CN115851485B - 芽孢杆菌属细菌及其在提高植物耐盐碱性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌属细菌及其在提高植物耐盐碱性中的应用，芽孢杆菌属细菌具体为(Bacillus inaquosorum)HZAU‑P2，于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022891。实验证明，向番茄枳雀和拟南芥根系施加HZAU‑P2，可以提高植物的耐盐碱性，主要表现为植物侧根增多、促进植株在盐碱胁迫下的生长。本发明具有重要的应用价值。

Description

芽孢杆菌属细菌及其在提高植物耐盐碱性中的应用
技术领域
本发明涉及植物耐盐碱方法领域，具体涉及一种芽孢杆菌属细菌及其在提高植物耐盐碱性中的应用。
背景技术
作为主要的非生物胁迫之一，土壤盐渍化对受影响地区的农业生产力、微生物群落和农业经济产生了负面影响，是近几十年来全球范围内扩大的一个重大农业问题。通过基因工程和传统育种方法来开发耐盐碱的农作物一直是研究的热点；然而这种方法并不高效，由于盐碱胁迫能够影响植物生理的许多方面，传统的育种方法培育的耐盐碱的作物并不能完全有效的解决这些问题，到目前为止已知的耐盐碱胁迫的基因型数量有限证明了这一点。传统的植物育种方法费时费力，尽管科学们通过转基因技术培育出了几种转基因植物，但这些植物大多数都是在控制生长条件或温室条件下进行的实验。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种芽孢杆菌属细菌及其在提高植物耐盐碱性中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
芽孢杆菌属细菌，为枯草芽孢杆菌Bacillus inaquosorum HZAU-P2，于2022年6月15日保藏于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022891。
进一步的，所述的芽孢杆菌属细菌在提高植物耐盐碱性中的应用。
提高植物耐盐碱性的方法，具体为采用含有上述芽孢杆菌属细菌的菌剂处理植物根系。
进一步的，所述含有芽孢杆菌属细菌菌剂的OD600nm值为0.2。
本发明的有益效果为：实验证明，本发明提供的枯草芽孢杆菌HZAU-P2可以促进拟南芥和枳雀在盐碱胁迫下的生长发育，提高拟南芥和枳雀的耐盐碱性。本发明具有重要的应用价值。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌HZAU-P2在盐碱胁迫下对培养基中拟南芥幼苗生长影响示意图；
图2为枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂处理后盐碱胁迫下的拟南芥与未处理的对照例植株生长对比图。
图3为枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂处理后盐碱胁迫下的拟南芥植株的株高的统计结果；
图4为枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂处理后盐碱胁迫下的拟南芥植株的茎粗的统计结果；
图5为枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂处理后盐碱胁迫下的枳雀与未处理的对照例植株生长对比图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
LB液体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠5g溶于1L蒸馏水中，然后121℃灭菌15min，冷取后使用。
LB固体培养基：向LB液体培养基培养基中加入琼脂并使其浓度为15g/L；然后然后121℃灭菌15min。将冷却到约55℃的液体培养基到入培养皿，自然冷却。
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0亚型记载于如下文献中：Lundberg DS,Lebeis SL,Paredes SH,et al.Defining the core Arabidopsis thalianaroot microbiome.Nature.2012；488(7409):86-90。野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia-0亚型在下文中简称拟南芥。
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus inaquosorum)HZAU-P2的分离、鉴定与保藏。
一、枯草芽孢杆菌(Bacillus inaquosorum)HZAU-P2的分离
1、在45mL磷酸缓冲液中加入5g根际土样品(采自新疆塔里木河边库尔勒香梨果园中采集了健康的香梨根际土壤)，搅拌15min，静止10min，然后取上清液1mL，加入盛有9mL磷酸缓冲液的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从试管中吸取1mL加入另一盛有9mL磷酸缓冲液的无菌试管中充分混匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释的菌悬液。将各稀释梯度取0.1mL菌悬液均匀涂布在LB固体培养基上(pH＝8.5)，28℃恒温静置培养2-3d。
2、完成步骤一后，挑取LB固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上。将筛选到的一株细菌命名为细菌HZAU-P2。
二、细菌HZAU-P2的鉴定
16sRNA序列同源性分析
细菌HZAU-P2的16sRNA与NCBI中的序列进行比对，结果表明，细菌HZAU-P2与芽孢杆菌属菌株Bacillus inaquosorum的同源性最高，达到99.93％。
三、保藏
根据上述16sRNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化的得到的细菌HZAU-P2鉴定为芽孢杆菌属。
菌种保存：将枯草芽孢杆菌HZAU-P2单菌落接种至LB液体培养基，28℃、200r/min摇床培养8h，得到细菌培养液。将1体积份细菌培养液和1体积份60％(v/v)甘油混合均匀，-80℃保存。
(2)、枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂的制备
1、将实施例1中-80℃保存的菌液在LB固体培养基上活化。
2、挑取LB固体培养基单菌落接种于装有100mLLB液体培养基的灭过菌的锥形瓶(规格为250mL)中，28℃、200r/min培养8h，得到的菌液将OD600nm值调为0.2，该菌液即为制备的枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂。
(3)、枯草芽孢杆菌HZAU-P2在提高植物耐盐碱性中的作用
一、培养基的制备
培养皿的规格：10cm×10cm
1/2MS固体培养基：将2.23g1/2MS基本培养基粉末(Coolaber公司)、15g蔗糖和20g琼脂溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容到1L，调节pH值至5.8，用于后续处理的1/2MS固体培养基，调节pH值至8.5，然后121℃灭菌15分钟，将冷却到约55℃的液体培养基到入培养皿，自然冷却后使用。
二、枯草芽孢杆菌HZAU-P2菌剂对植物耐盐碱性的影响
培养条件为：22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx。
1、取拟南芥种子，用75％的酒精溶液处理30秒，再用灭菌水清洗三次，然后用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液处理6min，最后用灭菌水清洗三次。
2、完成步骤1后，将拟南芥种子播种于正常1/2MS固体培养基上，4℃春化两天后放置在22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx的恒温培养箱中培养7天。
3、挑取完成步骤2的拟南芥幼苗移栽至盐碱1/2MS固体培养基中，每个培养基中中放置5株幼苗。分为对照组和处理组。对照组为与每株拟南芥幼苗所对应的1/2MS固培养基下部四分之一处接种2ul液体LB；处理组为与每株拟南芥幼苗所对应的1/2MS固培养基下部四分之一处接种2ul菌剂，处理方式见图。后续竖直培养后，拟南芥根部也不生长至已接菌剂的培养基处(本实验研究菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响)。
4、将完成步骤3的1/2MS固培养基水平培养14天，观察拟南芥的生长状况。
5、拟南芥的生长状况如图1、2(左边为对照组，右边为枯草芽孢杆菌HZAU-P2处理)。
6、观察各处理组之间拟南芥生长发育表型，统计植株生长高度如图3。
7、观察各处理组之间拟南芥生长发育表型，统计植株茎粗度如图4。
结果表明，接菌的条件下，在培养基上生长的拟南芥生长良好，侧根数量明显增多。基质栽培的条件下可以发现枯草芽孢杆菌HZAU-P2同样可以提高植物的耐盐碱性。由此可见枯草芽孢杆菌HZAU-P2在促进植物耐盐碱方面起着重要的作用。
(4)、枯草芽孢杆菌HZAU-P2在提高枳雀耐盐碱性中的应用
培养条件为：25℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx。
1、取陕西城固枳雀种子，用75％的酒精溶液处理30秒，再用灭菌水清洗三次，然后用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液处理6min，最后用灭菌水清洗三次。
2、完成步骤1后，将枳雀种子播种于蛭石中，放置在25℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx的恒温培养箱中培养，待种子发芽后进行移栽。
3、将完成步骤2的枳雀幼苗移栽到装有基质土的盆中，每盆1棵，得到20盆枳雀幼苗共20棵。
4、取10盆枳雀，使用灌根法接种OD600nm值为0.2的极端芽孢杆菌的菌剂，每棵幼苗接种5mL菌剂，每2周接种一次。取另外10盆枳雀幼苗，每两周接种5mL液体LB培养基。共接种4次。
5、配制200mM/L的NaHCO3，每棵幼苗浇50mL的NaHCO3溶液，持续处理两周。
6、由图5可看出，与对照相比，HZAU-P2可以增强枳雀的耐盐碱性。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.芽孢杆菌属细菌，其特征在于，为枯草芽孢杆菌(Bacillus inaquosorum)HZAU-P2，于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022891。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌属细菌在提高拟南芥和枳雀耐盐碱性中的应用，具体为采用含有权利要求1所述的芽孢杆菌属细菌的菌剂处理植物根系，含有芽孢杆菌属细菌菌剂的OD 600nm 值为0.2。
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芽孢杆菌的耐盐促生机制研究进展;胡玉婕等;生物技术通报;第36卷(第9期);全文 *

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