CN116555088B - proteus faecis菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种proteus faecis菌株及其应用，属于微生物技术领域。该proteus faecis菌株Y246于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC 63245，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。本申请提供的proteus faecis菌株Y246，能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长和繁殖，进而能够有效防治植物枯萎病如香蕉枯萎病，同时解决了现有通过筛选抗性植物品种研发周期长的问题。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉proteus faecis菌株及其应用。
背景技术
微生物应用在生物农药、生物菌肥等领域由来已久，由于微生物具有绿色、环保，不易造成化学残留、环境污染等问题，目前被广泛推广应用。
本领域通常将具有病原菌抑制作用的微生物称为生防菌，生防菌以抑制植物病原菌生长为目的，其研发周期相对较短，因此目前生防菌已广泛应用于植物防治中，但由尖孢镰刀菌(Fusarium oxyspoum f.sp.cubense,Foc)引起的植物枯萎病仍未发现生防菌能够有效抑制其生长繁殖，导致目前植物枯萎病仍是一种极具破坏性的典型土传性病害，仍是本领域技术人员所需攻克的一大难题，使得筛选具有良好抗植物枯萎病的微生物菌是本领域发展的关键。
因此，本申请筛选分离一种能够防治植物枯萎病且对环境、人类无害的微生物菌株是有必要的，筛选得到的微生物菌株能够为后续的植物保护、生物菌肥等各个相关的生物防护领域提供坚实的基础，该proteus faecis菌株能够抑制病原菌生长繁殖，尤其抑制植物枯萎病病原菌的生长繁殖，对于预防和治疗植物枯萎病如香蕉枯萎病、黄瓜枯萎病以及茄子枯萎病等具有重要的应用作用。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本申请提供一种proteus faecis菌株及其应用，该proteus faecis菌株能够抑制病原菌生长繁殖，尤其抑制植物枯萎病病原菌的生长繁殖，对于预防和治疗植物枯萎病如香蕉枯萎病具有重要的应用作用。
本申请第一方面提供一种proteus faecis菌株，所述proteus faecis菌株分类命名为proteus faecis菌株Y246，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2023年3月8日，保藏编号：GDMCC 63245。
在一种实施方式中，所述proteus faecis菌株的菌体形态特性为：表面光滑、呈黄白色。
在一种实施方式中，所述proteus faecis菌株包括如下生理生化特性：葡萄糖+、果糖+、麦芽糖+、果糖+、明胶液化+、甲基红试验-、VP试验+、柠檬酸-、过氧化氢酶+、海藻糖+、吲哚+。
本申请第二方面提供一种proteus faecis菌株的获取方法，包括以下步骤：
挑选健康状态良好的香蕉植株，将所述香蕉植株进行多次冲洗、晾干、漂洗；
将漂洗后的所述香蕉植株用无菌水冲洗；
将经无菌水冲洗冲洗后的香蕉植株进行称量、研磨、加入无菌水得到悬浮液；
将所述悬浮液涂布于分离培养基进行培养、纯化得到单菌落；
筛选得到proteus faecis菌株。
在一种实施方式中，将所述香蕉植株进行多次冲洗、晾干、漂洗包括：
采用浓度为75％酒精对所述香蕉植株进行漂洗4min，以及采用5％的次氯酸钠溶液漂洗4min。
在一种实施方式中，所述分离培养基包括LB培养基、PDA培养基以及高氏一号培养基。
在一种实施方式中，将所述悬浮液涂布于分离培养基进行培养、纯化得到单菌落，筛选得到proteus faecis菌株包括：
将所述悬浮液涂布于分离培养基进行培养、纯化得到单菌落包括：
将所述悬浮液涂布于分离培养基进行28℃培养7天、取不同菌落于所述分离培养基上继续纯化，于37℃培养箱中培养3天，得到单菌落；
对所述单菌落进行抑菌筛选，依据筛选结果测序得到proteus faecis菌株。
本申请第三方面提供一种proteus faecis菌株发酵液，包括：上述的proteusfaecis菌株及其生理代谢产物和营养液。
本申请第四方面提供一种proteus faecis菌株发酵液的应用，
所述的proteus faecis菌株在防治植物枯萎病中的应用。
在一种实施方式中，将所述proteus faecis菌株发酵液对植物进行灌根处理。
本申请提供的技术方案包括以下有益效果：本发明的proteus faecis菌株能够从健康抗病香蕉枯萎病苗筛选获得，属于细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，该菌株能够抑制病原菌尖孢镰刀菌的生长繁殖，对于预防和治疗由尖孢镰刀菌(Fusarium oxyspoum f.sp.cubense,Foc)引起的植物枯萎病具有重要的应用作用。本proteus faecis菌株从香蕉植株中分离，可通过灌根处理定殖于香蕉植株中，对环境友好，对植株尤其香蕉植株具有明显的促生、预防和治疗香蕉枯萎病的效果，且对环境及人类无害，该proteus faecis菌株能够为后续的植物保护、生物菌肥等各个相关的生物防护领域提供坚实的基础。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
通过结合附图对本申请示例性实施方式进行更详细的描述，本申请的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本申请示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。
图1为proteus faecis菌株Y246于LB固体培养基上培养24小时后菌落形态；
图2为proteus faecis菌株Y246对尖孢镰刀菌四一号生理小种(FOC1)的平板拮抗实验效果；
图3为实施例3对照组实验效果；
图4为proteus faecis菌株Y246对尖孢镰刀菌四号生理小种(FOC4)的平板拮抗实验效果；
图5为实施例4对照组实验效果；
图6为proteus faecis菌株Y246产铁载体能力的测定；
图7为proteus faecis菌株Y246发酵液灌根处理的香蕉植株生长情况图；
图8为未经proteus faecis菌株Y246发酵液灌根处理的香蕉植株生长情况图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的优选实施方式。虽然附图中显示了本申请的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本申请更加透彻和完整，并且能够将本申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
应当理解，尽管在本申请可能采用术语“第一”、“第二”、“第三”等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
微生物应用在生物农药、生物菌肥等领域由来已久，由于微生物具有绿色、环保，不易造成化学残留、环境污染等问题，目前被广泛推广应用。
本领域通常将具有病原菌抑制作用的微生物称为生防菌，生防菌以抑制植物病原菌生长为目的，其研发周期相对较短，因此目前生防菌已广泛应用于实际应用中，但由尖孢镰刀菌(Fusarium oxyspoum f.sp.cubense,Foc)引起的植物枯萎病仍未发现生防菌能够有效抑制其生长繁殖，导致目前植物枯萎病仍是一种极具破坏性的典型土传性病害，仍是本领域技术人员所需攻克的一大难题，筛选具有良好抗植物枯萎病的菌株是本领域发展的关键
因此筛选分离一种防治植物枯萎病，同时不影响植物原本果实口感且对环境、人类无害的微生物菌株是有必要的。
针对上述问题，本申请提供一种proteus faecis菌株及其应用，该proteusfaecis菌株能够抑制病原菌植物枯萎病病原菌的生长繁殖，对于预防和治疗香蕉枯萎病具有重要的应用作用。
图1为proteus faecis菌株Y246于LB固体培养基上培养24小时后菌落形态。
实施例1proteus faecis菌株的获取
本proteus faecis菌株的获取方式为从抗病香蕉植株中分离提取、纯化获取，具体做法如下：
在大片已感染香蕉枯萎病的病区香蕉园中，挑选一株未感香蕉枯萎病的健康香蕉植株，收集健康香蕉植株的根、球茎和假茎，对收集的根、球茎和假茎进行流水反复多次冲洗以除去表面的附着污物，自然晾干水分。
在无菌操作台中对经上述步骤处理干燥后的健康香蕉植株材料(包括根、球茎和假茎)进行如下处理：先采用浓度为75％酒精对其进行漂洗4min，后采用5％的次氯酸钠溶液漂洗4min，然后用无菌水冲洗7次，并于无菌条件下晾干备用，对最后一次无菌水冲洗后的冲洗液保存备用。
进一步，采用灭过菌的小刀，切除香蕉植株材料(包括根、球茎和假茎)表皮得到香蕉植株的内部植物组织，称取内部植物组织10g，研磨后加入90ml无菌水，稀释为所需浓度的悬浮液，分别吸取悬浮液100μL涂布于分离培养基上，本申请实施例的分离培养基包括LB分离培养基、PDA分离培养基和高氏一号分离培养基，于28℃培养箱中培养7天，取不同菌落于不同培养基上继续纯化，放于37℃培养箱中培养3天，得到不同的单菌落。
进一步的，本申请实施例采用平板对峙培养法进行菌种筛选，将上述步骤得到的单菌落接种到培养有植物枯萎病病原菌的平板培养基中，示例性的，在离平板边缘1cm处进行划线，使其周围产生4条线纹。以不划线的只有植物枯萎病病原菌的培养基为对照，5次重复，观察植物枯萎病病原菌繁殖生长情况，筛选得到具有抑制植物枯萎病病原菌生长作用的菌株，并对菌株测序确定其所属的界、门、纲、目、科、属。
得到具有抑制植物枯萎病病原菌生长作用的菌株后，挑取该菌株新长出的菌落在分离培养基上进行平板划线法对进行分离纯化。纯化后的具有抑制植物枯萎病病原菌生长作用的菌株，用灭过菌的接种环从平板上挑取3～4环放入含800.0μL 20％甘油的1.5mL的离心管中进行混匀留存于-20℃冰箱备用，若需长期保存，可在-80℃冰箱中进行长期储备保存。
本发明的proteus faecis菌株能够从健康抗病香蕉枯萎病苗筛选获得，属于细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，该菌株能够抑制病原菌生长繁殖。尤其抑制植物枯萎病病原菌的生长繁殖，对于预防和治疗香蕉枯萎病具有重要的应用作用。本proteus faecis菌株从香蕉植株中分离，可通过灌根处理定殖于香蕉植株中，对环境友好，对植株尤其香蕉植株具有明显的促生及预防和治疗香蕉枯萎病的效果，且对环境及人类无害。
实施例2菌株的生理生化特性及分类地位鉴定
具有抑制植物枯萎病病原菌生长作用的菌株具有如下形态和生理、生化特性：
a、菌体形态特性：细胞较小，表面光滑，黄白色小点，为革兰氏阴性细菌
b、生理生化特性：葡萄糖+、果糖+、麦芽糖+、果糖+、明胶液化+、甲基红试验-、VP试验+、柠檬酸-、过氧化氢酶+、海藻糖+、吲哚+。
c、分子分类地位的确定
提取实施例1分离得到的菌株的DNA，扩增16S rRNA基因，并用琼脂糖凝胶检测，将PCR扩增产物交由测序公司直接进行测序，获得菌株的16S rRNA序列，将16S rRNA序列输入GenBank进行Blast比对，确定本发明分离得到的菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现实施例1分离得到的菌株，与proteus faecis菌株相似性为99.74％。因此将本发明的菌株应归属于proteus faecis，并命名为proteus faecis菌株Y246
d、生物保藏信息
proteus faecis菌株Y246：于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC 63245保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
e、菌株序列信息
GGCCTACACATGCAGTCGAGCGGTAACAGAAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGACG
AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAAC
TACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATGACGTCTACGGACCAAAGCAGGGGCT
CTTCGGACCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGAGG
TAATGGCTCACCTAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCAC
ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT
TGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCT
TAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGATAAAGTTAATACCTTTA
TCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCG
CGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCAC
GCAGGCGGTCAATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTG
CATCTGAAACTGGTTGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTA
GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCT
GGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGA
TACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTAGAGGTTGTGGTCTTGAA
CCGTGGCTTCTGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGC
AAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT
GGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAA
TCCTTTAGAGATAGAGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGG
CTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC
CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGCGTGATGGCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGT
GATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGT
AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAGATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGA
GCAAGCGGAACTCATAAAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGAC
TCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATAC
GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAG
AAGTA
实施例3菌株对植物枯萎病病原菌拮抗实验
尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。本实验所用植物枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌一号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1。
本申请实施例病原菌培养和拮抗实验所用培养基为：
PDA液体培养基(1.0L)包括：马铃薯200g、葡萄糖20g。
PDA固体培养基(1.0L)包括：马铃薯200.0g、葡萄糖22g，琼脂粉16.0g；pH＝7.0；
LB固体培养基(1.0L)包括：蛋白胨9.0g、酵母提取物6.0g、氯化钠9.0g，琼脂粉16.0g；pH＝7.0；
LB液体培养基(1.0L)包括：蛋白胨9.0g、酵母提取物6.0g、氯化钠9.0g；pH＝7.0；
高氏一号培养基(1.0L)包括：硝酸钾1.0g、磷酸二氢钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸铁0.01g、氯化钠0.5g、可溶淀粉20.0g，琼脂粉16.0g；pH＝7.0；
采用平板对峙法观察菌株拮抗效果，具体为：
处理组：将分离出proteus faecis菌株Y246接种到培养有尖孢镰刀菌一号生理小种的PDA固体培养基中，该PDA固体培养基为平板培养基，在PDA平板培养基离平板边缘1cm处进行划线，使其周围产生4条线纹。
对照组：以不划线的只有尖孢镰刀菌一号生理小种的PDA平板培养基为对照。
实验组和对照组设置5次重复。将对照组和处理组于30℃恒温培养箱中培养1周，观察对照组和处理组菌落生长情况，并十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照组病原菌菌落直径－处理组病原菌菌落直径)/(对照组病原菌菌落直径-菌饼直径)×100，菌落直径单位为mm。
表1
结果如表1、图2以及图3所示：从图3中可知，未加入proteus faecis时，病原菌尖孢镰刀菌一号生理小种生长状态较好，几乎铺满了整个PDA固体培养基，原菌菌落直径较大，经十字交叉法测量得到对照组病原菌菌落直径平均为90毫米；从图2中可知，当在培养有尖孢镰刀菌一号生理小种的PDA平板培养基加入proteus faecis菌株Y246后，proteusfaecis菌株Y246得到了较好的生长繁殖，而病原菌尖孢镰刀菌一号生理小种相对于对照组菌落直径明显缩小仅为38.74毫米，说明proteus faecis菌株Y246与病原菌尖孢镰刀菌一号生理小种之间具有拮抗效果，进而说明proteus faecis菌株Y246对病原菌尖孢镰刀菌一号生理小种的生长具有明显的抑制作用，且经计算得到抑菌率为64.08％，证明proteusfaecis菌株Y246能够有效抑制尖孢镰刀菌一号生理小种的生长繁殖。
实施例4菌株对植物枯萎病病原菌拮抗实验
本实验所用植物枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌四号生理小种Fusariumoxysporum f.sp.cubense race 1,FOC4。
采用平板对峙法观察菌株拮抗效果，具体为：
处理组：将分离出的proteus faecis菌株Y246接种到培养有尖孢镰刀菌四号生理小种的PDA固体培养基中，该PDA固体培养基为平板培养基，在PDA平板培养基离平板边缘1cm处进行划线，使其周围产生4条线纹。
对照组：以不划线的只有尖孢镰刀菌四号生理小种的PDA平板培养基为对照。
实验组和对照组设置5次重复。将对照组和处理组于30℃恒温培养箱中培养1周，观察对照组和处理组菌落生长情况，并十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照组病原菌菌落直径－处理组病原菌菌落直径)/(对照组病原菌菌落直径-菌饼直径)×100，菌落直径单位为mm。
表2
结果如表2、图4及图5所示：从图5中可知，未加入proteus faecis菌株Y246时，病原菌尖孢镰刀菌四号生理小种生长状态较好，几乎铺满了整个PDA固体培养基，病原菌菌落直径较大，经十字交叉法测量得到对照组病原菌菌落直径平均为90毫米；从图4中可知，当在培养有尖孢镰刀菌四号生理小种的PDA平板培养基加入proteus faecis菌株Y246后，在proteus faecis菌株Y246得到了较好的生长繁殖，而病原菌尖孢镰刀菌四号生理小种相对于对照组菌落直径明显缩小仅为36.43毫米，说明proteus faecis菌株Y246与病原菌尖孢镰刀菌四号生理小种之间具有拮抗效果，进而说明proteus faecis菌株Y246对病原菌尖孢镰刀菌四号生理小种的生长具有明显的抑制作用，且经计算得到抑菌率为66.96％，证明proteus faecis菌株Y246能够有效抑制尖孢镰刀菌四号生理小种的生长繁殖。
实施例5菌株产铁载体功能测试
处理组：将proteus faecis菌株Y246于LB液体培养基中培养3天，菌液离心后用无菌水制备成OD600＝1的菌悬液，吸取1.0mL菌悬液放入装有5.0mLMSA-CAS液体培养基的试管中，于130rpm、37℃摇床中培养72h。
对照组：于LB液体培养基中未加入proteus faecis菌株Y246培养3天，菌液离心后用无菌水制备成OD600＝1的菌悬液，吸取1.0mL菌悬液放入装有5.0mLMSA-CAS液体培养基的试管中，于130rpm、37℃摇床中培养72h。
观察处理组和对照组颜色变化，培养液颜色变粉红色或紫红色则该菌株能产生铁载体，颜色越深则铁载体含量越高，如图6所示，左边为对照组显示的颜色，右边为处理组显示的颜色，处理组的颜色相对于对照组紫红色更明显，说明铁载体含量更高，说明proteusfaecis菌株Y246能够分泌铁载体，铁载体(siderophores)是一种可以结合三价铁离子(ferricion)并且供给给微生物细胞的低分子量物质，细菌通过分泌铁载体与植物病原菌竞争铁离子，从而抑制病原菌生长繁殖。
进一步的，本申请实施例作为优选，proteus faecis菌株Y246在预防和治疗尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病时的方法为：将proteus faecis菌株Y246的发酵液对香蕉进行灌根处理即可，本申请实施例的proteus faecis菌株Y246的发酵液包括proteus faecis菌株及其生理代谢产物和营养液。
如图7所示，经过proteus faecis菌株Y246的发酵液灌根处理的香蕉植株生长状态良好，植株翠绿，未出现香蕉枯萎病的症状，而图8对照组为未经过proteus faecis菌株Y246的发酵液灌根处理的香蕉植株则出现了香蕉枯萎病发病症状，说明proteus faecis菌株Y246能够抑制香蕉枯萎病病原菌的生长繁殖，对植物枯萎病具有抑制与防治的作用。
以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (4)
1.一种proteus faecis菌株，其特征在于：所述proteus faecis菌株分类命名为proteus faecis菌株Y246，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2023年3月8日，保藏编号：GDMCC NO：63245。
2.一种proteus faecis菌株发酵液，其特征在于，包括如权利要求1所述的proteusfaecis菌株及其生理代谢产物和营养液。
3.一种权利要求2所述的proteus faecis菌株发酵液的应用，其特征在于，所述的proteus faecis菌株发酵液在拮抗致病菌尖孢镰刀菌一号生理小种Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 1或尖孢镰刀菌四号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubenserace 4中的应用。
4.根据权利要求3所述的proteus faecis菌株发酵液的应用，其特征在于：
将所述proteus faecis菌株发酵液对植物进行灌根处理。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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