CN114933980B

CN114933980B - 一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌hjb-xtbg45及其应用

Info

Publication number: CN114933980B
Application number: CN202210158089.9A
Authority: CN
Inventors: 刘贵周; 庞志强; 徐鹏; 毛新雨
Original assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Current assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2024-02-20
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: CN114933980A

Abstract

本发明公开了一株生防浅紫链霉菌（Streptomyces violascens）HJB‑XTBG45及其应用。所述浅紫链霉菌HJB‑XTBG45保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24370；其应用为作为生防剂在防治黄精根腐病中的应用。本发明菌株HJB‑XTBG45对黄精根腐病的防治具有高效性（对黄精根腐病菌尖孢镰刀菌和炭疽菌抑菌圈直径分别为22.3 mm和18.9 mm。浅紫链霉菌HJB‑XTBG的发酵液在最低1×10⁵CFU/mL浓度下对根腐病菌引起的黄精根腐病的抑制效果达100%），在防治黄精等根茎类植物或作物上由尖孢镰刀菌和炭疽病原菌引起的植物根腐病的生物菌剂开发具有较高的应用价值。

Description

一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌HJB-XTBG45及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌HJB-XTBG45及其应用。

背景技术

根茎类植物如黄精在生产中常有根腐病的发生，对生产及经济收益造成严重影响。根腐病是一种由真菌引起综合病害，会造成根部腐烂，植物在水分和养分吸收等方面的功能逐渐减弱，最后全株死亡，地上部分主要表现为整株叶片发黄、枯萎，最终可导致根茎减产42%以上，甚至绝收。多花黄精根腐病主要是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和炭疽菌（Colletotrichum spaethianu）引起的植物病害，在整个生育期内均有发生。目前还没有关于黄精根腐病有效防治的手段。

中药材黄精是包括黄精属滇黄精、多花黄精以及黄精三种基源植物的根茎，在生产实践中主要以根茎繁殖为主，随着黄精种植面积的不断扩大，黄精多种病害发生也呈现上升趋势，尤其是根腐病的发生极为严重，该病又称根茎腐病等，是由真菌侵染引起的一种综合病害，病菌可随土壤或根茎种植体的蔓延逐渐危害黄精的生长，已成为限制黄精产业健康发展的主要因素之一。目前在生产中所用的根腐病防治主要以化学制剂防治为主，但得不到有效的防治，并且化学制剂防治方法容易造成土壤环境的污染和降低黄精产品的质量。生物防治已被证实具有显著的防治效果，并在生产上逐步得到应用。

生防菌具有针对性强、防治效果彻底、不会污染土壤环境、也不会对产品品质产生不良影响等优势。当前，利用环境有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力已成为病害防治研究的热点，尤其这些有益微生物对环境无污染，能克服化学药剂防治带来的缺陷，在农业生产中兼顾经济效益和生态效益的协同发展，符合保护生态环境和维护人类健康安全的发展趋势，在黄精等根茎类植物或作物及相关产业可持续发展中具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株生防浅紫链霉菌（Streptomyces violascens ）XTBG45，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的第二目的是提供所述浅紫链霉菌XTBG45在防治黄精根腐病中的应用，其中，引起植物根腐病的真菌为炭疽菌、尖孢镰刀菌或腐皮镰刀菌。

本发明的第三目的是提供一种浅紫链霉菌生防制剂，所述生防制剂的有效成分为所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45及其发酵产物或浅紫链霉菌HJB-XTBG45的发酵菌液。

本发明的第四目的是提供一种所述浅紫链霉菌菌株HJB-XTBG45的发酵培养基，以1 L计，所述发酵培养基含酵母浸粉3-5 g，胰酪蛋白胨5-7 g，pH为7.0-7.2。

本发明的有益效果为：

本发明菌株HJB-XTBG45对黄精根腐病的防治具有高效性（对黄精根腐病菌尖孢镰刀菌和炭疽菌抑菌圈直径分别为22.3 mm和18.9 mm。温室盆栽防效实验表明其对根腐病菌引起的黄精根茎腐病的抑制效果达100%），在防治黄精等根茎类植物或作物上由尖孢镰刀菌和炭疽病原菌引起的植物根腐病的生物菌剂开发具有较高的应用价值。

附图说明

图1中A、B、C分别为浅紫链霉菌HJB-XTBG45对尖孢镰刀菌、炭疽菌和腐皮镰刀菌的抑制效果图；

图2为浅紫链霉菌HJB-XTBG45对尖孢镰刀菌、炭疽菌的多花黄精幼苗的温室盆栽防效实验不同处理的植株生长情况对比图；

图3为为浅紫链霉菌HJB-XTBG45对尖孢镰刀菌、炭疽菌的多花黄精幼苗的温室盆栽防效实验不同处理的多花黄精幼苗及根（根茎）部情况对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明提供了一株生防浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)HJB-XTBG45，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24370，保藏时间为2022年1月24日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45对黄精根腐病菌尖孢镰刀菌和炭疽菌抑菌圈直径分别为22.3mm和18.9mm；浅紫链霉菌HJB-XTBG的发酵液在最低1×10⁵CFU/mL浓度下对根腐病菌引起的黄精根腐病的抑制效果达100%。

本发明还提供了所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45在防治植物根腐病中的应用。

引起植物根腐病的真菌为炭疽菌、尖孢镰刀菌或腐皮镰刀菌。

本发明进一步提供了一种浅紫链霉菌生防制剂，所述生防制剂的有效成分为所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45及其发酵产物或浅紫链霉菌XTBG45的发酵菌液。

所述生防制剂的使用方法如下：在黄精种苗或根茎移栽后，所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45的发酵菌液在菌液稀释100倍后对植物进行浇灌处理或叶面喷施处理。

本发明更进一步提供了一种所述浅紫链霉菌菌株XTBG45发酵的发酵培养基，以1L计，所述发酵培养基含酵母浸粉3-5 g，胰酪蛋白胨5-7 g，pH为7.0-7.2。

浅紫链霉菌菌株HJB-XTBG45发酵培养的温度为28-30℃，震荡速度为180-200转/分钟，培养时间为30-40 h。

实施例1 菌株HJB-XTBG45的分离纯化与筛选

1、菌株HJB-XTBG45的分离与纯化

从贵州省六盘水市黄精种植基地的田间（该地块有植株发生黄精根腐病）选取生长良好的两年生健康植株根茎，低温避光保存带回实验室处理。用自来水将根茎周围土壤冲洗干净后依次用2%次氯酸10 min、75%乙醇5 min、95%乙醇30 s灭菌，后用无菌水冲洗3次并用无菌滤纸吸干备用。在无菌操作台中称取5 g根茎置于50 mL的无菌离心管中，加入PBS缓冲液至50 mL置于28℃恒温摇床上150转振荡20 min。后吸取100 μL原液稀释至10^-2-10^-5倍悬浮液备用，后各吸取100 μL加入TSA（胰蛋白胨大豆琼脂培养基）和ISP2号（链霉菌培养基2号）固体培养基，用涂布棒涂板后密封置于恒温培养箱28℃过夜培养。后挑取菌落五步划线法培养挑取单菌落，挑取单菌落后置于LB液体培养基扩繁备用。

2、菌株HJB-XTBG45的筛选

1、菌株生防功能初筛

采用平板对峙实验进行菌株生防功能初筛，具体步骤如下：在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基中预先接种多花黄精病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和炭疽菌（Colletotrichum spaethianu）以及广谱病原菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）（在培养基中心用打孔器打下5 mm左右的真菌菌块进行接种），将分离纯化得到的不同细菌点接到菌丝四周12 mm位置，四个菌株呈十字形。以不接种细菌菌株的平板作为对照，25℃培养3-5天，当空白平板长满时观察接种细菌菌株的平板，记录并选取具有抑菌圈的细菌进一步备用。

2、菌株生防功能复筛

筛选方法同上，但每个平板接种真菌后两侧接种同一个菌株，对照不接菌且长满平板后记录菌株的抑菌圈（如图1）。

结果：经过两次平板筛选，通过第二步平板筛选后得到对三个病原菌均具有抑制效果的潜在生防菌菌株HJB-XTBG45，如图1所示，经平板对峙实验确定，菌株HJB-XTBG45对黄精根腐病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽菌（Colletotrichum spaethianu）和广谱病原菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）具有良好的抑制效果，抑菌圈直径分别为分别为22.3 mm，18.9 mm和14.5 mm，因此选其为筛选的目标菌株。

实施例2菌株HJB-XTBG45的鉴定

1、将菌株HJB-XTBG45挑单菌落加入LB液体培养基过夜培养后沉淀离心，对菌体进行基因组DNA提取，使用TransGen Biotech公司的EasyPure® Bacteria Genomic DNA Kit（含RNase A)提取试剂盒按说明书中方法提取样品DNA。

2、提取菌体基因组DNA后用北京擎科生物科技有限公司的PCR扩增试剂盒对该菌的16s rRNA基因片段进行扩增，体系为25 μL，各部分如下：提取的DNA模板3 μL，正向引物和反向引物各1 μL （浓度10 P），含有dNTP等的Mix 20 μL，引物序列为27F（5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和1492R（5'-ACGGATACCTTGTTACGACT-3'），由北京擎科生物科技有限公司合成，具体操作步骤参考该试剂盒说明书。

3、用电泳仪检测菌PCR产物，用北京全式金生物有限公司的DNA胶回收试剂盒切胶回收条带，回收的DNA样品送至北京擎科生物科技有限公司测序确定16s rRNA序列。

4、将测序产生的DNA序列通过于公共数据库NCBI的细菌16s rRNA进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)比对，通过同源性检测，最后确定菌株HJB-XTBG45为浅紫链霉菌Streptomyces violascens。

实施例3

浅紫链霉菌生防制剂的制备，将浅紫链霉菌菌株HJB-XTBG45在固体ISP1培养基（胰酪蛋白胨：5.0 g/L，酵母浸粉：3.0 g/L，琼脂：15g/L，pH 7.0±0.2，121℃高温灭菌15分钟）中平板划线培养至单菌落，培养条件为：恒温培养箱28℃、14 h，长出单菌落后挑取转接入含有6 mL ISP1液体培养基的试管中，放置于恒温摇床中28℃、200转/分钟培养36 h，制得生防制剂。经测定，该生防制剂的活菌数为1×10⁷CFU/mL（OD₆₀₀=1）。

实施例4

浅紫链霉菌生防制剂的制备，将浅紫链霉菌菌株XTBG45在固体培养基ISP2（ISP2固体培养基配方：酵母浸粉：3.0 g/L，麦芽浸粉：9.0 g/L，琼脂：15g/L，葡萄糖：5.0 g/L，pH7.5，121℃高温灭菌15分钟。）中平板划线培养至单菌落，培养条件为：恒温培养箱14 h，长出单菌落后挑取转接入含有6 mL ISP2液体培养基（不加琼脂）的试管中，放置于恒温摇床中28℃、200转/分钟培养36 h，制得生防制剂。经测定，该生防制剂的活菌数为1×10⁷CFU/mL（OD₆₀₀=1）。

实施例5浅紫链霉菌生防制剂对多花黄精病原菌的温室盆栽防效实验

一、试验方法：

1、试验设计空白组、对照组1-2和处理组1-2。预先选取长势一致的一年生多花黄精幼苗，使用灭菌剪刀剪去幼苗根末端1 cm，每株剪5条根，并用灭菌针头刺伤根茎，每个根茎刺伤5个创口，后将其移至已灭菌的营养盆中（内为营养基质），每个营养盆5个幼苗，设3个重复（每个营养盆为一个生物学重复）共计15株，移栽完成后采用灌根法浇灌植株。空白组每棵植株浇灌15 mL无菌水；对照组1和对照组2按照每颗植株浇灌15 mL的量分别浇灌尖孢镰刀菌菌悬液和炭疽菌菌悬液，菌悬液中真菌孢子浓度为5×10⁶个/mL。处理组1和处理组2按照每颗植株浇灌15 mL的量分别施加添加有实施例3制备的生防制剂的尖孢镰刀菌菌悬液和炭疽菌菌悬液，其中，菌悬液中真菌孢子浓度为5×10⁶个/mL，生防制剂的浓度为1×10⁵ CFU/mL。

2、浇灌完成后置于控温控湿温室，温度20℃，湿度70%，隔天观察植株生长情况。

3、待生长至14天对照组发病后统计发病情况。

发病率（%）=发病植株/总株数×100%，

注：植株萎蔫、发黄、地表根茎处腐烂则视为完全发病。

二、结果分析：

由图2、图3可知，对照组1和2的多花黄精幼苗（各15株，图2、3展示了其中3株）全部萎蔫、发黄，另从图3可知，接种病原菌的对照组1和2的幼苗的根茎部也全部腐烂，植株死亡，产生与田间类似的病理表型。而处理组1和2（接种HJB-XTBG45）的幼苗均无发病症状，且根茎部生长正常无腐烂症状，证明室内接种病原菌能够使得多花黄精发病致死，但接种潜在生防菌HJB-XTBG45能够有效防止植株发病死亡。具体发病统计如下：

表1生防菌HJB-XTBG45对多花黄精幼苗根腐病发病的抑制情况

由表1可知，对照组中由尖孢镰刀菌及炭疽病病原菌致使多花黄精15株幼苗全部萎蔫、黄化死亡，根腐病发病率达100%，而接种HJB-XTBG45的处理组15株幼苗均未发病，正常生长，接种处理组的多花黄精幼苗发病率为0%。

综上可知，本发明的生防菌株HJB-XTBG45可以有效防止黄精根腐病的发生，特别是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽菌（Colletotrichum spaethianu）引起的黄精根腐病，有效的最小生防制剂浓度为1×10⁵CFU/mL。此外，该菌株对广谱病原菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）也有平板抑制效果。因此本发明的生防菌株HJB-XTBG45可以用于黄精幼苗及根茎繁殖种植过程过的生物防治。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西双版纳热带植物园

<120> 一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌HJB-XTBG45及其应用

<130> 20220106

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 850

<212> DNA

<213> Streptomyces acidiscabies

<400> 1

gtcgaacgat gaagcccttc ggggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca 60

atctgccctt cactctggga caagccctgg aaacggggtc taataccgga taacacttcc 120

tgccgcatgg tggggggtta aaagctccgg cggtgaagga tgagcccgcg gcctatcagc 180

ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggcgacc 240

ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 300

gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg 360

taaacctctt tcagcaggga agaagcgaga gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct 420

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg 480

cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcacgt cggatgtgaa agcccggggc ttaaccccgg 540

gtctgcattc gatacgggct agctagagtg tggtagggga gatcggaatt cctggtgtag 600

cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcggatct ctgggccatt 660

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 720

gccgtaaacg ttgggaacta ggtgttggcg acattccacg tcgtcggtgc cgcagctaac 780

gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg 840

gggcccgcac 850

Claims

1.一株生防浅紫链霉菌（Streptomyces violascens ）HJB-XTBG45，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24370。

2.权利要求1所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45在防治黄精根腐病中的应用，其特征在于，引起黄精根腐病的真菌为炭疽菌、尖孢镰刀菌或腐皮镰刀菌。

3.一种浅紫链霉菌生防制剂，其特征在于，所述生防制剂的有效成分为权利要求1所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45或浅紫链霉菌HJB-XTBG45的发酵菌液。

4.权利要求3所述的浅紫链霉菌生防制剂的使用方法，其特征在于，在黄精种苗或根茎移栽后，所述浅紫链霉菌HJB-XTBG45的发酵菌液在菌液稀释100倍后对植物进行浇灌处理或叶面喷施处理。