CN114350546B - 假单胞菌属细菌及其在促进植物生长和开花坐果中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种假单胞菌属细菌及其在促进植物生长和开花坐果中的应用，假单胞菌属细菌具体为极端东方假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)HZAU‑P1，于2021年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211492。实验证明，向番茄和拟南芥根系施加HZAU‑P1，可以促进植物生长，提早开花，提高座果率和果实产量，主要表现为植物侧根增多、促进植株生长、植物提前开花、花朵数量增多、果实数量增多、提前破色成熟以及果实产量增多。本发明具有重要的应用价值。

Description

假单胞菌属细菌及其在促进植物生长和开花坐果中的应用
技术领域
本发明涉及植物促开花方法领域，具体涉及一种假单胞菌属细菌及其在促进植物生长和开花坐果中的应用。
背景技术
开花是决定植物繁殖成功的重要标志，植物必须准确地将内部信号和环境信号相结合然后启动开花过程。植物的开花时间受到自然环境和遗传机制的共同作用，在种间和种内呈现丰富的多样性。目前，人们从生理、生化、代谢、生态、遗传、进化等方面对调控植物开花机制进行了大量研究，特别是随着分子生物学的发展，人们能从基因组成、表达调控和信号传导等分子水平上认识调控植物开花的机理，为利用基因工程等手段调控植物开花提供新途径。由于植物开花机制的复杂性，采用传统的育种手段改变植物开花时间十分困难，基因工程等手段虽然开辟了调控植物开花育种的新途径，但高效调控植物开花基因的分离成为限制的主要因素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种假单胞菌属细菌及其在促进植物生长和开花坐果中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
假单胞菌属细菌，为极端东方假单胞菌HZAU-P1，于2021年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211492。
进一步的，所述的假单胞菌属细菌在促进植物生长、开花和坐果中的应用。
促进植物生长、开花和坐果的方法，具体为采用含有上述假单胞菌属细菌的菌剂处理植物根系。
进一步的，所述含有假单胞菌属细菌菌剂的OD600nm值为0.2。
本发明的有益效果为：实验证明，本发明提供的HZAU-P1可以促进拟南芥和番茄的生长和根系增多，促进拟南芥和番茄提早开花和花数目增多，同时还可以促进番茄果实数量增多提早破色成熟，提高产量。本发明具有重要的应用价值。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为极端东方假单胞菌HZAU-P1对拟南芥幼苗根系生长的影响示意图；
图2为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后的拟南芥与未处理的对照例植株生长对比图。
图3为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理的Mic-Tom番茄与未处理的对照例植株生长对比图；
图4为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后Mic-Tom番茄花苞统计结果；
图5为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后对Mic-Tom番茄开花的影响；
图6为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后对Mic-Tom番茄果实破色的影响(a：刚转色；b：转色第2天；c：转色第9天)；
图7为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后对Mic-Tom番茄果实色泽的影响；
图8为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后Mic-Tom番茄果实色差值(左)和单果重(右)统计结果；
图9为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后对Mic-Tom番茄根系生长的影响；
图10为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理后Mic-Tom番茄总根长(左)和总根尖数(右)的统计结果；
图11为极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂处理的Mic-Tom番茄与未处理的对照例植株果实数量对比图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
LB液体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠5g溶于1L蒸馏水中，然后121℃灭菌15min，冷取后使用。
LB固体培养基：向LB液体培养基培养基中加入琼脂并使其浓度为15g/L；然后然后121℃灭菌15min。将冷却到约55℃的液体培养基到入培养皿，自然冷却。
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0亚型记载于如下文献中：Lundberg DS,Lebeis SL,Paredes SH,et al.Defining the core Arabidopsis thalianaroot microbiome.Nature.2012；488(7409):86-90。野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia-0亚型在下文中简称拟南芥。
(1)极端东方假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)HZAU-P1的分离、鉴定与保藏。
一、极端东方假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)HZAU-P1的分离
1、在45mL磷酸缓冲液中加入5g根际土样品(采自赣州柑桔所果园中采集了健康的以枳为砧木以纽荷尔为接穗的柑橘根际土壤)，搅拌15min，静止10min，然后取上清液1mL，加入盛有9mL磷酸缓冲液的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从试管中吸取1mL加入另一盛有9mL磷酸缓冲液的无菌试管中充分混匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释的菌悬液。将各稀释梯度取0.1mL菌悬液均匀涂布在LB固体培养基上，28℃恒温静置培养2-3d。
2、完成步骤一后，挑取LB固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上。将筛选到的一株细菌命名为细菌HZAU-P1。
二、细菌HZAU-P1的鉴定
16sRNA序列同源性分析
细菌HZAU-P1的16sRNA与NCBI中的序列进行比对，结果表明，细菌HZAU-P1与假单胞菌属菌株Pseudomonas extremorientalis的同源性最高，达到99.41％。
三、保藏
根据上述1616sRNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化的得到的细菌HZAU-P1鉴定为假单胞菌属。
菌种保存：将极端东方假单胞菌HZAU-P1单菌落接种至LB液体培养基，28℃、200r/min摇床培养8h，得到细菌培养液。将1体积份细菌培养液和1体积份60％(v/v)甘油混合均匀，-80℃保存。
(2)、极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂的制备
1、将实施例1中-80℃保存的菌液在LB固体培养基上活化。
2、挑取LB固体培养基单菌落接种于装有100mLLB液体培养基的灭过菌的锥形瓶(规格为250mL)中，28℃、200r/min培养8h，得到的菌液将OD600nm值调为0.2，该菌液即为制备的极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂。
(3)、极端东方假单胞菌HZAU-P1在促进植物开花中的作用
一、培养基的制备
培养皿的规格：10cm×10cm
1/2MS固体培养基：将2.23g1/2MS基本培养基粉末(Coolaber公司)、15g蔗糖和20g琼脂溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容到1L，调节pH值至5.8，然后121℃灭菌15分钟，将冷却到约55℃的液体培养基到入培养皿，自然冷却后使用。
二、极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂对植物开花的影响
培养条件为：22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx。
1、取拟南芥种子，用75％的酒精溶液处理30秒，再用灭菌水清洗三次，然后用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液处理6min，最后用灭菌水清洗三次。
2、完成步骤1后，将拟南芥种子播种于1/2MS固体培养基上，4℃春化两天后放置在22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx的恒温培养箱中培养7天。
3、挑取完成步骤2的拟南芥幼苗移栽至1/2MS固体培养基中，每个培养基中中放置5株幼苗。分为对照组和处理组。对照组为与每株拟南芥幼苗所对应的1/2MS固培养基下部四分之一处接种5微升LB液体；处理组为与每株拟南芥幼苗所对应的1/2MS固培养基下部四分之一处接种5微升菌剂，处理方式见图。后续竖直培养后，拟南芥根部也不生长至已接菌剂的培养基处(本实验研究菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响)。
4、将完成步骤3的1/2MS固培养基竖直培养18天，观察拟南芥的生长状况。
拟南芥的生长状况如图1、2(左边为对照组，右边为极端东方假单胞菌HZAU-P1处理)。
结果表明，接菌的条件下，在培养基上生长的拟南芥生长良好，侧根数量明显增多，与对照相比幼苗已有开花的迹象。基质栽培的条件下可以发现极端东方假单胞菌HZAU-P1同样可以促进植株生长和开花。由此可见极端东方假单胞菌HZAU-P1在促进植物开花方面起着重要的作用。
(4)、极端东方假单胞菌HZAU-P1在促进Mic-Tom番茄开花和坐果中的应用
一、培养基制备：
培养皿的规格：10cm×10cm
MS固体培养基：将4.46gMS基本培养基粉末(Coolaber公司)、20g蔗糖和3g植物凝胶溶于蒸馏水，然后用蒸馏水定容到1L，调节pH值至5.8，然后121℃灭菌15分钟，冷却后使用。
二、极端东方假单胞菌HZAU-P1菌剂对Mic-Tom番茄开花的影响
培养条件为：22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx。
1、取Mic-Tom番茄种子，用75％的酒精溶液处理30秒，再用灭菌水清洗三次，然后用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液处理6min，最后用灭菌水清洗三次。
2、完成步骤1后，将Mic-Tom番茄播种于MS固体培养基上，4℃春化两天后放置在22℃；14h光照/10h黑暗；光照强度为5000Lx的恒温培养箱中培养，直到番茄幼苗长出2片子叶后进行移栽。
3、将完成步骤2的Mic-Tom番茄幼苗移栽到装有基质土的盆中，每盆1棵，得到20盆Mic-Tom番茄幼苗共20棵。
4、取10盆Mic-Tom番茄，使用灌根法接种OD600nm值为0.2的极端假单胞菌的菌剂，每棵幼苗接种5mL菌剂，每2周接种一次。取另外10盆Mic-Tom番茄幼苗，每两周接种5mL液体LB培养基。共接种4次。
5、观察各处理组之间Mic-Tom番茄生长发育表型，统计植株生长高度如图3，最后用根系扫描仪记录各处理Mic-Tom番茄的根系形态。
6、Mic-Tom番茄花苞数目如图4，开花情况如图5；Mic-Tom番茄果实转色如图6，果实成熟情况如图7，果实成熟后的色差值和单果重如图8，单株产量如表1所示；
表1
单株产量/g
Figure BDA0003404807560000071
Mic-Tom番茄根系形态见图9，根系总长度与总根尖数见图10。
7、结果表明，极端东方假单胞菌HZAU-P1处理下，与对照相比，初始花苞数差异较大，番茄开花时间提前；果实转色时间提前，提早成熟，产量提高；根系长度与总根尖数也有差异。由此可见，极端东方假单胞菌HZAU-P1能够促进植物开花。
8、由图3可看出，与对照相比，HZAU-P1可以促进Mic-Tom番茄植株生长。
9、由图11可看出，与对照相比，随着时间的延长，接种HZAU-P1的Mic-Tom番茄果实数量增多，促进坐果。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.假单胞菌属细菌，其特征在于，为极端东方假单胞菌（Pseudomonasextremorientalis）HZAU-P1，于2021年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211492。
2.权利要求1所述的假单胞菌属细菌在促进植物生长、开花和坐果中的应用。
3.促进植物生长、开花和坐果的方法，其特征在于，具体为采用含有权利要求1所述的假单胞菌属细菌的菌剂处理植物根系。
4.根据权利要求3所述的促进植物生长、开花和坐果的方法，其特征在于，含有假单胞菌属细菌菌剂的OD600nm值为0.2。
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