶个孢子/mL即得。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述孢子悬浮液施用量为5mL/次/7d，持续30d。