CN113278541B - 一株水稻内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株降低玉米迪基氏菌对植物种子萌发抑制作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)J17‑4菌株及其应用。所述的J17‑4菌株，在2020年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020318，其可以有效降低玉米迪基氏菌对植物种子萌发的抑制作用，促进种子萌发，尤其是水稻种子，同时该贝莱斯芽孢杆菌J17‑4对玉米迪基氏菌也有显著的抑制作用，可用于防治水稻细菌性基腐病。该菌株的菌悬液可用于制备微生物制剂，在于应用降低玉米迪基氏菌对植物种子萌发抑制作用方面以及防治水稻细菌性基腐病方面，具有很高的应用价值。

Description

一株水稻内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌J17-4及其应用。

背景技术

玉米迪基氏菌(Dickeya zeae)在国内外稻作区广泛分布，可引起严重的水稻病害。D.zeae可在水稻种子萌发阶段侵入，造成烂种和烂芽，同时，也可在水稻不同生育期侵入，造成植株茎基部腐烂、分蘖减少、产生白穗和秕谷，严重时可导致大面积失收，对水稻高产、稳产具有极大的威胁。由玉米迪基氏菌侵染引致的病害使粮食作物严重减产，严重威胁粮食安全。以化学防治为主的综合防治技术是目前控制玉米迪基氏菌为害作物的主要措施。但化学农药的大量使用致使环境污染，影响水质，危害人畜安全等问题越发严重，因此，寻找新的、有效的防治策略迫在眉睫。

我国发明专利CN109022304B公开了一株贝莱斯芽孢杆菌，可有效抑制玉米迪基氏菌Dickeya zeae。通过注射贝莱斯芽孢杆菌于胡萝卜、大白菜、马铃薯、粉蕉的根茎上，可降低其细菌性软腐病的发病率，在种植香蕉幼苗的土壤上加入，贝莱斯芽孢杆菌可显著降低香蕉枯萎病的发病率。但是玉米迪基氏菌未等种子长成幼苗时就已经侵入，造成烂种，继而产率下降，那么对剩余的幼苗注射贝莱斯芽孢杆菌来补救已经为时已晚。

目前，国内外鲜有解决D.zeae侵入水稻种子，造成烂种和烂芽的防控报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是上述背景技术中提到的降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制的技术不足的问题，提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)J17-4菌株，贝莱斯芽孢杆菌J17-4菌株本身无致病性，能够拮抗玉米迪基氏菌，有效降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发的抑制作用，促进水稻种子萌发，同时该菌J17-4对玉米迪基氏菌也有显著的抑菌作用，可用于防治水稻细菌性基腐病。

本发明的目的提供一株贝莱斯芽孢杆菌菌株J17-4。

本发明的另一目的是提供所述的贝莱斯芽孢杆菌J17-4在降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

申请人团队从广东省农科院水稻研究所五山试验基地玉米迪基氏菌抗性水稻品种“广晶莉占”健康茎中，经人工分离纯化获得了一株能够明显降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用、以及对玉米迪基氏菌具有显著抑菌作用的水稻内生细菌，菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为J17-4。已于2020年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2020318，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

菌株J17-4的生理生化特性为：革兰氏阳性菌，好氧，接触酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用阳性，葡萄糖发酵、D-核糖发酵、阿拉伯糖发酵、甘露醇发酵、木糖发酵、海藻糖发酵、吲哚试验、V-P测定、明胶液化试验、脲酶试验阴性，水解七叶苷、酪素和淀粉；最适生长温度为30℃，最适pH为7.0。

研究显示，该贝莱斯芽孢杆菌J17-4不仅具有显著的抑制玉米迪基氏菌活性，而且能够有效降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发的抑制作用。因此本发明要求保护：

贝莱斯芽孢杆菌J17-4用于降低玉米迪基氏菌对植物种子萌发抑制作用方面的应用，或在制备可降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用的制剂方面的应用。

贝莱斯芽孢杆菌J17-4在防治水稻细菌性基腐病方面的应用，或在制备防治水稻细菌性基腐病的药剂方面的应用。

一种降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用的方法，所述的贝莱斯芽孢杆菌J17-4的菌悬液浸泡水稻种子。

其中，优选地，贝莱斯芽孢杆菌株J17-4的菌悬液的pH为6.8～7.2；

其中，优选地，菌悬液的温度为28℃～30℃；

其中，优选地，菌悬液的OD₆₀₀＝0.4～0.8；

其中，优选地，菌悬液的分散介质为液体培养基，胰酪大豆胨培养基为佳。

其中，优选地，菌悬液用于制备降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用和/或防治水稻细菌性基腐病的微生物制剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株水稻内生细菌贝莱斯芽孢杆菌J17-4：

(1)菌株J17-4有效降低玉米迪基氏菌对水稻种子的萌发抑制，促进水稻种子萌发。

(2)菌株J17-4对玉米迪基氏菌具有显著抑菌作用，用于防治水稻细菌性基腐病，可替代化学防治，减少化学农药的大量使用致使环境污染，影响水质，危害人畜安全等问题。

(3)菌株J17-4分离于水稻健康茎，本身无致病性，对环境友好。

(4)菌株J17-4对氨苄青霉素的抗性达到100μg·mL^-1，对庆大霉素、卡那霉素、氯霉素和新霉素的抗性均小于10μg·mL^-1，易于扩大培养、繁代与驯化，工艺简单。

附图说明

图1为菌株J17-4对玉米迪基氏菌EC1菌株的抑制作用。

图2为菌株J17-4在LB培养基上的菌落形态。

图3为菌株J17-4抑制玉米迪基氏菌EC1菌株生长的最佳培养基筛选。

图4为菌株J17-4基于gyrB基因序列的聚类图。

图5为菌株J17-4对不同浓度玉米迪基氏菌EC1菌株抑制水稻种子萌发的影响；玉米迪基氏菌EC1菌株接种终浓度分别为10¹、10²、10³和10⁴；菌株J17-4悬液的OD₆₀₀≈0.4。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：菌株的分离和筛选

健康水稻植株采集：玉米迪基氏菌EC1菌株抗性水稻品种“广晶莉占”健康植株于2019年5月20日采集于广东省农科院水稻研究所五山试验基地，装袋保存带回实验室进行内生菌株分离。

内生菌株分离：取健康水稻根、茎和叶，用流水分别对表面进行简单冲洗，灭菌剪刀剪成合适的小块，75％乙醇浸泡3min后放入2％次氯酸钠中浸泡5min，随后用无菌水浸泡6min，再用无菌水浸泡冲洗6次，并将最后一次无菌水涂板作为对照。用灭菌的滤纸将冲洗后的水稻组织块表面水分吸干后放入灭菌研钵中研磨破碎，然后加入1mL无菌水，混匀，取100μL涂布于LB平板上，28℃培养，挑取单菌落于1.5mL离心管振荡培养待用。

生防菌株筛选：利用平板对峙法筛选对玉米迪基氏菌EC1菌株具有拮抗作用的潜在生防菌株。培养液制备和对峙平板准备，取15mL LB倒板(含TTC)，待平板吹干后将5mL含有10⁸EC1菌株(终浓度)的琼脂糖平铺于LB平板上。待琼脂糖凝固后，用直径为5mm的打孔器打孔。将待测菌株20μL加入孔内，28℃培养24h后观察并记录试验结果。

试验结果显示，编号为J17-4的内生细菌菌株对玉米迪基氏菌EC1菌株具有显著拮抗作用，平均抑菌圈直径达14.7mm(图1)。

植物内生细菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的细菌。本发明的内生细菌可以作为微生物农药、增产菌或潜在的生防载体菌应用于生物防治。本发明获得的水稻内生细菌J17-4菌株对水稻细菌性基腐病病原菌具有显著拮抗作用，为病害的防治带来了新途径和新方法。

实施例2：生物学特性分析

用接种环挑取J17-4单菌落划线于LB培养基，28℃培养24h，观察菌落生长情况。该细菌在LB培养基上菌落呈现灰白色，中间凸起，不透明，边缘不整齐(图2)，液体培养基中呈扩散性混浊。

实施例3：培养基筛选和抗生素敏感试验

本发明采取了NYD(牛肉膏8g，酵母提取物3g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL)、YPG(酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)、YPD(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)、LB(酵母提取物5g，蛋白胨20g，NaCl 20g,蒸馏水1000mL)、LB肉汤(LB肉汤培养基30g，蒸馏水1000mL)和胰酪大豆胨(胰酪大豆胨液体培养基30g，蒸馏水1000mL)6种培养基中培养J17-4后针对玉米迪基氏菌的抑菌效果。

结果表明(图3)，菌株J17-4在胰酪大豆胨培养基中的抑菌圈直径最大。因此，研究认为菌株J17-4的最适培养基是胰酪大豆胨。

实验还分析了J17-4对抗生素的敏感性研究，结果表明该内生细菌对氨苄青霉素的有较强的抗性，可达到100μg·mL^-1或100μg·mL^-1以上，对庆大霉素、卡那霉素、氯霉素和新霉素较为敏感，抗性范围小于10μg·mL^-1。该研究结果为抗生素的选择提供参考。

实施例4：菌株J17-4的鉴定与进化分析

对实施例1获得菌株J17-4进行形态观察，生理生化分析和主要基因进化分析。形态观察结果表明，该细菌为革兰氏阳性。在LB培养基上菌落呈现灰白色，中间凸起，不透明，边缘不整齐，液体培养基中呈扩散性混浊。

生理生化分析该菌为好氧，接触酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用阳性，葡萄糖发酵、D-核糖发酵、阿拉伯糖发酵、甘露醇发酵、木糖发酵、海藻糖发酵、吲哚试验、V-P测定、明胶液化试验、脲酶试验阴性，水解七叶苷、酪素和淀粉。

16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，本发明通过分析16S rDNA序列并结合gyrB基因序列对J17-4菌株的进化关系进行分析，结果表明，菌株J17-4与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)相似性最高，在gyrB基因序列进化树中，菌株J17-4与B.velezensis A2和B.velezensis NSZ-YBGJ001聚为一支，支持率均为100(图4)。

因此，通过形态学、生理生化分析和gyrB基因系统进化分析，将生防菌J17-4菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)，命名为Bacillus velezensis J17-4。并将所述菌株于2020年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC NO：M2020318，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

实施例5：菌株J17-4对接种不同浓度玉米迪基氏菌的水稻种子萌发的影响

准备：将菌株J17-4划线于LB培养基进行活化，挑取单菌落于液体LB 28℃、200rpm振荡过夜培养，并将培养液稀释至OD₆₀₀≈0.8。

玉米迪基氏菌菌液准备：将玉米迪基氏菌EC1菌株划线于LB培养基进行活化，挑取单菌落于液体LB 28℃、200rpm振荡过夜培养，4000rpm离心8min，无菌水重悬菌体，将菌体浓度调整至OD₆₀₀≈0.8，然后按照10的倍数进行稀释，选择10¹～10⁴CFU菌液进行种子萌发试验。

种子萌发试验分组：

(1)组1：分别吸取5mL灭菌水和不同浓度梯度EC1菌液于50mL离心管中；

(2)组2：分别吸取5mL灭菌水和J17-4培养液于50mL离心管中；

(3)组3：分别吸取5mL不同浓度梯度EC1菌液和J17-4培养液于50mL离心管中；

(4)组4：吸取10mL灭菌水于50mL离心管中；

在上述四个组的每个离心管中放入15粒饱满的水稻种子(CO39)，室温静置5h后，将菌液弃去，用无菌水冲洗种子3次，分别置于垫有湿润滤纸的培养皿中，28℃培养16h光照/8h黑暗处理培养，每个处理3个重复；每天观察萌发情况，并适当添加无菌水保湿，7d后计算种子的萌发率。

表1生防菌J17-4对接种不同浓度玉米迪基氏菌的水稻种子萌发的影响

试验结果表明：菌株J17-4可以显著降低玉米迪基氏菌EC1菌株不同接种浓度特别是在高接种浓度时(10³和10⁴CFU)对水稻种子萌发的抑制作用(表1和图5)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)J17-4，2020年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020318。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌J17-4在降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用方面的应用，或在制备可降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用的制剂方面的应用。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌J17-4在防治水稻细菌性基腐病方面的应用，或在制备防治水稻细菌性基腐病的药剂方面的应用。

4.一种降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用的方法，其特征在于，用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌J17-4的菌悬液浸泡水稻种子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌株J17-4的菌悬液的pH为6.8～7.2。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌悬液的温度为28℃～30℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌悬液的OD₆₀₀不低于0.4。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌悬液的OD₆₀₀为0.4～0.8。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌悬液的分散介质为液体培养基。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为胰酪大豆胨培养基。

11.如权利要求4～10任一项所述的菌悬液用于制备降低玉米迪基氏菌对水稻种子萌发抑制作用和/或防治水稻细菌性基腐病的微生物制剂。