CN116042492B

CN116042492B - 一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用

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Publication number: CN116042492B
Application number: CN202310206861.4A
Authority: CN
Inventors: 张德珍; 亓延凤; 李婷婷; 潘好芹; 代惠洁; 王翠翠; 乔宁; 迟文娟; 刘杰; 丁怀艺; 王馨
Original assignee: Weifang University of Science and Technology
Current assignee: Weifang University of Science and Technology
Priority date: 2023-03-07
Filing date: 2023-03-07
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2043-03-07
Also published as: CN116042492A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用，该短小芽孢杆菌于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：M 20221960；分类命名为：短小芽孢杆菌Bacilluspumilus。本发明从土壤中分离鉴定的短小芽孢杆菌对番茄灰叶斑病原菌菌株的防治效果优异，对番茄灰叶斑病菌具有高效、广谱抑制作用，可应用于番茄灰叶斑病的防治，作为番茄灰叶斑病的生物防治制剂用菌有良好的应用前景。

Description

一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

番茄灰叶斑病是番茄栽培过程中的重要叶部真菌病害之一，该病害主要由番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）侵染引发。番茄匍柄霉的宿主范围广泛，可侵染如番茄、辣椒、茄子、芦笋、生菜等蔬菜作物并引起病害。病害通常在温暖高湿条件下发生和发展，主要通过损伤叶片，减少植株光合产物的积累，从而降低蔬菜产品的品质和产量。由于抗病品种的缺乏，目前番茄生产上主要依赖化学药剂防治番茄灰叶斑病，但种类有限的几种化学杀菌剂的长期使用，不仅使病原菌产生耐药性，导致防效下降，同时还面临农药残留、农产品和环境污染等问题。相比之下，生物防治技术以其安全、无毒、环保等特点，在防治蔬菜病害方面优势凸显，而有针对性地寻找优质高效的生防菌菌株，是开发和使用生防菌剂及其相关产品的技术核心。

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）是一种广泛分布于自然环境中的细菌，也是一种植物体内常见的内生菌，对环境友好，对人畜无毒无害；短小芽孢杆菌可以产生内生芽孢，抗逆性强，用它生产的活菌生防制剂稳定性好、储存期长；同时，短小芽孢杆菌可以通过竞争营养和空间位点、分泌抗菌物质和诱导植物抗病性等多种方式防治植物真菌病害，所以，短小芽孢杆菌是一种理想的生防微生物资源。

因此，寻求可以应用于番茄灰叶斑病防治的短小芽孢杆菌菌株是本领域技术人员希望解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种短小芽孢杆菌，其为从土壤中分离提取，于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：M 20221960；分类命名为：短小芽孢杆菌Bacilluspumilus。

本发明的目的之二在于提供一种如上所述的短小芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。

进一步，所述病害由真菌引发，所述真菌为番茄匍柄霉。

进一步，所述病害为番茄灰叶斑病。

本发明从山东寿光栽培番茄的温室大棚内采集番茄根际土壤样品，采用土壤稀释法将其稀释至适宜浓度，将稀释后的样品涂布在LA固体平板上，37℃倒置培养2～3d，待平板上有细菌菌落长出，向平板上喷洒浓度为1×10⁸个/mL的白地霉孢子液，于28℃培养3d。挑选能对白地霉产生抑菌圈的、具有菌落表面粗糙皱缩不透明、呈灰白色或浅黄色、菌落的边缘呈波纹状等芽孢杆菌典型症状的细菌菌落，在LA固体平板上划线纯化。通过菌落形态、革兰氏染色反应、接触酶反应、V-P反应、淀粉酶反应等初步判断获得菌株为芽孢杆菌，将该菌株命名为CE-1,通过构建系统发育树，菌株CE-1与B. pumilusAUES51菌株（基因序列号：HM585092）亲缘关系最近，同源性达到了99.96%，为短小芽孢杆菌。

【生物保藏材料】

保藏中心：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国.武汉.武汉大学；

登记入册编号：CCTCCNO：M 20221960；

上述请求保藏的生物材料（株）附有建议的分类命名：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus；

该生物材料（株）已于2022年12月13日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。

本发明的优点在于：本发明从土壤中分离鉴定的短小芽孢杆菌CE-1对番茄灰叶斑病原菌菌株的防治效果优异，表明本发明的短小芽孢杆菌CE-1菌株对番茄灰叶斑病菌具有高效、广谱抑制作用，可应用于番茄灰叶斑病的防治，作为番茄灰叶斑病的生物防治制剂用菌有良好的应用前景。

附图说明

图1为gyrB基因片段PCR扩增电泳图谱；

图2为基于gyrB基因序列的系统发育树；

图3为番茄灰叶斑病原菌的菌落形态和孢子形态；

图4为cmdA基因片段PCR扩增电泳图谱；

图5为基于cmdA基因序列的系统发育树；

图6为短小芽孢杆菌CE-1和对照组对番茄灰叶斑病菌的抑菌作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一、芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定

1、试验：

从山东寿光栽培番茄的温室大棚内采集番茄根际土壤样品，采用土壤稀释法将其稀释至适宜浓度，将稀释后的样品涂布在LA固体平板上，37℃倒置培养2～3d，待平板上有细菌菌落长出，向平板上喷洒浓度为1×10⁸个/mL的白地霉孢子液，于28℃培养3d后，挑选能对白地霉产生抑菌圈的、具有菌落表面粗糙皱缩不透明、呈灰白色或浅黄色、菌落的边缘呈波纹状等芽孢杆菌典型症状的细菌菌落，在LA固体平板上划线纯化。利用革兰氏染色、接触酶反应、V-P 反应、淀粉酶反应初步鉴定细菌的分类。

具体地，利用革兰氏染色试剂盒进行染色，于显微镜下观察，若细菌在染色后呈紫色则为革兰氏阳性菌。

具体地，将10%过氧化氢直接注入斜面，观察是否产生气泡。有气泡为阳性反应，无为阴性反应。

具体地，取分离菌培养液和质量分数为40%的NaOH溶液等量混合均匀，加少许肌酸(0.5-1.0mg)后，剧烈摇晃，2-10min后观察是否出现红色，若出现红色则为V-P阳性反应。

具体地，取分离菌培养液加入淀粉生化试管中，置于30℃恒温培养中培养24h后，向淀粉生化管中滴加碘液，变蓝为阴性反应，不变蓝为阳性反应。

2、结果

利用土壤稀释法获得的菌株，可以抑制白地霉的菌丝生长而产生抑菌圈，在LA固体平板上产生的菌落表面粗糙不透明，污白色或微带黄色，菌落的边缘呈波纹状。挑选能产生较大抑菌圈的5个菌株（命名分别为CE-1、ST-1、F1-7、T10-19、F1-3）进行革兰氏染色和其它生理生化特性分析，结果显示，5个菌株均为革兰氏阳性菌，接触酶反应、V-P反应、淀粉酶反应均为阳性。初步判断获得菌株为芽孢杆菌。

二、芽孢杆菌gyrB基因序列扩增及分析

1、试验：

将初步鉴定获得的芽孢杆菌菌株在LA平板上划线活化，接种于LB液体培养基中，于37℃，200rpm/min摇床振荡培养24h。采用离心法从发酵液中获得芽孢杆菌菌体，利用革兰氏阳性细菌DNA提取专用试剂盒（Solarbio）提取芽孢杆菌总DNA。

以提取的芽孢杆菌总DNA为模板，利用根据张华梦等（水稻纹枯病生防细菌筛选及其与病原菌侵染垫形成的关系，2021）设计的芽孢杆菌gyrB基因序列扩增引物对其进行PCR扩增，获得的PCR产物送测序公司进行序列测定。测序结果通过Blast进行同源性比对分析。

将芽孢杆菌的测序结果在NCBI数据库进行序列比对，找出与待测菌株的DNA片段序列最接近的序列，下载保存对应的DNA序列，并记录菌株的学名和基因登记序列号。经DNAMAN 6.0软件的比对分析，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，根据系统发育树的构建结果来进一步确定各待测菌株的分类地位。

2、结果：

以待测菌株的基因组总DNA为模板，用芽孢杆菌gyrB基因序列引物进行扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，前述5个待测菌株PCR产物的检测结果如图1所示，根据Marker的相对位置初步判断，PCR扩增获得的DNA片段长度在750-1000bp之间，与芽孢杆菌gyrB基因的目的片段长度相近。

通过构建系统发育树获得5个芽孢杆菌菌株的遗传进化关系如图2所示。结果表明， CE-1菌株与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌Bacilluspumilus部分菌株的序列同源性较高，与短小芽孢杆菌Bacillus pumilusAUES51菌株（基因序列号：HM585092）亲缘关系最近，同源性达到了99.96%，因此，将CE-1菌株鉴定为短小芽孢杆菌。

三、番茄灰叶斑病菌的分离培养和形态学观察

1、试验：

从番茄种植区田间采集具有典型灰叶斑病特点的番茄病叶，对不同地区来源的病叶进行编号记录，利用组织分离法分离病原菌。将病叶表面消毒后，剪取病叶上的病健交接处接种到V8培养基上，于25℃恒温培养箱中倒置培养，待7d左右长出菌落后，用灭菌的打孔器从菌落的边缘打取新生长的菌丝转接到新的V8培养基上，多次转接获得病原菌的纯培养菌株，编号保存。

将病原菌回接到番茄叶片，观察叶片的病害发生症状；观察病原菌在V8培养基上生长的菌落形态、分生孢子的形态、大小及颜色，并利用照相显微镜（奥林巴斯）进行分生孢子照片采集。

2、结果

通过对来自全国不同地区的番茄田间病叶样品进行分离纯化后，选取4个来源于不同地区的番茄灰叶斑病菌菌株St-NN（采自广西南宁）、St-LN（采自辽宁沈阳）、St-CE（采自山东昌邑）和St-SG（采自山东寿光）进行培养和观察，菌落和分生孢子形态如图3所示。病菌在V8培养基上菌落生长良好，菌丝在生长早期呈乳白色，生长密集，菌落有轮纹形状，边缘整齐，可产生棕黄色色素，能产生载孢体及分生孢子。分生孢子褐色，分生孢子大小约为（20～75）μm×（10～30）μm。具1-6个横隔膜和若干纵隔膜，于横隔膜分隔处缢缩。按照柯赫氏法则用4个菌株的孢子回接健康的番茄叶片后，可产生与番茄灰叶斑病相同的症状。初步判定为番茄灰叶斑病病菌。

四、番茄灰叶斑病病菌cmdA基因序列的扩增和分析

1、试验

培养并收集番茄灰叶斑病病菌St-NN、St-LN、St-CE和St-SG菌株的菌丝，加液氮研磨成粉末，利用植物总DNA提取试剂盒（全式金）分别提取4个病原菌菌株的总DNA。利用根据施兆荣等[甘肃省甜瓜黑斑病菌（Alternariatenuissima）的分离鉴定，2021]设计的cmdA基因序列扩增引物进行PCR扩增，获得的PCR产物进行测序后进行Blast（NCBI）比对分析。找出与待测菌株的DNA片段序列最接近的序列，下载保存对应的DNA序列，并记录菌株的学名和基因登记序列号。经DNAMAN6.0软件的比对分析，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，根据系统发育树的构建结果来进一步确定各待测菌株的分类地位。

2、结果

以4个菌株的基因组DNA为模板，用cmdA基因序列引物进行扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据Marker的相对位置初步判断待测目的片段的大小，检测结果如图4所示。PCR扩增获得的DNA片段长度接近750bp，与目的片段的长度相符。

通过在NCBI网站上使用Blast功能进行比对，St-NN、St-LN、St-CE和St-SG这4个菌株属于匍柄霉属（Stemphyliumspp.）真菌。

利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，4个菌株的进化关系如图5所示。结果表明，这4个菌株与番茄匍柄霉（Stemphyliumlycopersici）的部分菌株的序列同源性较高，与番茄匍柄霉S.lycopersiciLJ 1609270201菌株（基因序列号：MG742412）的亲缘关系最近，同源性达到了99.85%，因此，将这4个病原菌菌株鉴定为番茄匍柄霉。

五、短小芽孢杆菌对番茄灰叶斑病菌的抑制作用测定

1、试验

采用平板对峙培养法，测定芽孢杆菌对番茄匍柄霉菌丝生长的抑制作用。具体如下：在直径9cm的V8培养基上的中心点接种番茄匍柄霉的菌饼（0.5cm），在平板上距离中心2.5cm的上下左右四个点上接种短小芽孢杆菌菌液各5μL，平板于28℃培养5-7d，以在四个点上滴加5μL无菌培养液作为对照。利用十字交叉法测量番茄匍柄霉菌落的直径，计算芽孢杆菌对番茄匍柄霉菌的抑菌率，采用如下公式计算：

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%；

做3次重复试验。

2、结果

采用十字交叉法测定对峙培养的番茄灰叶斑病菌菌落的直径，按照上述公式计算芽孢杆菌对番茄匍柄霉菌的抑菌率，从前述分离出的芽孢杆菌菌株中筛选出一株短小芽孢杆菌CE-1。CE-1菌株与4株番茄灰叶斑病菌菌株的对峙结果见如下图6和表1所示。

由图6可见，在相同的培养条件下，4株番茄灰叶斑病菌菌株在对照组（CK）平板上生长良好，菌丝布满培养基的表面；而在与短小芽孢杆菌CE-1对峙生长的平板上，菌丝的生长都受到了显著的抑制，仅局限在平板中间较小的区域，说明短小芽孢杆菌CE-1对4株番茄灰叶斑病菌菌株均表现出显著的抑制效果。

通过表1可见，本发明分离鉴定的短小芽孢杆菌CE-1对4个来自全国不同地区的番茄灰叶斑病原菌菌株的防治效果均超过75%。表明短小芽孢杆菌CE-1菌株对番茄灰叶斑病菌具有高效、广谱抑制作用，可应用于番茄灰叶斑病的防治。

表1短小芽孢杆菌CE-1对番茄灰叶斑病菌的抑菌率

六、短小芽孢杆菌对番茄灰叶斑病的防治效果测定

1、试验

选择长势一致、健康的金棚一号番茄苗24株，随机分成2组，每组12株。在每株番茄叶片上喷施接种等量的番茄灰叶斑病菌孢子液（浓度为1×10⁵CFU/mL），保湿培养1d后，一组在每片叶子上喷施浓度为1×10⁸CFU/mL的生防短小芽孢杆菌CE-1的菌悬液，每片叶子均匀喷洒菌液至均匀欲滴而不落，另一组以喷施等量无菌水作对照组（CK），在25℃，湿度大于90%的人工育苗室中培养7d后调查病情指数并计算防治效果。设置3次重复试验。

病情指数=∑（各级值×各级病叶数）/（调查总叶数×最高级值）×100%。

防治效果（%）=（对照组病情指数–处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。

2、结果

在接种病原菌7d后调查发病情况，并通过公式计算发病率、病情指数和相对防效，结果见表2。

表2 短小芽孢杆菌CE-1对番茄灰叶斑的防治效果

分组	发病率/%	病情指数	相对防效/%
				CK	83.33 a	37.26 a	—
CE-1	41.67 b	14.52 b	61.03

（注：表中同列数据后不同小写字母表示Duncan多重极差检验结果在0.05 水平上差异显著。）

喷施无菌水的对照组发病率为83.33%，病情指数为37.26；而喷施CE-1菌液的处理组发病率为41.67%，病情指数为14.52，均显著低于对照组；与对照组相比，施用CE-1菌液的相对防效为61.03%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种短小芽孢杆菌，其特征在于，于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：M 20221960；分类命名为：短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus。

2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌，其特征在于，从土壤中分离提取。

3.一种如权利要求1或2所述的短小芽孢杆菌在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述病害由真菌引发，所述真菌为番茄匍柄霉。

4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述病害为番茄灰叶斑病。