CN110628655B - 一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3及其使用方法 - Google Patents

一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg‑3及其使用方法。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 18359。该菌株用于果蔬采后病害防治的抑菌谱广、效果稳定。该酵母菌的使用方法为菌株活化，菌体用无菌水配成1×108细胞/mL的菌悬液；将果蔬浸入菌悬液中30 s取出，风干，贮藏。有望广泛用于果蔬采后病害的防治，减少采后病害造成的损失，具有很好的应用前景。

Description

一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3及其使用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3及其使用方法。
背景技术
水果采后贮藏期间易发生变质，引起果实糖酸比例失调和营养价值降低等。在采摘和运输过程极易造成机械损伤和微生物侵染而引起的腐烂，严重影响果实的品质和经济价值。目前，水果采前、采后防治及其贮藏保鲜方面的研究主要是采用传统的物理方法和化学方法。物理方法主要有热处理、低温贮藏和气调保鲜等，而化学方法主要使用一些食品添加剂、天然抑菌物质和其它低毒性化学物质。各国相关领域科研工作者一直致力于寻找一种安全、绿色的生防技术，以期减少化学试剂的使用。因此，利用拮抗菌进行采后防治已迅速发展为一个研究热点之一。目前，已确定的具有生防效果的拮抗菌包括细菌和酵母菌，其中酵母菌因生长速度快、易于在水果表面定殖、安全和拮抗效果佳等优点而成为研究热点。
酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、安全，一般不会产生对人体和寄主植物有害的代谢产物，并且其对营养要求低，繁殖速度快，对环境具有较强的耐受能力，与其他的物理处理和化学试剂具有一定的相容性，可与其他物理或化学处理结合运用于水果采后保鲜。拮抗酵母能防治水果采后病害主要是其可在果皮伤口处能够快速定殖生长，快速消耗伤口处的营养物质，抢占生长空间，导致病原菌因缺乏营养和空间无法快速繁殖，进而防止果实腐烂，达到保鲜的目的。同时采后水果在受到外来拮抗微生物激发子的诱导后会发生细胞组织结构的变化，形成一些可以阻止病原菌入侵的特殊结构来保护自身。它们常常通过木质素、胼胝体和羟脯氨酸糖的沉积、植物抗菌素的积累、蛋白质酶抑制剂和溶菌酶（几丁质酶和脱乙酰几丁质酶等）的合成来增强细胞壁的抗性，这些过程涉及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）与超氧化物歧化酶（SOD）等酶的活性。
本发明中的Hanseniaspora thailandica Lg-3为本实验室从龙眼发酵液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。研究证明，其能显著抑制香蕉盘长孢菌、香蕉镰刀菌、枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌、链格孢、葡萄座腔菌、新壳梭孢菌的生长，并能够明显降低香蕉采后病害的发生，能为更好地研究利用该菌株防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术难题，提供一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3及其使用方法。该菌株抑菌谱广，能有效延长果蔬的贮藏期。有望广泛用于果蔬采后病害的防治，减少采后病害造成的损失，具有很好的应用前景。
一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3，其分类命名为：Hanseniaspora thailandica Lg-3；于2019年8月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No. 18359。
上述控制果蔬采后病害的酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3是从自然发酵的龙眼醪液中筛选分离到的，对香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）具有明显的抑制效果。
上述酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜。
上述酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3应用于果蔬采后病害防治和贮藏，按照以下步骤进行：将将果蔬浸入Hanseniaspora thailandica Lg-3的菌悬液中30 s取出，风干，贮藏。
上述酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液的制备方法为：将Hanseniaspora thailandica Lg-3菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB液体培养基里，于28℃，180r/min条件下培养8h，8000rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108细胞/mL的菌悬液。所述NYDA培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌30min；NYDB培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌30min。
进一步的，上述一株控制果蔬采后病害的酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜，所述水果为香蕉；香蕉浸入菌悬液中30 s取出，风干，放入0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，28℃，80%HR贮藏。
上述酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜的方法，能有效延长果蔬贮藏期。
本发明的优点：(1)本发明所提供的Hanseniaspora thailandica Lg-3为本实验室从龙眼发酵液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。
(2)本发明所使用的Hanseniaspora thailandica Lg-3抑菌谱广，可以同时控制香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）等。
(3)本发明所提供的Hanseniaspora thailandica Lg-3在NYDB培养基中生长良好，培养6小时可以进入对数生长期，性状稳定，且单独使用浓度为1×108细胞/mL菌悬液就能有效防治香蕉采后病害，使用成本低，市场前景广阔。
(4)本发明所提供的Hanseniaspora thailandica Lg-3可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，且不污染环境，社会和生态效益显著。
附图说明
图1本发明Hanseniaspora thailandica Lg-3的菌落形态图。
图2为本发明Hanseniaspora thailandica Lg-3的26S rDNA Dl/D2区核酸序列进化关系图。
图3为Hanseniaspora thailandica Lg-3广谱性效果图。A&B 链格孢，第8天抑菌效果图；C&D 葡萄座腔菌，第5天抑菌效果图；E&F 香蕉盘长孢菌，第5天抑菌效果图；G&H枇杷尖孢炭疽菌，第4天抑菌效果图；I&J 枇杷胶孢炭疽菌，第4天抑菌效果图；K&L 香蕉镰刀菌，第4天抑菌效果图；M&N 新壳梭孢菌，第3天抑菌效果图。
图4为香蕉的病变直径。注：对照组：无菌水；Lg-3：108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液。“*”代表差异显著((P<0.05)。
图5 为Hanseniaspora thailandica Lg-3对香蕉采后的生防效果。注:A：空白对照组，无菌水；B：实验组，108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液。
图6为香蕉果实病情指数。注：对照组：无菌水；Lg-3：108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液。“*”代表差异显著((P<0.05)。
图7 为香蕉果实腐烂率。注：对照组：无菌水；Lg-3：108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液。“*”代表差异显著((P<0.05)。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
1.Hanseniaspora thailandica Lg-3的筛选
从福州大学校园龙眼树上采回来的新鲜龙眼，用20vol%酒精浸泡10 s，后用蒸馏水将龙眼冲洗三次，完成果皮表面的初步清洗。取龙眼表皮，切碎，加入1mL的无菌水中，震荡混匀。梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，各取100μL于NYDA培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L， 121℃湿热灭菌20min)平板上进行涂布，28℃培养24小时，挑取大小、形态、颜色不同的菌株与NYDA培养基平板上三区划线进行菌株纯化，28℃培养，重复多次，直至得到单菌落为止。挑取纯化后的单菌落，接入NYDB培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min）中，28℃，180rpm，培养12小时后，与香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）做平板对峙实验，选出具有明显抑菌效果的菌株，命名为Lg-3 ，并保存于甘油中备用。
2、形态学特征
从超低温冰箱取出甘油贮藏的Hanseniaspora thailandica Lg-3, 快速解冻，于NYDB培养基（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min）活化培养12h（28℃，180rpm），在NYDA固体培养基平板（酵母粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L， 121℃灭菌20min)上涂布，28℃培养24h，菌落呈卵圆形、边缘整齐、表面光滑、质地均匀、易挑起（见图1）。
3、分子遗传学鉴定Hanseniaspora thailandica Lg-3
以通用正向引物 NL1: 5'－GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG－3'和反向引物NL4:5'－GGTCCGTGTTTCAAGACGG－3'进行PCR扩增筛选菌株的26S rDNA D1/D2区核酸序列（SEQID NO.1），测序结果在NCBI数据库中进行比对，下载同源性高的基因序列。将所有的序列导入MEGA5软件Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法构建系统进化树（见图2），确定筛选到的菌株为Hanseniaspora thailandica。
实施例2Hanseniaspora thailandica Lg-3 抑菌性检测
将活化后的Hanseniaspora thailandica Lg-3按3%的接种量接种到NYDB培养基中，于28℃、180r/min条件下培养8h，1000r/min离心l min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液。
将香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）分别接种到PDA培养基平板上，28℃下培养7-10d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为1×105个/mL的孢子悬液。
将30μL 1×108细胞/mL的Hanseniaspora thailandica菌悬液接入PDA 平板中央直径为0.6cm的孔中，2h后接入30μL 1×105个/mL的孢子悬液，以无菌水作为对照组。于28℃下培养，观察其生长情况。
抑菌率(%)=（对照组直径－实验组直径）/对照组直径×100%。
表1酵母菌Hanseniaspora thailandica Lg-3 抑菌性检测结果
Figure 451641DEST_PATH_IMAGE001
结果见图3及表1，结果表明： 酵母Hanseniaspora thailandica Lg-3可以明显抑制香蕉盘长孢菌、枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌、香蕉镰刀菌、链格孢、葡萄座腔菌，抑菌率均可达到69%以上。其对新壳梭孢菌的抑制效果稍弱，仅达到37.8%。
实施例3酵母菌Hanseniaspora thailandica Lg-3的应用
香蕉果实先用20vol%酒精除去果实表面气泡，再用0.5wt%次氯酸钠进行表面消毒，用清水清洗，于室温下自然风干。在果实腰部用打孔器打1个直径为3mm（宽）×3mm（深）的孔，每孔注30μL的拮抗菌浓度为1×108细胞/mL Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液，对照组注入30μL无菌水。2h后接种香蕉盘长孢菌孢子悬液30μL。晾干后将果实装入0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋内，后置于(28±1)℃、80%HR贮藏。每个处理组10个水果，实验重复3次。测定其病变直径。检测结果见图4，图4结果表明：对照组和实验组分别于第2天、第3天开始腐烂，并且实验组的病变直径在贮藏期间显著低于对照组，表明Hanseniaspora thailandica Lg-3可以有效抑制香蕉盘长孢菌的生长。
实施例4
香蕉果实分别先用20vol%酒精除去果实表面气泡，再用0.5wt%次氯酸钠进行表面消毒，用清水清洗，于室温下自然风干。用1×108细胞/mL的Hanseniaspora thailandicaLg-3菌悬液浸泡接种30 s，以无菌水作为对照。2 h后待果面自然吹干，放入0.015 mm厚的聚乙烯薄膜袋中，置于(28±1)℃、80%HR贮藏，观察果实的腐烂程度。
根据病斑面积大小将果实分成5级。0级：病斑面积0；1级：病斑面积小于0- 10%；3级：病斑面积11 - 25%；5级：病斑面积26 - 50%；7级：病斑面积50 - 75%；9级：病斑面积大于75%。测定时随机选取20个香蕉果实，根据各级别果实数量和相对应的感病级别得出病情指数。
计算公式为：
病情指数＝[Σ(感病级别×该级果实数)/(总果实数×最高感病级别)] ×100%。
腐烂率=（坏果/总果）×100%。
Hanseniaspora thailandica Lg-3对香蕉采后的生防效果见图5，结果表明：在贮藏的第9天对照组的病斑面积高达75%以上，实验组的病斑面积小于10%，Hanseniaspora thailandica Lg-3能有效延长香蕉的贮藏期。
香蕉果实病情指数见图6，图6结果表明：对照组果实于贮藏第6天出现病斑，而实验组于第8天出现病斑，并且在贮藏期间实验组的病情指数明显低于实验组，表明Hanseniaspora thailandica Lg-3能有效降低香蕉保藏期间的病情指数。
香蕉果实腐烂率见图7，图7结果表明：果实贮藏6天后，对照组的腐烂率明显高于实验组，表明Hanseniaspora thailandica Lg-3能有效降低香蕉保藏期间的腐烂率。
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<212> DNA
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gcatatcaat aagcggagga aaag 24
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<212> DNA
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<213> SEQ ID NO.1
<400> 3
ccaaggggat acttagtacg gcgagtgagc ggtaaaagct caaatttgaa atctggtact 60
ttcagtgccc gagttgtaat ttgtagaatt tgtctttgat taggtccttg tctatgttcc 120
ttggaacagg acgtcataga gggtgagaat cccgtttggc gaggatacct tttctctgta 180
agactttttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc aaagtgggtg gtaaattcca 240
tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg gaaagatgaa 300
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tcagacatgg tgttttttta atgtgcaagt ctctcgtgga catgtgcctc tggaaattaa 420
cactgggcca acatcagttc tggcggcagg ataaatcatt aagaatgtag ctacctcggt 480
agtgttatag ctttttggaa tactgccagc tgggattgag gactgcgctt cggcaaggat 540
gttggcataa tggttaaatg ccgcccgtct tgaaaccacg gacca 585

Claims (3)

1.一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3，其特征在于：所述酵母菌Lg-3 的分类命名为Hanseniaspora thailandica Lg-3，于2019年8月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 18359。
2.根据权利要求1所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3，其特征在于：所述酵母菌Lg-3对香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）具有抑制作用。
3.如权利要求1所述的一株控制果蔬采后病害的酵母菌Lg-3应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜；具体应用方法为：将果蔬浸入Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液中30s取出，风干，贮藏；所述果蔬为香蕉；香蕉浸入菌悬液中30S取出，风干，放入0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋中，密封后，28℃，80%RH贮藏；
所述Hanseniaspora thailandica Lg-3菌悬液的制备方法为：将Hanseniaspora thailandica Lg-3菌株用NYDA培养基活化，挑取单菌落至NYDB液体培养基里，于28℃，180r/min条件下培养8h，8000rpm离心1min收集菌体，用无菌水洗3遍将菌体用无菌水配制成浓度为1×108细胞/mL的菌悬液；
所述NYDA培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL， 121℃灭菌30min；NYDB培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min；
所述Hanseniaspora thailandica Lg-3 应用于果蔬采后病害防治和贮藏保鲜能有效延长果蔬贮藏期；
所述酵母菌Lg-3对香蕉盘长孢菌（Gloeosporium musarum Cooke et Mass）、香蕉镰刀菌（Fusarium sp.）、枇杷胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、枇杷尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、链格孢（Alternaria sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）具有抑制作用。
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