CN116836813B - 一种生防菌横梗霉及其应用 - Google Patents

一种生防菌横梗霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生防菌横梗霉(Lichtheimiasp.)及其应用，其菌株号为JSAFC 1441，于2023年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40644。该菌株能有效抑制迷宫栓孔菌(Trametesgibbosa)的生长，平板对峙培养抑制率达76.12％。本发明提供的生防菌横梗霉Lichtheimiasp.JSAFC1441能有效抑制迷宫栓孔菌的生长，并具有明显防治迷宫栓孔菌引起的桃树木腐病。

Description

一种生防菌横梗霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，主要涉及一种生防菌横梗霉及其应用。
背景技术
迷宫栓孔菌Trametesgibbosa隶属于担子菌门Basidiomycetes，子实体一年生，无柄盖形，革质，有芳香味；菌盖半圆形至扇形，有明显的同心环带；孢子圆柱形，无色，光滑。生于柞、榆、椴、桃等树木的枯木、倒木、木桩上在东北、华北、西北以及华中地区皆有分布。迷宫栓孔菌是一类重要的木材白色腐朽菌，是木生食用菌段木栽培的重要害菌之一，属木腐菌，引起木材海绵状白色腐朽。迷宫栓孔菌会导致植物木质部变白疏松，质软且脆，腐朽易碎，常导致树势衰弱，叶色变黄或过早脱落，引起产量下降或不结果。
对于植物病害防治，农业防治不能完全消除病原菌，易复发；化学防治易产生农药残留，还可能使病害产生抗性；生物防治既可以高效杀灭病原菌，又不破坏环境，是病害防治未来发展的方向和趋势。而迷宫栓孔菌引起的木腐病防治方法多采用农业防治和化学防治，生物防治的方法较少。而微生物作为绿色防控的有效手段，其在我国农业中的重要作用日益凸显。
大量研究表明，微生物及其制剂对植物具有防病促生作用，因此，在当前提倡绿色生态健康发展背景下，横梗霉作为化学杀菌剂的有效替代品具备大规模应用的潜力。当前对横梗霉病害防控研究主要集中于生物发酵方面，针对病原真菌抗性的横梗霉研究较少，尚无针对病原真菌的横梗霉报道。
综上所述，现有技术还缺少一种预防木腐病的绿色、高效的环境益生菌。
发明内容
本发明的第一目的是提供了一种横梗霉(Lichtheimiasp.)。
本发明的第二目的是提供一种包含横梗霉(Lichtheimiasp.)的液体菌剂。
本发明的第三目的是提供横梗霉(Lichtheimia sp.)在防治迷宫栓孔菌引起的桃树木腐病中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，本发明提供了一种生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)，其菌株号为JSAFC 1441，保藏号为CGMCC No.40644，2023年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的第二方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌包含本发明第一方面所述的Lichtheimiasp.JSAFC 1441的核酸片段。
进一步地，所述核酸片段的碱基序列包括SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO.1:
ATTTATTTTGTGAGAGAAGAAAAAAAAAAGGACAGGTTCCGTAGGTGAACCTGCG
GAAGGATCATTACTGAGAGGTCTCTTTTGTTCCTCACAGTATGTGCAATGTTGGGTC
ACCCTGGTTGACTCTGCCTTTTAGCACTTGGTCTAGTCGAGTAACCATCTCGTGTG
GTGAAGGAAGACTGGATCGAGTCAGCTTGTGCCTAGTAGAGACCCTCCTTTCAGG
AGACTTATTGGGTGAAGCGACCAAGGCATAACCTTTGGGGTTGGTACTAGTACTAG
CACTAGCCCCAGTGGTTTTCAATGAAAAGAATTGATGTATGAAAGTTATTTGTTAAC
TTGAAGACAGTAGTCTTTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA
TCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCGATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGTGAATC
ATCGAGTTCTTGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGTCAATCTACTAGGCACAGTTGTTT
CAGTATCATCCTCACCAATCAACCCAACTTGGGGTTGGAACTGGACTCTTTGACAG
CATTCAGTTGCTCTCATGGTCTTAAATACCAAGTCTTTGTACATTCACATTGTGATTG
TACGGGTGGAAGCACTTTAAACAGTGAGCAACGAGCTTCTTGGGTTGTGGGAACC
CCCAAGTGTTAGTCTTTGAGCGTCGACCTGGTTTCCTACTTGAAACGACTTGAGAA
TGCACTCGCATTCAAGATGACGAAAATCTCACAATCTTGATCTAAATCAACGAGACTTCCCCC。
本发明的第三方面，本发明提供了一种生防菌菌剂，所述生防菌菌剂的活性成分为所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)或所述的工程菌。
本发明的第四方面，本发明提供了所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)、所述的工程菌或所述的生防菌菌剂在抑制迷宫栓孔菌生长中或的应用。
本发明的第五方面，本发明提供了所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)在促进桃树生长方面的应用。
进一步地，所述应用具体为：将制备的生防菌横梗霉JSAFC 1441的孢子悬浮液通过灌根的方式来防治迷宫栓孔菌引起的桃树木腐病。
进一步地，所述生防菌横梗霉JSAFC 1441的孢子悬浮液是按照以下步骤制备：
(1)取工程菌横梗霉JSAFC 1441菌种，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，25℃、65％湿度条件下暗培养5-7d；
(2)无菌条件下，刮取菌丝，用无菌水冲洗菌丝并用纱布过滤；
(3)无菌条件下，用无菌水调整孢子浓度为105/ml。
进一步地，所述孢子悬浮液施用量为5mL/次/7d，持续30d。
本发明提供的生防菌横梗霉Lichtheimia sp.JSAFC 1441能有效抑制迷宫栓孔菌的生长，并具有明显防治迷宫栓孔菌引起的桃树木腐病。
附图说明
图1：Lichtheimia sp.JSAFC 1441的系统发育树。
图2：本发明的生防菌Lichtheimiasp.JSAFC 1441与迷宫栓孔菌对峙培养；
图3：为实施例3中生防菌Lichtheimiasp.JSAFC 1441对迷宫栓孔菌导致的桃树木腐病的影响。
具体实施方式
以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害。
实施例1：Lichtheimiasp.JSAFC 1441的分离、鉴定
1、Lichtheimiasp.JSAFC 1441的分离
取海南石花洞生长状况较好的土壤，从中分离获得Lichtheimiasp.JSAFC 1441，菌落特征如下：在PDA平板培养基上培养，菌落生长迅速，菌落呈白色，菌落表面呈丝绒状，附于培养基表面。
2、Lichtheimia sp.JSAFC 1441分子生物学鉴定
(1)采用TIANGEN公司的试剂盒提取菌株JSAFC 1441的基因组DNA。
(2)分别扩增基因组DNA的ITS基因。DNA扩增采用30μL的反应体积，包含15μL 2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，通用引物ITS4/ITS5各1μL(10μM)，2μL模板DNA和11μLddH2O，PCR扩增程序条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
(3)扩增所得PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物送至南京擎科生物科技有限公司测序，测序结果为：步骤1菌株JSAFC 1441的ITS基因序列为SEQ ID NO.1。
(4)在NCBI数据库网站上比对SEQ ID NO.1序列并建立系统发育进化树，参见图1。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌JSAFC 1441为Lichtheimiasp.，命名为Lichtheimiasp.JSAFC 1441。
表1SEQ ID NO.1序列比对结果
实施例2：Lichtheimiasp.JSAFC 1441对迷宫栓孔菌的抑制效果
(1)在超净工作台上将迷宫栓孔菌的直径为4mm菌饼接种到PDA培养基平板的一侧作为对照组，同时将Lichtheimia sp.JSAFC 1441的直径为4mm菌饼接种到PDA培养基的对称一侧作为实验组；并用只接种迷宫栓孔菌的培养基平板作对照。
(2)将步骤(1)的实验组和对照组培养基于25℃的恒温培养箱中倒置培养，培养条件为光照8h，接着黑暗培养16h。
(3)将步骤(2)的实验组和对照组培养基按上述培养条件人工培养7天后，用平板对峙法法分别测量迷宫栓孔菌菌落半径，并观察Lichtheimia sp.JSAFC 1441对迷宫栓孔菌的抑制效果。
结果如图2所示，空白对照组的迷宫栓孔菌菌落半径为4.90cm；实验组中，经用平板对峙法测定，迷宫栓孔菌病原的平均半径仅为1.17cm，表明Lichtheimia sp.JSAFC 1441对迷宫栓孔菌的抑制效果显著。
实施例3：Lichtheimia sp.JSAFC 1441对迷宫栓孔菌引起桃树木腐病的影响
(1)将菌株Lichtheimia sp.JSAFC 1441和迷宫栓孔菌JSAFC 1020分别接种于直径9cm的培养皿中(内含15ml PDA培养基)，25℃、避光培养7d。
(2)将培养7天的Lichtheimia sp.JSAFC 1441和迷宫栓孔菌JSAFC 1020分别在无菌条件下，刮取菌丝，用无菌水冲洗菌丝并用纱布过滤，之后再调整孢子浓度为105/ml。
(3)选择直径为12cm的盆钵，向每个盆钵中移栽1株长势一致的健康桃树苗(品种为沙红)，试验设置2组(对照组和处理组)，每个处理设置10个重复。对照组为：每个盆钵浇灌5mL的迷宫栓孔菌JSAFC 1020孢子悬浮液；实验组为：每个盆钵浇灌5mL的Lichtheimiasp.JSAFC 1441和5mL的迷宫栓孔菌JSAFC 1020孢子悬浮液。
(4)每2天浇灌各组桃树苗，30d后统计桃树的直径和株高，观察桃树苗根部发育情况。
结果如图3和表2所示。
表2桃树株高和直径统计结果
其中，表中株高、直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从图3和表2数据可知，实验组的株高、直径以及根部发育明显优于对照组，可见Lichtheimia sp.JSAFC 1441对桃树木腐菌有抑制作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)，其特征在于，所述横梗霉(Lichtheimiasp.)的菌株号为JSAFC 1441，保藏编号为CGMCCNo.40644，于2023年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种生防菌菌剂，其特征在于，所述生防菌菌剂的活性成分为权利要求1所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)。
3.权利要求1所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)或权利要求2所述的生防菌菌剂在抑制迷宫栓孔菌生长中的应用。
4.权利要求1所述的生防菌横梗霉(Lichtheimia sp.)或权利要求2所述的生防菌菌剂在促进桃树生长方面的应用，其特征在于，所述应用具体为：将制备的生防菌横梗霉JSAFC1441的孢子悬浮液通过灌根的方式来防治迷宫栓孔菌引起的桃树木腐病，所述孢子悬浮液的施用量为5mL/次/7d，持续30d。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生防菌菌横梗霉JSAFC 1441的孢子悬浮液按照以下步骤制备：
(1)取生防菌横梗霉JSAFC 1441菌种，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，25℃、65％湿度条件下暗培养5-7d；
(2)无菌条件下，刮取菌丝，用无菌水冲洗菌丝并用纱布过滤；
(3)无菌条件下，用无菌水调整孢子浓度为105/ml。
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