CN114250180B - 抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌lzt14及其应用 - Google Patents

抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌lzt14及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用，属于植物采后病害防治技术领域。所述菌株从福州大学荔枝树周围土壤样品中分离筛选得到，已于2021年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23150。该菌株抑菌谱广、且可应用于香蕉采后病害预防和贮藏保鲜。该菌株的使用方法为：菌株活化，洗涤后重悬；将菌悬液喷洒于香蕉表面，风干，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，恒温恒湿贮藏。香蕉体内试验结果表明，在采后28℃，80%相对湿度环境中储藏时，该菌株可以明显降低香蕉的病情指数，生防应用前景良好。

Description

抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用
技术领域
本发明属于植物采后病害防治技术领域，具体涉及一株抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用。
背景技术
香蕉是我国重要的经济作物，我国作为世界香蕉生产的第三大国家，2019年产量达到1166万吨。香蕉极具药用价值，果肉富含类黄酮和维生素等具有抗氧化活性的物质，能够减少自由基堆积，延缓衰老和预防心血管疾病；香蕉皮还能用于治疗例如烧伤、腹泻、糖尿病等疾病。但香蕉在采收和贮藏的过程中容易遭受病原菌的侵染，造成品质劣变，经济损失严重。目前，香蕉采后病害主要有炭疽病、焦腐病和轴腐病等，其中以炭疽病造成的香蕉采后和贮藏侵染最为严重。香蕉炭疽病由香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)引起，病害初期形成黑色小圆点，后期病斑扩大，病斑处下陷，产生橙红色孢子，病害一旦发生，较短时间内便会覆盖整个香蕉果实表面，果实变软甚至腐烂。
目前，对于采后香蕉炭疽病的预防仍以化学预防为主，然而化学药剂的长期使用，易导致农药残留及病原菌产生抗药性等问题的产生。生物预防是目前预防植物采后病害的发展方向之一，其中微生物拮抗菌具有次级代谢产物丰富，因对环境友好、对人类健康安全等优点而备受关注。
本发明中的贝莱斯芽孢杆菌LZT14能够能显著抑制黄曲霉、新壳梭孢菌、镰刀菌属、拟盘多毛孢属、香蕉炭疽菌、香蕉盘长孢菌、枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌的生长，抑菌广谱性强，且能明显降低香蕉采后病害的发生。故为更好地研究并利用该菌株预防香蕉病害提供依据，并为实现微生物保鲜剂的工业化应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术难题，提供一株可抑制香蕉采后病害、抑菌谱广、效果稳定的贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一株抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14，所述菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LZT14（Bacillus velezensis LZT14），已于2021年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 23150。
进一步的，上述一株贝莱斯芽孢杆菌LZT14，是从福州大学校区内荔枝树周围土壤样品中筛选分离到的，该菌株对黄曲霉、新壳梭孢菌、镰刀菌属、拟盘多毛孢属、香蕉炭疽菌、香蕉盘长孢菌、枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌具有抑制效果。
本发明还提供了上述一株贝莱斯芽孢杆菌LZT14在香蕉采后病害预防和贮藏保鲜中的应用。
进一步的，上述香蕉采后病害为香蕉炭疽病。
进一步的，上述一株贝莱斯芽孢杆菌LZT14在香蕉采后病害预防和贮藏保鲜中的应用按照以下步骤进行：将贝莱斯芽孢杆菌LZT14菌悬液喷洒于香蕉表面，风干，贮藏。
进一步的，上述贝莱斯芽孢杆菌LZT14菌悬液的制备方法为，将贝莱斯芽孢杆菌LZT14用LB固体培养基活化，挑取单菌落至LB液体培养基里，于37℃，180r/min条件下培养12h，8000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍后，用0.2 mol/L pH=7.0的PBS缓冲液将菌体重悬并调整菌悬液浓度为1.0×108 cell/mL。
进一步的，上述喷洒菌悬液后的贮藏方法具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，于28℃、80%HR环境贮藏。
进一步的，上述贝莱斯芽孢杆菌LZT14应用于香蕉采后病害预防和贮藏保鲜，能有效延长香蕉采后贮藏期。
本发明的有益效果在于：
与现有技术相比，本发明公开提供了一株贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用，所述贝莱斯芽孢杆菌LZT14抑菌谱广，对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果；体内实验结果表明，在香蕉采后28℃、80%HR环境中储藏时，喷洒贝莱斯芽孢杆菌LZT14菌悬液可以有效抑制香蕉炭疽菌对香蕉果实的侵染，延长香蕉的采后货架期，采后生防应用前景良好。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌LZT14的菌落形态图。
图2为贝莱斯芽孢杆菌LZT14的革兰氏染色图。
图3为贝莱斯芽孢杆菌LZT14 16S rDNA Dl/D2区核酸序列进化关系图。
图4为贝莱斯芽孢杆菌LZT14的广谱性效果图。A：黄曲霉；B：新壳梭孢菌；C：镰刀菌属；D：拟盘多毛孢属；E：香蕉炭疽菌；F：香蕉盘长孢菌；G：枇杷胶孢炭疽菌；H：枇杷尖孢炭疽菌。
图5为贝莱斯芽孢杆菌LZT14对香蕉果实储藏期间的保鲜效果图。
图6为贝莱斯芽孢杆菌LZT14对香蕉果实储藏期间病情指数的影响。“*”代表差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
本发明实施公开了一种贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用。
供试土壤样本采集自福州大学校区内荔枝树周围土壤，用LB固体培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g溶于蒸馏水并定容至1 L)分离、纯化菌株。供试的黄曲霉 (Aspergillus flavus)、新壳梭孢菌 (Neofusicoccum parvum)、镰刀菌属 (Fusarium sp)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、香蕉炭疽菌 (Collectotrchum musae)、香蕉盘长孢菌(Gloeosporium musarum Cooke et Mass)、枇杷胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、枇杷尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum)等8株病原菌由福建省福州大学应用微生物实验室保存并提供，菌株保存和活化均采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基。供试香蕉采自摘自福建省漳州市天宝镇，并于当天运至实验室，挑取大小均匀、没有病斑和机械损伤的青香蕉作为试验材料。
病情指数分级标准。0级：病斑面积0；1级：病斑面积小于25%；2级：病斑面积25%~50%；3级：病斑面积50%~75%；4级：病斑面积大于75%。
计算公式为：病情指数＝[Σ(感病级别×该级果实数)/(总果实数×最高感病级别)]×100%。
利用统计分析软件SPSS.20的独立样本T检验分析比较生防菌株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis LZT14对香蕉采后储藏期间病情指数的差异显著性。
实施例1 Bacillus velezensis LZT14鉴定
1、LZT-14的筛选：
土样采集：使用无菌手套将福州大学校区内荔枝树周围土壤样品采集至无菌广口瓶中后4℃冷藏保存。
菌株分离纯化：取5.0 g土样，将其溶于0.2 mol/L pH=7.0的灭菌PBS缓冲液中，在180rpm、28℃条件下孵育30min，然后取100μL上清液于LB固体培养基上进行涂布，在28℃的培养箱中孵育24h后，挑取单菌落在LB固体培养基上三区划线纯化。
菌株筛选：用打孔器分别打取直径为7mm的香蕉炭疽菌 (Collectotrchum musae)菌饼接种于PDA培养基平板中央，在距离菌饼25mm处等距离取4个点打孔，其中2个孔内各添加30 μL菌液（菌液为将纯化得到的菌株在LB液体培养基中培养，并调节浓度至1.0×108 cell/mL所得），另外两个孔中各添加30 μL无菌水作为对照。观察抑菌带宽，选取抑菌带宽最大的菌株进行保藏以及鉴定，将该菌株命名为LZT14。
2、LZT14形态学特征
筛选得到的 LZT14菌株用LB液体培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g溶于蒸馏水并定容至1L)，于37℃，180r/min条件下培养12h，在LB固体培养基平板上划线，37℃培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。如图1所示，菌落为乳白色、边缘呈锯齿状、表面粗糙干燥、质地均匀、易挑起。
用接种环在上述LB固体培养基上挑起一环LZT14，涂抹于载玻片中央的无菌水中，固定干燥后对其进行革兰氏染色，如图2所示，菌体呈短杆状，颜色呈蓝紫色，判定菌株LZT14为革兰氏阳性菌。
3、LZT14的分子遗传学鉴定
以通用正向引物27F（SEQ ID NO.1）: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和反向引物1492R（SEQ ID NO.2）: 5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’ 对菌株PTL16的16S rDNA D1/D2区核酸序列(SEQ ID NO.3)进行PCR扩增，测序结果在NCBI数据库中进行比对，下载同源性高的基因序列。将所有的序列导入MEGA5软件使用Construct/Test Neighbor-Joining Tree法构建系统进化树(见图3)，确定筛选到的LZT14菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
实施例2菌株Bacillus velezensis LZT14抑菌性检测
将活化后的贝莱斯芽孢杆菌LZT14(1.0×108 cell/mL)按1%(v/v)的接种量接种到LB液体培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g溶于蒸馏水并定容至1L)中，于37℃、180r/min条件下培养12h，8000r/min离心5 min，弃上清，将菌体用无菌水反复清洗3次，再用0.2 mol/L pH=7.0的PBS缓冲液将菌体重悬并调整菌悬液浓度为1.0×108 cells/mL。
将黄曲霉 (Aspergillus flavus)、新壳梭孢菌 (Neofusicoccum parvum)、镰刀菌属 (Fusarium sp)、拟盘多毛孢属 (Pestalotiopsis)、香蕉炭疽菌 (Collectotrchum musae)、香蕉盘长孢菌 (Gloeosporium musarum Cooke et Mass)、枇杷胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、枇杷尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum)分别接种到PDA培养基平板上，28℃下培养7-10d至菌丝长满培养皿。
用打孔器分别打取直径为7mm的病原菌菌饼接种于PDA培养基平板中央，在距离菌饼25mm处等距离取4个点打孔，其中2个孔各内添加LZT14菌液30 μL，另外两个孔中各添加30 μL无菌水做为对照。28℃培养，记录抑菌对峙处理结果并拍照。
如图4所示，结果表明：贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis LZT14对黄曲霉、新壳梭孢菌、镰刀菌属、拟盘多毛孢属、香蕉炭疽菌、香蕉盘长孢菌、枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌等8种病原菌具有较强的抑制效果。
实施例3菌株Bacillus velezensis LZT14的应用
香蕉果实先用20% (V/W) 酒精除去果实表面气泡，再用0.5% (V/W) 次氯酸钠进行表面消毒，用清水清洗，于室温下自然风干。用浓度为1.0×108 cell/mL的贝莱斯芽孢杆菌LZT14（Bacillus velezensis LZT14）菌悬液喷洒枇杷果实(喷洒范围为果实表面80%-100%湿润)，以无菌水作为对照。2h后待果实表面自然晾干，香蕉果实喷洒香蕉炭疽菌的孢子 (1×105 cell/mL) 悬液(喷洒范围为果实表面80%-90%湿润)，果实自然晾干。放入0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋中，香蕉置于(28±1)℃、80%的相对湿度下贮藏，每隔2 d取样，观察香蕉保鲜效果。
如图5所示，结果表明：当贮藏期到第11天时，对照组香蕉果实腐烂严重，坏果数增加；菌株LZT14接种处理的香蕉果实表面部分出现病斑。上述结果表明，菌株LZT14接种处理能有效抑制香蕉炭疽病菌对香蕉果实的侵染，减少香蕉的腐烂。
香蕉果实先用20%(V/W)酒精除去果实表面气泡，再用0.5%(V/W)次氯酸钠进行表面消毒，用清水清洗，于室温下自然风干。用菌株Bacillus velezensis LZT14的菌悬液(1×108 cell/mL)喷洒(喷洒范围为果实表面80%-100%湿润)，以无菌水作为对照。2h后待果实表面自然晾干后，喷洒香蕉炭疽菌的孢子 (1×105 cell/mL) 悬液(喷洒范围为果实表面80%-90%湿润)，果实自然晾干。放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，香蕉置于(28±1)℃、80%的相对湿度下贮藏，每隔2 d取样，观察并测定病情指数。
病情指数分级标准。0级：病斑面积0；1级：病斑面积小于25%；2级：病斑面积25%~50%；3级：病斑面积50%~75%；4级：病斑面积大于75%。
计算公式为：病情指数＝[Σ(感病级别×该级果实数)/(总果实数×最高感病级别)]×100%。
香蕉果实病情指数见图6，图6结果表明：实验组香蕉果实相比对照组果实而言，在采后贮藏期间的病情指数明显更低且增长速率较为缓慢，表明贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis LZT14能有效降低香蕉采后储藏期间的病情指数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggytaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcggcggct ggctccataa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180
atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600
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gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720
gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780
cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840
ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt 1020
tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080
cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140
cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg 1200
gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg 1260
aagccacctt ttatgtctga accatgcggt tcagacaacc atccggtatt agccccggtt 1320
tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc 1380
taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg ca 1422

Claims (6)

1.一株抑制香蕉采后病害的贝莱斯芽孢杆菌LZT14，其特征在于：所述菌株的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LZT14，于2021年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23150。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌LZT14在拮抗植物致病菌中的应用，其特征在于 ：所述贝莱斯芽孢杆菌LZT14对黄曲霉（Aspergillus flavus）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、香蕉炭疽菌（Collectotrchum musae）、香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）具有抑制作用。
3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌LZT14在香蕉采后病害预防和贮藏保鲜中的应用，所述的香蕉采后病害为香蕉炭疽病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用方法为：将贝莱斯芽孢杆菌LZT14菌悬液喷洒于香蕉表面，风干，贮藏。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌LZT14的菌悬液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌LZT14菌株用LB固体培养基活化，挑取单菌落至LB液体培养基里，于37℃、180r/min条件下培养12h，随后在8000rpm条件下离心5min收集菌体，将菌体用无菌水洗3遍后再用0.2mol/L pH7.0的PBS缓冲液重悬并调整菌悬液浓度为1.0×108cell/mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：喷洒菌悬液后的贮藏方式具体为：放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，于28℃、80%相对湿度环境贮藏。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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贝莱斯芽孢杆菌YQ1菌株对香蕉枯萎病的生防效果研究;姬梦琳等;植物病理科技创新与绿色防控——中国植物病理学会2021年学术年会论文集;第621页 *

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