CN114292769B - 耐盐碱番茄叶内生菌、发酵液、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物培育技术领域，公开了耐盐碱番茄叶内生菌，所述耐盐碱番茄叶内生菌命名为李斯特拟诺卡氏菌BFY2‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20211324，保藏日期为2021年10月26日；还公开了耐盐碱番茄叶内生菌的筛选纯化方法、发酵液的制备方法及应用。本发明筛选出来的菌株具有耐盐碱功能，喷施BFY2‑1菌株发酵液能够促进盐碱环境中番茄的生长，当BFY2‑1菌株发酵液的OD值为0.1时，该BFY2‑1菌株将受盐碱胁迫的番茄种子的发芽率提高了14.3％；盆栽实验中对番茄植株叶面喷施该BFY2‑1菌株发酵液，番茄的株高提高了13％，鲜重提高了17％，本发明的BFY2‑1菌株在大棚设施番茄的生产方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物培育技术领域，具体涉及耐盐碱番茄叶内生菌、发酵液、制备方法及应用。
背景技术
随着设施农业的快速发展，化肥的过量施用造成了大面积的土壤次生盐渍化，盐渍土或碱土是土壤中可溶性盐类或代换性钠离子浓度达到一定程度后，土壤的pH值较高，作物难以生长的一类土壤。盐碱化使土壤理化性质变差，使作物根系难以吸收水分和投入肥料中的营养物质，引起生理干旱和营养缺乏症，导致作物生长发育遭受盐害而受到抑制，从而对植物生长产生负面影响，造成盐渍土中种植的作物(植物)缺苗、植株生长减弱、减产、甚至绝产，而提高植物的耐盐性是解决次生盐渍化的方法之一。
因为通过微生物的方法提高植物的耐盐性不会造成二次污染，因此其成为领域内的研究热点。近年来，植物内生菌倍受关注，发明人的前期研究证实番茄叶内生菌对土壤盐渍化程度有显著影响，通过有益菌的添加，可能改善叶片菌群组成，提高菌群多样性；而且内生菌代谢产物大多具有生物学活性，如抗菌、抗病毒等作用，因此可提高植物对盐碱的耐受性，促进植物生长，在农业中具有广阔的应用前景。目前还未见关于从番茄叶中分离得到内生李斯特拟诺卡氏菌的文献报道，也没有关于番茄叶内生菌发酵液有耐盐碱、植物促生作用的研究报道，因此，发明人研发了耐盐碱番茄叶内生菌、发酵液、制备方法及应用。
发明内容
基于以上问题，本发明提供耐盐碱番茄叶内生菌、发酵液、制备方法及应用，本发明的耐盐碱番茄叶内生菌的发酵液可提高盐碱地番茄种子的发芽率和生长效率。
为解决以上技术问题，本发明提供了耐盐碱番茄叶内生菌，所述耐盐碱番茄叶内生菌命名为李斯特拟诺卡氏菌BFY2-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20211324，保藏日期为2021年10月26日。
为解决以上技术问题，本发明还提供了耐盐碱番茄叶内生菌的筛选纯化方法，具体步骤如下：
(1)清洗消毒
在无菌操作台内，采集盐碱土中生长的番茄新鲜叶片，用灭菌超纯水洗涤30s，70％乙醇灭菌2min，5％次氯酸钠灭菌5min，70％乙醇清洗30s，灭菌超纯水润洗5次；
(2)富集培养
将经步骤(1)处理之后的新鲜番茄叶，在无菌离心管中用灭菌的镊子捣碎，然后将捣碎的番茄叶接种于含盐碱液体牛肉膏蛋白胨固体培养基中，含盐碱液体牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，pH：9，NaCl含量1％，Na2SO4含量5％；接种后在28℃恒温培养箱下培养4天；
(3)平板涂布分离纯化
吸取步骤(2)中培养后的菌液0.1mL，用无菌水进行梯度稀释后涂布于含盐碱的营养平板中，营养平板的组成如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH：9，NaCl含量1％，Na2SO4含量5％；涂布后置于28℃恒温培养箱中培养4天，之后挑取营养平板上的菌，在新的上述营养平板上通过反复划线的方法纯化，直到得到纯的单菌落。
为解决以上技术问题，本发明还提供了耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的制备方法，具体如下：所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，将培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取纯化后的BFY2-1菌种于三角瓶中，在28-30℃温度条件下摇床培养48h，即得BFY2-1菌株发酵液。
进一步的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成成分如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，pH为7，NaCl含量1％。
为解决以上技术问题，本发明还提供了耐盐碱番茄叶内生菌发酵液在制备促盐碱地番茄生长的肥料中的应用。
进一步的，所述肥料仅为耐盐碱番茄叶内生菌发酵液，所述耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的浓度以稀释至在分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1为宜。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明筛选出来的菌株具有耐盐碱功能，喷施BFY2-1菌株发酵液能够促进盐碱环境中番茄的生长，当BFY2-1菌株发酵液的OD值为0.1时，该BFY2-1菌株将受盐碱胁迫的番茄种子的发芽率提高了14.3％；盆栽实验中对番茄植株叶面喷施该BFY2-1菌株发酵液，番茄的株高提高了13％，鲜重提高了17％，本发明的BFY2-1菌株在大棚设施番茄的生产方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例的耐盐碱、植物促生叶内生菌组培效果试验图；
图2为本发明的实施例的耐盐碱、植物促生叶内生菌盆栽效果试验图；
图3为本发明的实施例的细菌BFY2-1的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例以盐碱地(pH值8.5，EC值为1.7ms/cm)生长新鲜番茄叶为原料，通过筛选和纯化得到李斯特拟诺卡氏菌BFY2-1(Nocardiopsis listeri BFY2-1)，具体筛选及纯化方法如下：
(1)清洗消毒
在无菌操作台内，采集盐碱土中生长的番茄新鲜叶片，用灭菌超纯水洗涤30s，70％乙醇灭菌2min，5％次氯酸钠灭菌5min，70％乙醇清洗30s，灭菌超纯水润洗5次，并保留最后一次洗涤用水作为对照；
(2)富集培养
将经步骤(1)处理之后的新鲜番茄叶，在无菌离心管中用灭菌的镊子捣碎，然后将捣碎的番茄叶接种于含盐碱液体牛肉膏蛋白胨固体培养基，含盐碱液体牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，pH：9，NaCl含量1％，Na2SO4含量5％；接种后在28℃恒温培养箱下培养4天，观察有无菌落长出；
(3)平板涂布分离纯化
吸取步骤(2)中培养后的菌液0.1mL，用无菌水进行梯度稀释后涂布于含盐碱的营养平板中，营养平板的组成如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH：9，NaCl含量1％，Na2SO4含量5％；涂布后置于28℃恒温培养箱中培养4天，之后挑取营养平板上的菌，在新的营养平板上通过反复划线的方法纯化，直到得到纯的单菌落，对纯化得到的菌进行16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
经16S rDNA分析，发现本实施例筛选纯化的菌种与国际数据库Genbank中记录的李斯特拟诺卡氏菌Nocardiopsis listeri(GENEBANK登录号为EU570350.1)的分子同源性最高，达99％以上，因此将其命名为李斯特拟诺卡氏菌BFY2-1(Nocardiopsis listeriBFY2-1)，BFY2-1的基因序列见SEQ ID NO：1，具体序列如下：
ccgatggggctgtacctgcagtcgagcggtaaggcccttcggggtacacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctgactctgggataagcggtggaaacgccgtctaataccggatacgacccgccacctcatggtgtgcgagtggaaagttttttcggttggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcccaccaaggcgattacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctgcgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaacctcttttaccactaacgcaggctccacgttctcgtggggttgacggtaggtggggaataaggaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtccgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcgtgtcacgtctgctgtgaaagaccggggcttaactccggttctgcagtggatacgggcacgctagaggtaggtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggccttacctgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcgctaggtgtggggactttccacggtttccgcgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgttgcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggtttgacatcacccgtggacctgtagagatacagggtcatttagttggtgggtgacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttccatgttgccagcacgtaatggtggggactcatgggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcaaacatgctacaatggccggtacaatgggcgtgcgagaccgtaaggtggagcgaatcccttaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaaggtggagtcgctagtaatcgcggatcagcaacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggcaacacccgaaacttgtggcctaaccccttgtgggagggaagagtaagtagggg
本实施例在扫描电子显微镜下观察细菌BFY2-1，见附图3，发现其为革兰氏阳性菌，有菌丝体，该菌在在营养平板上生长良好，菌落紧密，表面干燥，有褶皱，边缘下陷，不易挑起，菌落形态呈土黄色，生长温度为28-30℃。本实施还对BFY2-1进行了功能测试，测试结果见表1。
表1番茄叶内生李斯特拟诺卡氏菌功能特征
本实施例对BFY2-1菌株进行液体发酵培养：所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨营养琼脂液体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，pH为7左右，NaCl含量1％)，将培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的BFY2-1菌种于三角瓶中，在28-30℃温度条件下摇床培养48h，即得BFY2-1菌株发酵液。
本实施例对上述BFY2-1菌株发酵液的功能进行了研究，发酵液耐盐碱、促生功能测定方法一如下：(1)首先对番茄种子进行灭菌处理，具体方法为：将番茄种子用75％的酒精浸泡10s，再用10％次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水冲洗3次；(2)将灭菌后的番茄种子移入含有100ML固体盐碱MS培养基(pH值为8.5，NaCl含量1％，Na2SO4含量5％)的组培瓶中，在避光条件下培养5天，第六天加入0.05ml BFY2-1菌株发酵液(分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1)，再避光培养，让种子发芽；同时用不加BFY2-1菌株发酵液的液体培养基(牛肉膏蛋白胨营养琼脂液体培养基)作为对照处理。10天后记录各组的发芽率，在30天后记录番茄株高、鲜重。结果表明，当番茄叶内生菌发酵液在分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1时，会将番茄种子在盐碱条件下的发芽率提高14.3％。见附图1，在固体盐碱MS培养基上，相比对照组，用BFY2-1菌株发酵液浸泡的番茄植株的株高提高了21.7％，鲜重提高了23.4％。BFY2-1菌株发酵液对固体盐碱MS培养基中番茄生长的影响的部分具体实验数值见表2。
表2 BFY2-1菌株发酵液对固体盐碱MS培养基中番茄生长的影响
发酵液耐盐碱、促生功能测定方法二如下：在直径30cm的盆中加入盐碱土(pH值8.5，EC值为1.7ms/cm)，移植番茄苗；在番茄苗成活后7天，番茄幼苗期，下午5点以后，将BFY2-1菌株发酵液、对照液体培养基(牛肉膏蛋白胨营养琼脂液体培养基)和水喷施到番茄叶片上，BFY2-1菌株发酵液在使用时需稀释，稀释至在分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1，喷施量约为20mL每株，均匀喷施在叶片两面；随后每间隔15天，再喷施一次，共喷施3次；在每次喷施处理前记录番茄株高和鲜重；每个处理7盆重复，浇水频率和用量相同。测定实验结果见表3和附图2，结果表明，喷施BFY2-1菌株发酵液增加了盐碱地生长番茄的株高和鲜重，有效促进了番茄生长。
表3喷施菌液对盐碱土中番茄生长的影响
由此可见上述制备的耐盐碱番茄叶内生菌发酵液(BFY2-1菌株发酵液)可应用于制备促盐碱地番茄生长的肥料中，所述肥料可仅为耐盐碱番茄叶内生菌发酵液，所述耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的浓度以稀释至在分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1为宜。本实施例所述的耐盐碱番茄叶内生菌命名为李斯特拟诺卡氏菌BFY2-1，已于2021年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20211324。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 陕西省生物农业研究所
<120> 耐盐碱番茄叶内生菌、发酵液、制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 李斯特拟诺卡氏菌(Nocardiopsis listeri)
<400> 1
ccgatggggc tgtacctgca gtcgagcggt aaggcccttc ggggtacacg agcggcgaac 60
gggtgagtaa cacgtgagca acctgcccct gactctggga taagcggtgg aaacgccgtc 120
taataccgga tacgacccgc cacctcatgg tgtgcgagtg gaaagttttt tcggttgggg 180
atgggctcgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ccaccaaggc gattacgggt 240
agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctgcgg 300
gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtgg 360
gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct tttaccacta acgcaggctc cacgttctcg 420
tggggttgac ggtaggtggg gaataaggac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtagggt ccgagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcgtgt 540
cacgtctgct gtgaaagacc ggggcttaac tccggttctg cagtggatac gggcacgcta 600
gaggtaggta ggggagactg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag 660
gaacaccggt ggcgaaggcg ggtctctggg ccttacctga cgctgaggag cgaaagcatg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgttggg cgctaggtgt 780
ggggactttc cacggtttcc gcgccgtagc taacgcatta agcgccccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt 900
tgcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggttt gacatcaccc gtggacctgt 960
agagatacag ggtcatttag ttggtgggtg acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttccat gttgccagca 1080
cgtaatggtg gggactcatg ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac 1140
gtcaagtcat catgcccctt atgtcttggg ctgcaaacat gctacaatgg ccggtacaat 1200
gggcgtgcga gaccgtaagg tggagcgaat cccttaaagc cggtctcagt tcggattggg 1260
gtctgcaact cgaccccatg aaggtggagt cgctagtaat cgcggatcag caacgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggcaacacc 1380
cgaaacttgt ggcctaaccc cttgtgggag ggaagagtaa gtagggg 1427
Claims (5)
1.耐盐碱番茄叶内生菌，其特征在于，所述耐盐碱番茄叶内生菌命名为李斯特拟诺卡氏菌(Nocardiopsis listeri)BFY2-1，保藏编号为CCTCC M 20211324。
2.权利要求1所述的耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的制备方法，其特征在于，具体如下：所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，将培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取纯化后的BFY2-1菌种于三角瓶中，在28-30℃温度条件下摇床培养48h，即得BFY2-1菌株发酵液。
3.根据权利要求2所述的耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成成分如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，水1000ml，pH为7，NaCl含量1％。
4.权利要求2-3中任意一项制备方法制备的耐盐碱番茄叶内生菌发酵液在制备促盐碱地番茄生长的肥料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肥料仅为耐盐碱番茄叶内生菌发酵液，所述耐盐碱番茄叶内生菌发酵液的浓度以稀释至在分光光度计600nm下光密度OD测量值为0.1。
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| GR01 | Patent grant | ||
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