CN108913625A - 耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用 - Google Patents

耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用 Download PDF

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Abstract

耐盐链霉菌(Streptomyces olivaceus)菌株GDMCC No.60272。由上述菌株制备的微生物菌剂。上述微生物菌剂的制备方法和所制备的菌剂在促进植物在盐土环境中生长中的应用。本发明的链霉菌菌株，活性高且稳定，能有效促进植物在盐土环境中生长。本发明的微生物菌剂，制备方法简单，生产成本低，无污染，适于规模化应用。以本发明的微生物菌剂灌溉植物可促进植物在盐土环境中生长，从而改良盐渍土，成本低、使用简单，且无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。

Description

耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用
技术领域
本发明涉及微生物、微生物菌剂、微生物菌剂的制备及其应用，具体涉及一株耐盐链霉菌(Streptomyces olivaceus)菌株GDMCC No.60272，及由该菌株制备的微生物菌剂、其制备方法和所制备的菌剂在促进植物生长中的应用。
背景技术
土壤盐渍化是全球性的影响农业生产的主要因素之一，近年来，由于人类活动和自然因素的影响，土壤盐渍化问题日益严重。据不完全统计，全球盐渍化土壤面积约有8.3×109hm2，而我国也有约6.67×106hm2的盐渍化耕地，约占可耕地面积的25％，并且有逐年增加的趋势。土壤盐渍化主要是指易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程，从而导致农作物的生长受到一定的损伤。研究表明，土壤的盐渍化首先会抑制植物新陈代谢，导致植物发育不良；其次，土壤中过量的盐离子可对植物造成直接的毒害作用，使其形态结构发生改变；在盐碱土中，大量的可溶性盐使得溶液的渗透压升高，植物发生生理干旱，阻碍生长发育，导致农作物的减产或死亡。因而，改良盐渍土壤问题迫在眉睫。
盐渍化土壤的形成过程比较复杂，对于盐渍土的改良方法也有多种，包括物理改良、化学改良和生物改良等。目前，对于土壤盐渍化主要采用农业措施、水利工程和化学改土等传统措施，但这些措施均存在投入大、周期长和见效慢等缺点。目前主要的生物改良方法措施是培育并种植耐盐碱的作物，如种植甜菜、玉米、大豆，以及耐盐植物碱篷、柽柳等，此外还有耐盐转基因植物的研究，但是该类方法往往周期长、花费巨大，而且植物转基因方法还未被社会广泛接受认可。而利用植物有益微生物提高植物耐盐性和改良土壤盐碱化是改良盐渍化土壤较好的方法，植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指可以促进植物生长，且在植物根际周围定殖或者在土壤中正常生长的有益菌。它能在某一程度上促进植物有效的生长，可以增加植物的鲜重，促进植物的根长和芽长，提高叶绿素、脯氨酸的含量等，且提高农作物的产量。有研究表明，植物根际促生菌能够降低土壤在盐胁迫下对植物的危害，增强植物的耐盐性，促进植物的生长。但目前研究较多的植物促生菌为细菌以及菌根真菌等真菌资源，而有关放线菌提高农作物在盐胁迫下生长及相关菌剂研究报道甚少。
发明内容
为了克服现有盐渍土的改良方法的不足，本发明提供了一株耐盐链霉菌(Streptomyces olivaceus)菌株GDMCC No.60272，此构成本发明的第一个方面。
本发明还提供了由该链霉菌制备的微生物菌剂，此构成本发明的第二个方面。
本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，此构成本发明的第三个方面。所述制备方面具体包括：
S1：活化权利要求1中的链霉菌；
S2：将活化后的链霉菌菌体接种到液体培养基上进行培养获得种子液；
S3：将所得种子液接种到液体发酵培养基上进行发酵培养，收集发酵培养后菌体，洗涤，调整菌体浓度，得所述微生物菌剂。
进一步的，所述步骤S1具体包括：将权利要求1中的链霉菌的斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基的斜面上，28℃培养5-7天，得活化菌体。
进一步的，所述步骤S2具体包括：将活化后的链霉菌菌体接入到ISP 2液体培养基中，于28℃，150-180rpm转速在摇床上震荡培养3-5天，获得种子液。
进一步的，所述步骤S3具体包括：将种子液以5％的接种量接入到ISP 2液体发酵培养基中，充分搅拌混匀后在28℃培养3-5天，8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×107cfu/mL的菌剂。
本发明还提供了上述微生物菌剂在促进植物生长中的应用，此构成本发明的第四个方面。进一步的，所述促进植物生长中的应用为促进植物在盐土环境中生长中的应用。
进一步的，所述植物为小麦或番茄。
本发明的有益效果：
1.本发明的链霉菌菌株，活性高且稳定，能有效促进植物在盐土环境中生长；
2.本发明的微生物菌剂，制备方法简单，生产成本低，无污染，适于规模化应用；
3.以本发明的微生物菌剂灌溉植物可促进植物在盐土环境中生长，从而改良盐渍土，成本低、使用简单，且无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。
本发明的菌种保藏日期为2017年11月8日，保藏编号为：GDMCC No.60272。分类名称为：橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)，保藏单位名称为广东省微生物菌种保藏中心，地址为中国广州市广东微生物研究所，邮编510075。
附图说明
图1为本发明实施例2中在ISP 2平板上培养14天的橄榄色链霉菌PE5084及其扫描电镜照片；
图2为本发明实施例2中基于16S rRNA基因构建的菌株PE5084系统发育树；
图3为本发明实施例5中高盐及无盐胁迫条件下接菌与不接菌小麦盆栽试验生长状态对比照片；
图4为本发明实施例5中无盐胁迫条件下接菌与不接菌番茄幼苗盆栽试验生长状态对比照片；
图5为本发明实施例5中高盐胁迫条件下接菌与不接菌番茄幼苗盆栽试验生长状态的对比照片；
图6为本发明实施例5中高盐及无盐胁迫条件下接菌与不接菌番茄幼苗叶片总叶绿素含量对比。
具体实施方式：
实施例1：筛选过程
1.从江苏省连云港市海岸带盐渍土壤中采集盐生植物叶片样品，将表面消毒后的植物叶样品在无菌研钵中匀浆破碎并用无菌水进行梯度稀释，取10-2稀释度的匀浆50微升涂布于分离培养基中(酵母膏0.25g,K2HPO4 0.5g,水1L,pH 7.2)。
2.待平板涂好之后，在28℃恒温培养箱中培养。每隔24h查看平板上菌落生长情况。3-7天后依据菌落形状、大小、颜色等不同特征，挑选不同分离菌株接至ISP 2固体斜面中保存。纯的菌株接种ISP 2液体培养基中，培养基中添加不同浓度的NaCl(0-15％,间隔1％)，放置于28℃恒温摇床，进行摇瓶培养，培养条件：150rpm，培养7天，检查分离菌株在不同浓度NaCl条件下的生长情况，获得了耐盐的菌株PE5084。
实施例2：菌株PE5084的鉴定
1.培养特征观察：PE5084菌体形态特征(基内菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子等)等观察采用埋片法。在ISP 2固体培养基上接种纯化后的PE5084菌株，采用四区划线，于28℃下生长7-14d，观察菌株生长情况及菌落形态。
2.显微形态特征观察：在ISP 2固体培养基上，挖出1cm×3cm左右大小的长方形凹槽，在凹槽周围用竹签涂抹接菌PE5084，用镊子将无菌盖玻片平放在培养基的凹槽上，28℃培养14d后，用镊子取出盖玻片，滴加戊二醛在盖玻片上有菌丝的位置，自然晾干。在光学显微镜下观察玻片上有印痕的一面，观察菌丝形态并拍照。
3.生理生化特征：采用《链霉菌鉴定手册》中的标准实验方法进行实验。
4.PE5084菌株16S rRNA基因测序与系统发育分析：从ISP 2固体平板上刮取菌体微波法提取菌体基因组DNA，用细菌通用引物27f 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA 2μL，10×buffer 5μL，MgCl2(25mmol)3μL，dNTP(10mmol/L)1μL，27f(10μmol/L)1μL，1492r(10μmol/L)1μL，Taq酶(5u/μL)0.5μL，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工(上海)有限公司测序，测序结果如SEQ ID No.1所示。测序结果在NCBI上比对初步鉴定具体的属，然后在EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种进行进化树的构建，用Mega6.0软件进行序列比对及分析，最后用最大似然法(Maximum likelihood,ML)构建系统进化树并进行系统发育分析。
菌株PE5084的形态特征：如图1所示，菌株PE5084在ISP 2固体平板上生长良好，菌落干燥、具有气生菌丝和基内菌丝的分化，气生菌丝繁茂发达，具备链霉菌属的典型特征。扫描电镜下可清晰地观察到气生菌丝和基内菌丝，气生菌丝发达、弯曲呈螺旋状，具有典型链霉菌属的特征。菌株PE5084能耐受最高浓度为7％的NaCl，能利用甘油、L-阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、蔗糖等多种碳源生长。
如图2所示，16S rRNA基因序列比对发现菌株PE5084属于链霉菌属(Streptomyces)的成员，EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种，比对发现与该属有效发表种橄榄色链霉菌Streptomyces olivaceus的相似性最高，为100％，且聚在一个独立的进化分支上。因此，菌株PE5084应属于链霉菌属的成员，初步鉴定为橄榄色链霉菌PE5084(Streptomyces olivaceus PE5084)。
实施例3：菌株PE5084促生长性能检测
溶解无机磷能力检测：挑取少量菌体点植于含磷酸钙的无机磷培养基中，在28℃培养箱中培养3～5天，观察菌落周围是否出现透明圈，若呈现，则证明该菌株具有溶磷活性。定性检测发现菌株PE5084能够溶解无机磷。
产铁载体活性检测：将菌株PE5084点接于CAS检测培养基上，28℃环境下培养5-7天后，观察菌落周围是否有黄色透明圈，若呈现，则证明该菌株具有产铁载体活性，即呈阳性。定性检测发现菌株PE5084能够产生铁载体。
产植物生长激素吲哚乙酸(IAA)检测：配制2.5mg/mL色氨酸溶液，在超净工作台中用0.22μm滤膜过滤除菌。配制液体有氮培养基并进行试管分装，115℃、30min高压灭菌。向已灭过菌的有氮培养基中分别加入1mL色氨酸溶液，使色氨酸浓度为0.5mg/mL，接入待测菌株后放于28℃摇床中培养7天。培养后分别吸取菌液1mL与Salkowski’s显色剂2mL混匀，进行暗反应20min，若试管中溶液呈粉红色则证明该菌株具有产IAA活性。定性检测发现菌株PE5084产IAA。
产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC)活性定性检测：挑取少量的待测菌体用点植法接种到ADF固体培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养7天，观察菌株是否生长，并将能生长菌株转接，若转接三次后还能在以ACC为唯一碳源的培养基生长说明该菌株具有ACC脱氨酶潜在活性，反之，则无活性。定性检测发现菌株PE5084产ACC脱氨酶。
实施例4：菌株PE5084菌剂制备方法
S1：菌株活化：将分离的橄榄色链霉菌Streptomyces olivaceus PE5084菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基的斜面上，28℃培养5-7天，从而活化菌株。
S2：种子液培养：从活化后的ISP 2固体培养基斜面上竹签挑取少许菌体接入到ISP 2液体培养基中，于28℃，150-180rpm转速在摇床上震荡培养3-5天(对数期)，获得种子液。
S3：菌剂制备：将培养到对数期的种子培养液以5％的接种量接入到ISP 2液体发酵培养基(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，4g葡萄糖，pH 7.2，1000ml水)中，充分搅拌混匀后在28℃培养3-5天，8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×107cfu/mL的菌剂，用于接种农作物实验。
实施例5：菌株PE5084菌剂的应用试验：
1.在小麦幼苗生长上的应用：
对小麦种子进行表面消毒，首先用有效氯含量为5％的NaClO浸泡3min后，用无菌水漂洗4-5次；然后用75％的酒精浸泡5min，用无菌水漂洗数次至种子表面不发黄，将小麦种子平铺放入灭过菌的铺有两层滤纸的平板上，用移液枪吸取10ml的无菌水注入平板上，保持滤纸湿润；放入培养箱中，28℃催芽。10天后观察小麦种子的萌发情况。采用营养土与蛭石以体积比4:1混合得到盆栽基质，然后于121℃灭菌一小时，冷却后分装至盆栽花盆中(9cm长×9cm宽×9cm高)，每盆约200g。选取长势一致的小麦幼苗，移栽含营养土的花盆中，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照12h，无光照12h交替)，用50mL无菌水和PE5084菌剂浇灌小麦幼苗，每周浇灌2次，以浇无菌水的小麦幼苗作为对照；3周以后，用1％的NaCl溶液进行盐胁迫灌根处理，每周灌根一次，连续灌根3次。
盐胁迫30天的盆栽生长状态对比照片如图3所示，测量统计结果如表1所示，从表1和图3中可以看出，接种橄榄色链霉菌Streptomyces olivaceus PE5084菌剂的后小麦在0、1％NaCl处理下鲜重分别提高了64.3％、117％，株高提高了27.0％和22.0％，可见盐胁迫下菌株PE5084菌剂对小麦幼苗的生长具有显著促进作用。
表1接种链霉菌PE5084菌剂对小麦幼苗生长的影响
2.在番茄幼苗生长上的应用：
将番茄种子种植于已经灭菌(121℃，2h)的育苗土中，10天后观察种子的萌发情况。采用营养土作为盆栽基质，于121℃灭菌2h，冷却后分装至一次性塑料杯中，每盆约50g。选取长势一致的番茄幼苗，移栽到含营养土的塑料杯中，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照16h，无光照8h交替)，8天后，用25mL无菌水和PE5084菌剂浇灌番茄每株幼苗，每隔2天浇灌一次，以浇无菌水的番茄幼苗作为对照，20天后观察比较番茄的长势。
同样选取长势一致的番茄幼苗移栽到花盆中(9cm长×9cm宽×9cm高)，每盆约200g土。放于温室中生长(温度为25℃，每天光照12h，无光照12h交替)，8天后，用25mL无菌水和PE5084菌剂浇灌番茄每株幼苗，每隔2天浇灌一次，以浇无菌水的番茄幼苗作为对照。浇灌6次以后，用200mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫灌根处理，每隔2天灌根一次，持续灌根3-4次，使得最后土壤中的盐浓度约为1.8％。
如图4所示，番茄种子的促生实验可以发现无盐胁迫时，菌剂能够促进番茄幼苗的生长。如图5所示，在盐胁迫下，盐胁迫的对照组番茄幼苗已经发黄，而接菌组番茄幼苗保持鲜绿状态，长势良好，植株变得更高。盐胁迫15天的盆栽测量统计结果如表2所示，可以发现，接种橄榄色链霉菌Streptomyces olivaceus PE5084菌剂后番茄在0、1.8％NaCl处理下鲜重分别提高了34.6％和63.5％、株高分别提高了5.8％和36.7％。如图6所示，1.8％NaCl胁迫下番茄苗叶片中的总叶绿素含量也显著提高，可见盐胁迫下菌株PE5084的菌剂对番茄幼苗的生长具有显著促进作用。
表2.接种放线菌PE5084对番茄幼苗生长的影响
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1366
<212> DNA
<213> 链霉菌(Streptomyces olivaceus)
<400> 1
cttcggtggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc cctgcactct 60
gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatattga ccttcacggg catctgtgag 120
gttcgaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtgaggtaa 180
tggctcacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa 300
gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc 360
agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca 420
gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta 480
ggcggcttgt cacgtcggtt gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cagtcgatac 540
gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag 600
atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga cgctgaggag 660
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg 720
cactaggtgt gggcaacatt ccacgttgtc cgtgccgcag ctaacgcatt aagtgccccg 780
cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 840
gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac 900
cggaaacggc cagagatggt cgcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc 960
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcccgt 1020
gttgccagca agctccttcg ggggtgttgg ggactcacgg gagaccgccg gggtcaactc 1080
ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tgcacacgtg 1140
ctacaatggc cggtacaatg agctgcgata ccgcaaggtg gagcgaatct caaaaagccg 1200
gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg 1260
cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc 1320
acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct tgtggg 1366

Claims (9)

1.耐盐链霉菌(Streptomyces olivaceus)，其保藏编号为：GDMCC No.60272。
2.由权利要求1中的链霉菌制备的微生物菌剂。
3.权利要求2中的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：活化权利要求1中的链霉菌；
S2：将活化后的链霉菌菌体接种到液体培养基上进行培养获得种子液；
S3：将所得种子液接种到液体发酵培养基上进行发酵培养，收集发酵培养后菌体，洗涤，调整菌体浓度，得所述微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：将权利要求1中的链霉菌的斜面或冻存管保藏物接种到含有ISP 2固体培养基的斜面上，28℃培养5-7天，得活化菌体。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：将活化后的链霉菌菌体接入到ISP 2液体培养基中，于28℃，150-180rpm转速在摇床上震荡培养3-5天，获得种子液。
6.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将种子液以5％的接种量接入到ISP 2液体发酵培养基中，充分搅拌混匀后在28℃培养3-5天，8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度≥1.0×107cfu/mL的菌剂。
7.权利要求2中的微生物菌剂在促进植物生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述促进植物生长为促进植物在盐土环境中生长。
9.根据权利要求7或8所述的微生物菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述植物为小麦或番茄。
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