CN110066755B - 一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用 - Google Patents

一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用，该菌株的分类命名为Streptomyces sp.WY228，属于链霉菌属，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60274，该微生物菌剂包括作为有效成分的上述牛蒡内生链霉菌WY228；所述牛蒡内生链霉菌WY228和微生物菌剂可用于促进牛蒡、番茄幼苗生长中。本发明提供的牛蒡内生链霉菌Streptomyces sp.WY228具有固氮潜在性，且具有多种促生长特征，其菌剂对牛蒡、番茄幼苗具有较好的促生能力，在农作物幼苗种植上具有较好应用潜力。

Description

一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用
技术领域
本发明属于内生菌技术领域，涉及一株牛蒡内生细菌，具体涉及一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用。
背景技术
药食植物牛蒡(Arctium lappa L.)，为两年生草本植物，又名大力子，属于桔梗目、菊科、牛蒡属植物，牛蒡子是中药药方中一味重要的药材，而牛蒡根是中国人餐桌上的一味常见佳肴。牛蒡的根、茎、叶、种子中均含有大量的木脂素、挥发油、多酚等化学成分，这些物质具有降血压、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等重要的药理活性和生理活性。牛蒡特有的牛蒡苷元、牛蒡寡糖以及多酚类物质，如咖啡酸、绿原酸、异绿原酸等具有抗癌抗突变作用。牛蒡根含有的多炔类物质具有抗真菌活性，牛蒡根和叶的提取物发现具有可修复镉诱导的受损肾细胞功能，而从牛蒡根中分离得到的牛蒡寡糖作用于小鼠后，影响小鼠的体液免疫和巨噬细胞吞噬功能，具有防止肿瘤发生的功效。牛蒡因具有良好的药用食用价值，具有极高的推广食用价值以及研究价值，市场需求逐年增加。
目前牛蒡种植时，其培苗阶段多为春季，育苗的成活率有待提高。而在后期牛蒡种植过程中仍存在肥料尤其是氮肥需求量大的问题，尤其以肉质根生长期对营养元素的吸收量最大，目前种植中主要采用施用化学肥料的方法。但是长期施化学氮肥会导致土壤酸化以及大量的氮损失，容易造成土壤板结，改变土壤中正常细菌和真菌群落的结构、造成土传病害的发生，对土地环境造成危害，以及引起连作障碍等，从而限制了牛蒡的规模化种植与产量。因此，目前牛蒡种植过程中亟需无污染的高效生物肥料的应用。
植物内生菌广泛定殖于健康植物的体内，具有高度的生物多样性。研究表明，植物内生菌具有促进植物生长、提高植物抗病，以及提高植物抵抗生物与非生物胁迫的能力。植物内生菌已经在植物育种、植物生长与保护等农林业领域展现出巨大的应用潜力。目前，有关从牛蒡中获得其内生细菌资源，并应用于牛蒡幼苗生长促进的报道较为少见。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株具有促进植物生长能力的牛蒡内生链霉菌。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一株牛蒡内生链霉菌，其分类命名为Streptomyces sp.WY228，其是从牛蒡植株的肉质根中分离得到的内生细菌，经形态学和16S rRNA基因测序与系统发育分析，该菌属于链霉菌属(Streptomyces)。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2017年11月8日，保藏编号为GDMCC 60274。
所述的牛蒡内生链霉菌(Streptomyces)WY228的16S rRNA碱基序列长度为1491bp，如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之二是提供一种含有上述牛蒡内生细菌的微生物菌剂。
为实现上述目的，本发明提供一种微生物菌剂，包括作为有效成分的牛蒡内生细菌链霉菌(Streptomyces)WY228，活菌数大于等于1.0×108cfu/mL。
本发明还提供上述微生物菌剂的制备方法，具体步骤为：
(1)菌株活化：将分离的牛蒡内生链霉菌Streptomyces sp.WY228菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基的斜面上，30℃培养1-3天，从而活化菌株；
(2)种子液培养：从活化后的ISP 2固体培养基斜面上接种环挑取少许菌体接入到ISP 2液体培养基中，于28℃，150-180rpm转速在摇床上震荡培养2-3天，获得内生细菌WY228的种子液；
(3)菌剂制备：将培养到对数期的WY228种子培养液以3％-5％的接种量接入到ISP2液体发酵培养基中，充分搅拌混匀后在28℃培养4-5天，10000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×108cfu/mL的菌剂。
本发明的目的之三是提供上述微生物菌剂在促进植物幼苗生长中的应用。
本发明提供上述微生物菌剂在促进牛蒡、番茄幼苗生长中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供的牛蒡内生链霉菌Streptomyces sp.WY228能够在无氮培养基上生长，具有固氮潜在性，并产生铁载体、吲哚乙酸(IAA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶等众多促进植物生长的潜在特征，并具有产生纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶、淀粉酶和木聚糖酶活性。
2.通过液体发酵制备获得含有该链霉菌菌体浓度≥1.0×108cfu/mL的液体菌剂，通过灌根方式接种于牛蒡植物幼苗，能够显著促进宿主植物生长，能够显著增加大田土栽培的牛蒡苗的叶面积、根长和根重，促进牛蒡中总多酚、总木脂素和可溶性多糖的含量提高，提升牛蒡的品质，同时促进根际土壤中酶活力的提升，改善土壤肥力。此外，该菌株具有广谱促生能力，其菌剂对番茄幼苗也具有较好的促生能力，在农作物幼苗种植上具有较好应用潜力。
3、本发明提供的含有牛蒡内生链霉菌的菌剂可以在牛蒡育苗期得到应用，不但能起到促生长、提高牛蒡品质作用，还具有改善根际土壤活力的效果，从而减少化学肥料的使用，是一种化肥减施增效的新技术，具有较好的应用前景，效果显著、绿色无污染、使用简单、易于推广。
附图说明
图1是在ISP 2平板上培养14天的牛蒡内生链霉菌WY228菌落形态图；
图2是在ISP 2平板上培养14天的牛蒡内生链霉菌WY228菌落的扫描电镜照片；
图3是基于16S rRNA基因构建的菌株WY228的系统发育树；
图4是大田土盆栽条件下回接菌株WY228对宿主牛蒡生长的影响；
图5是大田土盆栽条件下回接菌株WY228对宿主牛蒡生长的表型数据比较(A.高度；B.鲜重；C.根横切直径；D.须根数)；
图6是大田土盆栽条件下回接菌株WY228对宿主牛蒡相关化学成分含量的影响(A.总木脂素；B.总多酚；C.可溶性糖)；
图7是大田土盆栽条件下回接菌株WY228对宿主牛蒡根际土壤酶活的影响(A.过氧化氢酶；B.蔗糖酶；C.脲酶)；
图8是菌株WY228菌悬液灌根回接对番茄幼苗生长的影响；
图9是菌株WY228菌悬液灌根回接对番茄幼苗生长影响的表型数据比较(A.地上部分鲜重；B.地下部分鲜重；C.地上部分干重；D.地下部分干重；E.高度；F.须根数)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1菌株WY228的分离、鉴定
1.1菌株WY228的分离
选择江苏省徐州市沛县河口镇地区田间健康生长且长势良好的牛蒡植株，将肉质根从土中挖出，抖去表面浮土后，根装入自封袋中密封，带回实验室进行菌株分离。用流水冲洗干净植物根样品表面，将植物样品剪成合适大小后用无菌的0.01％Tween20浸泡1min，再用有效氯含量5％的NaClO浸泡样品根3min，再用无菌的2.5％Na2S2O3处理10min，无菌水清洗5次，用75％的乙醇浸泡样品，处理时间2min，最后用无菌水清洗3-5次。吸取牛蒡根表面消毒最后一步清洗的无菌水，将其均匀涂布在培养基上，于28℃培养箱中培养1周，观察培养基上是否有菌落长出，若无说明表面消毒彻底。用无菌的粉碎机将表面消毒的植物样品粉碎，灭菌的镊子将粉碎的样品均匀撒在分离培养基上(海藻糖4.0g；精氨酸1.0g；KNO30.5g；Na2HPO4 0.3g；MgSO4 0.2g；CaCl2 0.5g；琼脂20.0g；水1000mL；pH 7.2)，于28℃培养箱中培养14天。长出的菌株WY228的菌落及时纯化，并用ISP 2固体斜面4℃保藏。
1.2菌株鉴定
(1)培养特征观察：菌株WY228形态特征(基内菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子等)等观察采用埋片法。在ISP 2固体培养基上接种纯化后的WY228菌株，采用四区划线，于28℃下生长7-14d，观察菌株生长情况及菌落形态。
(2)显微形态特征观察：在ISP 2固体培养基上，挖出1cm×3cm左右大小的长方形凹槽，在凹槽周围用竹签涂抹接菌WY228，用镊子将无菌盖玻片平放在培养基的凹槽上，28℃培养14d后，用镊子取出盖玻片，滴加戊二醛在盖玻片上有菌丝的位置，自然晾干。在光学显微镜下观察玻片上有印痕的一面，观察菌丝形态并拍照。
(3)生理生化特征：采用《链霉菌鉴定手册》中的标准实验方法进行实验。
(4)菌株WY228的16S rRNA基因测序与系统发育分析：从ISP 2固体平板上刮取菌体微波法提取菌体基因组DNA，用细菌通用引物27f5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ IDNO.2)和1492r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(SEQ ID NO.3)进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA 2μL，10×buffer 5μL，MgCl2(25mmol)3μL，dNTP(10mmol/L)1μL，27f(10μmol/L)1μL，1492r(10μmol/L)1μL，Taq酶(5u/μL)0.5μL，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工(上海)有限公司测序。测序结果在NCBI上比对初步鉴定具体的属，然后在EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种进行进化树的构建，用Mega6.0软件进行序列比对及分析，最后用最大似然法(Maximum likelihood,ML)构建系统进化树并进行系统发育分析。
菌株WY228在各种固体培养基平板上生长良好，菌落干燥、具有气生菌丝和基内菌丝的分化，气生菌丝繁茂发达，气生菌丝丰富多为黄白色，基内菌丝多为白色，未发现有可溶性色素产生(图1、表1)，具备链霉菌属的典型特征。扫描电镜下可清晰地观察到气生菌丝和基内菌丝，菌丝发达，孢子表面光滑，孢子链弯曲状，具有典型链霉菌属的特征(图2)。菌株WY228最适宜生长的温度为28℃，菌株温度的耐受范围为20℃-37℃。盐的耐受范围为0％-3％，最适宜盐浓度为2％。pH的耐受范围为pH 6.0-8.0，最适宜pH为7.0。菌株WY228可利用多种碳氮源，在果糖、乳糖、木糖、木聚糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖等作为唯一碳源条件下都能生长良好。在天冬酰胺、丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、白氨酸、组氨酸、精氨酸、尿嘧啶、次黄嘌呤等作为唯一氮源条件下仍能生长良好，但在半胱氨酸、谷氨酸为唯一氮源情况下不能生长。
经测序，菌株WY228的16S rRNA碱基序列长度为1491bp，如SEQ ID NO.1所示。16SrRNA基因序列比对发现该菌株属于链霉菌属(Streptomyces)的成员，EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种，构建系统发育树，发现该菌株与多个链霉菌属的有效发表种聚在一个进化分支上(图3)，16S rRNA基因相似性均高于99.5％，因此菌株WY228为链霉菌属的成员，鉴定为Streptomycessp.WY228。
表1.牛蒡内生链霉菌WY228在不同固体培养基上的培养特征
Figure BDA0002065321850000051
Figure BDA0002065321850000061
实施例2菌株WY228促生长潜在特征检测
产铁载体活性检测：将菌株WY228点接于CAS检测培养基上，28℃环境下培养5-7天后，观察菌落周围是否有黄色透明圈，若呈现，则证明该菌株具有产铁载体活性，即呈阳性。定性检测发现菌株WY228能够产生铁载体。
产植物生长激素吲哚乙酸(IAA)检测：配制2.5mg/mL色氨酸溶液，在超净工作台中用0.22μm滤膜过滤除菌。配制液体有氮培养基并进行试管分装，115℃、30min高压灭菌。向已灭过菌的有氮培养基中分别加入1mL色氨酸溶液，使色氨酸浓度为0.5mg/mL，接入待测菌株后放于28℃摇床中培养7天。培养后分别吸取菌液1mL与Salkowski’s显色剂2mL混匀，进行暗反应20min，若试管中溶液呈粉红色则证明该菌株具有产IAA活性。定性检测发现菌株WY228产IAA。
产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC)活性定性检测：挑取少量的待测菌体用点植法接种到ADF固体培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养7天，观察菌株是否生长，并将能生长菌株转接，若转接三次后还能在以ACC为唯一碳源的培养基生长说明该菌株具有ACC脱氨酶潜在活性，反之，则无活性。定性检测发现菌株WY228产生ACC脱氨酶。
纤维素酶活性检测：挑取少量菌株WY228新鲜菌体，将菌株接种于纤维素筛选培养基28℃培养7天，用0.5％刚果红溶液染色10min，然后用1moL/LNaCl溶液冲洗，根据菌落周围是否有黄色透明圈的形成判断是否产纤维素酶。定性检测发现菌株WY228产纤维素酶。
蛋白酶活性检测：挑取少量的WY228菌体用点植法接种到淀粉酶检测培养基上，28℃培养7天，观察菌株生长情况，当菌落生长良好时，将碘液滴加到平板上，若菌落周围出现透明圈则为阳性，反之则为阴性。定性检测发现菌株WY228产蛋白酶。
几丁质酶活性检测：挑取少量WY228新鲜菌体，将菌株轻轻接种于含有几丁质为唯一碳源的固体检测培养基28℃培养7天，根据菌落周围是否有透明圈的形成判断几丁质酶活性强弱。定性检测发现菌株WY228产几丁质酶。
淀粉酶活性检测：挑取少量WY228新鲜菌体，将菌株轻轻接种于淀粉培养基28℃培养7天，用碘液染色。根据菌落周围是否有透明圈的形成判断淀粉酶活性。定性检测发现菌株WY228产淀粉酶。
木聚糖酶活性检测：挑取少量WY228新鲜菌体，将菌株轻轻接种于含有木聚糖为唯一碳源的固体检测培养基28℃培养7天，根据菌落周围是否有透明圈判断木聚糖酶活性。定性检测发现菌株WY228产木聚糖酶。
实施例3含有菌株WY228的牛蒡专用微生物菌剂的制备方法
(1)菌株活化：将分离的牛蒡内生链霉菌Streptomyces sp.WY228菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，4g葡萄糖，20g琼脂，1000mL水，pH 7.2)的斜面上，28℃培养5-7天，从而活化菌株。
(2)种子液培养：从活化后的ISP 2固体培养基斜面上竹签挑取少许菌体接入到ISP 2液体培养基中，于28℃，150-180rpm转速在摇床上震荡培养2-3天(对数期)，获得种子液。
(3)菌剂制备：将培养到对数期的种子培养液以3％-5％的接种量接入到ISP 2液体发酵培养基(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，4g葡萄糖，pH 7.2，1000ml水)中，充分搅拌混匀后在28℃培养4-5天，10000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×108cfu/mL的菌剂，用于接种农作物幼苗实验。
实施例4菌株WY228菌剂的应用试验
4.1在田间土壤栽培牛蒡幼苗生长上的应用：
对牛蒡种子进行表面消毒，首先用有效氯含量为5％的NaClO浸泡2-3min后，用无菌水漂洗5次；然后用75％的酒精浸泡3min，用无菌水漂洗数次去除种子表面残留的的NaClO与酒精后备用。将牛蒡种子种植于育苗土中，10天后选择长势一致的幼苗重新移栽至含有大田土(未灭菌)的高盆穴中(18cm宽×45cm高)，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照16h，无光照8h交替)，7天后用50mL上述制备的内生链霉菌Streptomyces sp.WY228液体菌剂分别灌根牛蒡幼苗，每隔4天灌根一次，持续灌根5-8次，以浇无菌水的牛蒡幼苗作为对照。所有灌根处理结束后，待幼苗再生长45天后观察比较牛蒡苗的长势。将实验后的牛蒡植株经流水轻轻洗净根际土壤，注意不破坏主根和须根，直尺测量地下部分长和地上部分长，网格法测量叶面积，轻轻擦干植物表面水渍后称取地下部分鲜重和地上部分鲜重，一部分放入烘箱烘干后测量地上部分干重和地下部分干重，一部分液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，待测其他物质含量。
WY228菌剂灌根后的牛蒡幼苗生长的更快更好，根更粗壮，须根数目更多，叶片更大，茎更粗长。由图4、图5可看到，实验组地上部分长度显著增加，实验组比对照组增加了19％；地上部分和地下部分重量都显著增加，地上部分增加了70％，地下部分重增加了76％；须根数显著增加，实验组比对照组增加了57.15％；主根横切面的直径显著增加，实验组比对照组增加了44.44％。在大田土栽培牛蒡苗环境下，牛蒡内生链霉菌WY228具有显著的促生效果。
同时，该菌株制备的菌剂灌根处理还显著促进了牛蒡苗中化学物质含量的提高，具有提升牛蒡品质的作用。如图6所示，在茎中，对照组和实验组总木脂素含量分别是3.93mg/g和8.26mg/g，实验组增长了110.09％，含量显著提高。总多酚含量在根、茎、叶中都有显著提高，处理组与对照组相比较，在根、茎、叶中分别提高了41.41％、110.13％、39.85％。菌株WY228的菌剂灌根回接对牛蒡茎的化学成分的积累的促进作用是最明显的，在茎和叶中，WY228的菌剂处理后的可溶性糖的含量分别增长73.21％和增长了174.08％。
WY228菌剂灌根后还具有显著提高牛蒡根际土壤酶活的能力。土壤脲酶与土壤微生物数量、有机质含量有着关系，是检测土壤活力的重要指标。蔗糖酶与土壤有机质、氯、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越强。如图7所示，WY228菌剂处理后提高了牛蒡根际土壤中的酶活力，土壤脲酶活力增加了6.54％，蔗糖酶活力提高了28.57％。说明通过WY228菌剂灌根处理，可有效提高牛蒡根际土壤肥力，达到促进牛蒡苗快速生长的效果。
4.2在番茄幼苗生长上的应用
番茄种子播种在上述灭菌的土壤中，10天后小苗移栽小花盆内(6cm宽×9cm高)，置于温室中生长，控制温度25℃，光照12h，黑暗12h。生长七天后开始用上述方法制备的内生链霉菌Streptomyces sp.WY228菌悬液灌根，实验组浇灌菌悬液30ml，对照组浇灌无菌水30ml。每4天灌根一次，共灌根6次结束后，灌根结束再生长35天后收获，观察比较番茄的长势。
灌根回接后对番茄收获，测量地上部分和地下部分鲜重、干重、高度和须根数目。如图8所示，WY228菌剂处理后明显叶片更多更大，茎更粗，根更粗壮，须根数目更多。
如图9所示，地上部分和地下部分的鲜重和干重都具有鲜重差异，显著提高。无菌水浇灌的番茄幼苗和WY228菌悬液浇灌的番茄幼苗，地上部分的鲜重分别为2.95g和5.62g，WY228菌悬处理后增长了90.77％，而地下部分鲜重增长了178.26％，地上部分的干重增长了113.31％，地下部分干重增长了228.93％。此外，WY228菌剂处理的植株高度显著增加，增长了48.85％，须根数目增加明显，增长了112.3％。因此，牛蒡内生链霉菌WY228制备的菌剂回接非宿主植物番茄也可以显著促进番茄幼苗的生长。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 链霉菌(Streptomyces sp. WY228)
<400> 1
tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa 60
cgatgaagcc gcttcggtgg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct 120
gcccttcact ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggataac actctgtccc 180
gcatgggacg gggttaaaag ctccggcggt gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt 240
tggtggggta atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc 300
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 360
aatgggcgaa agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa 420
cctctttcag cagggaagaa gcgaaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540
aagagctcgt aggcggcttg tcacgtcgga tgtgaaagcc cggggcttaa ccccgggtct 600
gcattcgata cgggctaact agagtgtggt aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt 660
gaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgttgg gaactaggtg ttggcgacat tccacgtcgt cggtgccgca gctaacgcat 840
taagttcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc agcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc 960
ttgacatata ccggaaagca tcagagatgg tgcccccctt gtggtcggta tacaggtggt 1020
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgttctg tgttgccagc atgcccttcg gggtgatggg gactcacagg agactgccgg 1140
ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtcttgggct 1200
gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga gctgcgatgc cgcgaggcgg agcgaatctc 1260
aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggagttgc 1320
tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaacccctt gtgggaggga 1440
gctgtcgaag gtgggactgg cgattgggac gaagtcgtaa caaggtaacc a 1491
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggaggtga tccagccgca 20

Claims (4)

1.一株牛蒡内生链霉菌，其特征在于，其分类命名为Streptomyces sp. WY228，属于链霉菌属，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2017年11月8日，保藏编号为GDMCCNO: 60274；
所述链霉菌WY228的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括作为有效成分的权利要求1所述的牛蒡内生链霉菌WY228，活菌数大于等于1.0 ×108cfu/mL。
3.一种权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)菌株活化：将分离的牛蒡内生链霉菌Streptomyces sp. WY228菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基的斜面上，30°C培养1-3天，从而活化菌株；
(2)种子液培养：从活化后的ISP 2固体培养基斜面上接种环挑取少许菌体接入到ISP2液体培养基中，于28℃，150-180 rpm转速在摇床上震荡培养2-3天，获得内生细菌WY228的种子液；
(3)菌剂制备：将培养到对数期的WY228种子培养液以3%-5%的接种量接入到ISP 2液体发酵培养基中，充分搅拌混匀后在28℃培养4-5天，10000 rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×108 cfu/mL的菌剂。
4.权利要求1所述的牛蒡内生链霉菌或权利要求2所述的微生物菌剂在促进牛蒡幼苗或番茄幼苗生长中的应用。
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两株链霉菌对小麦幼苗生长及诱导抗性的影响;刘玉涛;《西北农业学报》;20180509;第27卷(第5期);第658-666页 *
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猕猴桃溃疡病菌生防放线菌TGNBSA5的鉴定及其活性组分的初步研究;黄以超;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20121215;摘要,第2.2.1节第1段,第2.4.4节第2段 *
生防链霉菌NH14菌株对黄瓜的促生作用研究;王兰英;《农业科技通讯》;20081021(第7期);第36-38页 *

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