CN113061554A - 一株防治香蕉枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株防治香蕉枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及应用，该菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)，已于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号：GDMCC 61590。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的用途是其在防治香蕉枯萎病中的应用，经过平板对峙实验表明该菌株对香蕉枯萎病原菌有很好的抑制作用，可以有效地控制香蕉枯萎病，减少损失，是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株，具有抑菌效果好的特点，为我国香蕉产业的发展提供帮助。
Description
技术领域
本发明属微生物领域，涉及一种芽孢杆菌及应用，具体的说，涉及一株防治香蕉枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及应用。
背景技术
香蕉(Musa nana Lour.)是芭蕉科芭蕉属植物，是人类最重要和最古老的粮食作物之一，也是一些发展中国家和地区重要的粮食作物。近年来香蕉产业面临着多种病虫害的威胁，其中由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的香蕉枯萎病(又称为巴拿马病、叶黄病)是主要的病虫害之一。该病的病原菌活性极强，不仅会随着土壤、水以及农具进行传播，在没有香蕉生长的土壤里也能存活长达30年(Ploetz,2006)，因此香蕉枯萎病是世界香蕉生产中面临的最为严重的病害之一，也严重制约着我国香蕉产业的发展。
目前，香蕉枯萎病主要通过化学防治、抗性品种选育、轮作种植、生物防治等方式控制。但化学农药很难在土壤中起到持续控病的作用，而且长期使用会使得土壤结块，影响生态环境。理论上，选育抗性品种是控制香蕉枯萎病的根本途径，但香蕉为无性繁殖作物，抗病品种选育进程较慢，而且现已有的抗病品种产量低、植株高，品质较差。轮作种植可以减轻枯萎病的发生，但需要的周期较长，而生物防治虽起步较晚，但因其具有高效、省工、对土壤无副作用等特点，逐渐成为预防香蕉枯萎病的主要措施之一。
目前已经发现了香蕉枯萎病菌的四个生理小种。其中，香蕉枯萎病四号小种(尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种，Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,FocTR4)不仅能够侵染1号和2号生理小种所能侵染的所有香蕉品种，也能够侵染对其他小种具有抗性的香蕉品种，是目前发现的四个生理小种中致病力最强的病菌。研究人员在对于抗Foc TR4的拮抗菌筛选上取得了一定的进展，Yang等发现木霉菌菌株有消除Foc TR4传播的潜力，勇智发现放线菌对Foc TR4有良好的抑制作用，孙杰等发现由绿色木霉和解淀粉芽孢杆菌制成复合生防菌剂能有效抑制Foc TR4的增殖。经检索，目前还没有关于贝莱斯芽孢杆菌对香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带四号小种(Foc TR4)的具有抑制作用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株防治香蕉枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及应用。
一株贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus VelezensisB18)，已于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号：GDMCC 61590。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌株，筛选分离于木薯根部土壤中，经形态学、培养性状、常规生理生化和DNA序列鉴定，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus Velezensis)小孢变种，是贝莱斯芽孢杆菌的一个新菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的基本生物学特性为：
在PDA上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面湿润光滑，不透明呈浅黄色；在LB上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色；在311上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色；在YPD上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色。通过革兰氏染色和淀粉水解实验验证，结果表明B18革兰氏染色和淀粉水解实验均为阳性。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的用途是其在防治香蕉枯萎病中的应用。进一步地，在防治由Foc TR4引起的香蕉枯萎病中的应用。
以本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)为活性成分的生物制剂也属本发明的保护范围。需要的时候，该制剂可以包含生物制剂制备的常用载体和辅料。
本发明通过平板对峙实验研究贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)对香蕉枯萎病的生防效果，实验结果表明贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)对香蕉枯萎病原菌有很好的抑制作用。表明该菌株是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株。
本发明通过对木薯根部土壤中的微生物进行分离、纯化，筛选出对Foc TR4有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)，经过平板对峙实验表明该菌株对香蕉枯萎病原菌有很好的抑制作用，可以有效地控制香蕉枯萎病，减少损失，是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株，具有抑菌效果好的特点，为我国香蕉产业的发展提供帮助。
附图说明
图1：显微镜下贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的形态特征。
图2：贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)在不同培养基上的形态特征。
图3：贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)凝胶电泳图。
图4：贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的16S rDNA系统发育树图(注:分枝处数值表示Bootstrap值；0.01表示两个核苷酸遗传距离)。
图5：贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌株对病原菌Foc TR4菌丝生长的抑菌效果。A：抑制实验；B：对照(无菌生理盐水)。
图6：贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌株在盆栽实验中的生防效果。A：清水空白对照；B：对照组；C：实验组。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一 菌株的筛选及其鉴定
1、菌株的筛选分离
菌株分离参考了游晓朝(2018)的方法。在长势良好的木薯根际取土壤样品带回实验室4℃保存。取土壤样品2g加入有玻璃珠的无菌锥形瓶中，再加入20mL无菌生理盐水，放入摇床内28℃，250r/min振荡20min，静置5min。取上清液采用十倍稀释法依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5浓度，每个浓度分别吸取100μL涂布于LB培养基上，涂布均匀，每个浓度重复三次，平板倒放，置于37℃培养箱培养。待有菌落生长时，在无菌条件下向培养皿喷洒新鲜的Foc TR4孢子悬浮液，继续培养，约2d后挑出培养皿内周围出现明显抑菌圈的菌体，采用平板画线分离法进一步划线分离纯化(挑单菌落接种到LB培养基中放入37℃恒温培养箱中培养2-3天后，再挑出单菌落，同时喷洒Foc TR4孢子悬浮液确定其对菌丝的抑制效果)；重复纯化过程，直到在划线尾端挑出纯净的单菌落，并将单菌落接出最后采用平板画线分离法划5个LB平板，37℃恒温培养箱中培养2-3天后获得具有抑制作用的菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)，已于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号：GDMCC61590。
2、菌株形态鉴定
2.1在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，无菌接种环沾取贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)在无菌水中混匀，盖玻片贴边盖好，用滤纸吸去盖玻片边缘多余的水分，放置在显微镜的载物台上，结合10×目镜及100×物镜观察细胞形态，并用软件TC apture对其进行拍照，如图1所示。可观察出贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus VelezensisB18)成短杆状细胞体，产芽孢，芽孢呈卵圆状。
2.2配置不同的YPD、311、LB、PDA固体培养基，灭菌冷却倒板后，超净工作台中挑取贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)分别接种在这些培养皿上，每实验设置三个重复。观察拮抗菌B18在这些平板上的菌落形态。如图2所示，贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌落在PDA上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面湿润光滑，不透明呈浅黄色(A)；在LB上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色(B)；在311上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色(C)；在YPD上的生长形态特征：菌落边缘不规则，表面干燥皱褶，不透明呈浅黄色(D)。
3、菌株的分子生物学鉴定
生理生化的鉴定参考了东秀珠等(2001)的方法。基因组的提取采用细菌基因组提取试剂盒(
TIANamp Bacteria DNA Kit)提取菌株的基因组DNA。用16S rDNA通用引物27F(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’)和1492R(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’)对菌株基因组DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳后，使用凝胶成像系统GIS1D拍照(图3)，与15000DL的DNA Maker比对发现16S rDNA基因在长度1000-2500bp之间。与DNA maker比对通过后送华大基因测序，所获得的碱基序列经过Bio edit软件拼接得到其16SrDNA的部分有效序列长度为1 425bp，于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST同源序列检索，并用MEGA6.06软件构建系统发育树图，如图4所示。结果表明菌株的16S rDNA序列与贝莱斯芽孢杆菌相似性为99％，结合形态学、生理生化特征及16S rDNA将菌种鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus Velezensis)。
实施例二 菌株对病原菌Foc TR4的抑菌效果测定
用接种环在311平板上挑取贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)的单菌落于311液体培养基的三角瓶中，37℃，250r/min振荡培养14-16h。吸取1mL于1.5mL离心管中12000r/min离心5min。收集上清液备用，沉淀中加入1mL无菌生理盐水制备菌悬液振荡器充分震荡后，备用。在PDA固体培养基中央放置直径为6mm的枯萎病病原菌Foc TR4的菌饼，菌饼周围约20mm处打二个直径为6mm的孔，每个孔内加入50μL的菌悬液，以无菌生理盐水为对照，每处理重复9次。28℃恒温培养72h，采用十字交叉法用直尺测量菌饼生长直径。
菌饼增长直径(mm)＝菌饼生长直径-6mm
抑菌率(％)＝(对照组菌饼增长直径-处理组菌饼增长直径)/对照组菌饼增长直径×100％
通过平板对峙实验测定了菌株贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)对枯萎病病原菌Foc TR4的抑制效果。检测发现贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus VelezensisB18)生长周围无枯萎病病原菌Foc TR4的菌丝生长，对病原菌Foc TR4有显著的抑菌效果(图5A)，按照抑菌率计算公式统计数据，使用DPS统计分析发现贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌悬液对枯萎病病菌Foc TR4的抑菌效果极显著，经Excel计算出菌悬液对菌丝生长抑制率为44.17％。
实施例三 菌株在盆栽实验中的生防效果
购买市售巴西蕉幼苗进行盆栽生防效果实验，将苗连土一起从塑料盆中拿出，移栽入内径17cm、底径13.7cm、高18.8cm的花盆内。实验设定三个处理：1.空白处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后，用蒸馏水浸泡幼苗30min，移栽入花盆内浇灌200mL清水；2.对照组处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后将其用浓度为1×106CFU/mL的病原菌(Foc TR4)孢子悬浮液浸泡30min，移栽入花盆内，浇灌200mL 1×106CFU/mL的病原菌孢子悬浮液；3.实验组处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后，用注射器针头轻轻刮伤主根表面至露出根部髓质，小心挑选两条根部各刮出一处伤口，将伤根后的巴西蕉幼苗根部用浓度为1×106CFU/mL的病原菌(FocTR4)孢子悬浮液浸泡30min，移栽入已提前两天浇灌过1×108CFU/mL贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌悬液的花盆内，再浇灌100mL 1×106CFU/mL的病原菌孢子悬浮液和100mL 1×108CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)菌悬液。每处理10盆，设置三次重复。
香蕉枯萎病按陈宇丰(2015)的分级标准：0级，无病叶，健株；1级，有25％的黄化病叶；3级，有25％-50％的黄化病叶；5级，有50％-90％黄化的病叶；7级，叶片全部黄化，植株死亡。
香蕉病情指数及防病效果计算：
病情指数＝∑(各级病株数×该病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100
防病效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
香蕉幼苗移栽入盆里面后第60天，三组处理效果如图6所示，，统计病叶数，以及香蕉枯萎病的分级情况(表1)。根据陈丰宇(2015)的计算公式，只接病原菌的对照组病情指数为78，接种贝莱斯芽孢杆菌B18作为拮抗菌的实验组病情指数为25，空白组病情指数为20，计算得其生防效果为67.9％，表明贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)具有较强的防治效果，可以有效地控制控香蕉枯萎病，减少损失，是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株。
表1香蕉枯萎病分级统计
| 项目 | 0级/株 | 1级/株 | 3级/株 | 5级/株 | 7级/株 | 总计/株 |
| 空白组 | 16 | 12 | 2 | 0 | 0 | 30 |
| 对照组 | 0 | 0 | 5 | 13 | 12 | 30 |
| 实验组 | 12 | 10 | 6 | 2 | 0 | 30 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus VelezensisB18)，已于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC 61590。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)在防治香蕉枯萎病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌B18(BacillusVelezensis B18)在防治由Foc TR4引起的香蕉枯萎病中的应用。
4.一种防治香蕉枯萎病的生物制剂，其特征在于：其活性成分为权利要求1中所述的保藏编号：GDMCC 61590的贝莱斯芽孢杆菌B18(Bacillus Velezensis B18)。
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