CN110607249B - 链霉菌生防菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株链霉菌生防菌株及应用。该菌株的分类命名为Streptomyces sp.QJK‑26，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018434。生物防治实验表明：链霉菌(Streptomyces sp.QJK‑26)发酵液对水稻纹枯病、稻瘟病和青钱柳叶黑枯病具有良好的生防作用，相对防治效果分别为67.1％、74.8％和64.8％。

Description

链霉菌生防菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术的微生物领域，具体涉及一株高效防治水稻纹枯病、稻瘟病和青钱柳叶黑枯病的生防菌株—链霉菌(Streptomyces sp.QJK-26)及其应用。

背景技术

青钱柳(Cyclocarya paliurus(Bata1.)Iljinskaja)属濒危珍稀植物，是胡桃科青钱柳属的单属种乔木。青钱柳叶具有较高的药用价值，含有多种药理成分和微量元素，具有降血糖、降血压、降血脂、抗氧化和消炎等多种药用活性，尤其对糖尿病有显著的辅助疗效。最近，在人工栽培的青钱柳苗中首次报道了叶黑枯病，发病率在10％以上，严重影响青钱柳叶的产量和品质。该病由杜仲拟茎点霉(Phomopsis eucommiae)引起，主要为害叶片，有时为害枝条。病斑初为暗褐色或黑色小点，后扩大成近圆形或不规则形，灰黑色，病健交界处不明显，后期病斑扩展连接，覆盖整叶，整株呈灰色至黑色，严重时可致植株死亡。

水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的一种世界性真菌病害，适宜在高温、高湿条件下发生和流行。在我国所有稻作区均有发生，在长江流域及以南尤为严重。常致叶片或茎秆发黄枯死，结实率下降，千粒重减轻，秕谷增多，通常减产10～30％，严重时高达50％以上。水稻纹枯病的抗性种质资源非常稀少，至今未发现对纹枯病免疫的水稻品种。

稻瘟病是由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的毁灭性水稻病害，在水稻3-4叶期、分蘖盛期和始穗期容易发生。稻瘟病每年造成水稻产量损失10～30％，严重时产量损失可达到50％，甚至绝收，全世界每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人。水稻纹枯病和稻瘟病的防治对水稻丰产、稳产，保障国家粮食安全极其重要。

植物病害的防治方法主要包括：选用抗病品种、加强水肥和栽培管理以及施用化学农药。化学农药高残留，对人畜有害，污染环境，具有环境风险，且长期使用导致抗药性。利用拮抗微生物防治植物病害，因选择性好、易降解和对环境友好等特点，在植物病害绿色防控方面越来越受到重视。研究表明，根际有益微生物对植物具有较好的亲和性，施用后易在植物体表或体内存活、定殖，防治效果持久稳定。目前，水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株主要为芽孢杆菌和假单胞菌，来源单一，相关技术仍然薄弱。青钱柳叶黑枯病的防治措施尚无报道。

放线菌是一类具有重要开发价值的微生物，其中链霉菌属(Streptomyces)及其相关类群是重要的植物病害生防菌。链霉菌可通过植物体外的抗生作用、竞争作用、捕食作用和重寄生作用，以及植物体内的诱导抗性或产生抑菌物质拮抗病原菌的生长、繁殖和扩展，或直接杀死病原菌，从而达到病害防治的目的。链霉菌作为生防菌，可直接制成活菌制剂，也可利用其产生的抗生素、酶或其他代谢产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一株链霉菌生防菌株，它可以用作生物农药，防治水稻纹枯病、稻瘟病和青钱柳叶黑枯病。

本发明的链霉菌生防菌株，该菌株的分类命名为Streptomyces sp.QJK-26，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018434，保藏日期为2018年7月2日。

链霉菌(Streptomyces sp.QJK-26)生防菌株具有以下的微生物学特性：革兰氏阳性菌，孢子链形态对生，明胶液化，牛奶胨化阳性，接触酶阳性，酯酶阳性，不产生H₂S，能利用L-树胶醛醣、D-甘露醇、D-葡萄糖等大多数碳源，氮源利用广泛(除甘氨酸和DL-a-丙氨酸不利用外)，兼性厌氧，能耐受绝大部分抗生素。NA培养基上培养7d后菌落圆滑，基内菌丝体黄褐的橄榄色；气生菌丝体丰富，白色；无可溶性色素。NB液体培养3d发酵液呈黄褐色，澄清透明，菌体生长旺盛。

本发明的链霉菌(Streptomyces sp.QJK-26)生防菌株，从青钱柳根际土壤中采用土壤连续梯度稀释法，并结合室内对峙试验分离筛选获得。

本发明的链霉菌(Streptomyces sp.QJK-26)的培养方法(或繁殖方法)、检测存活性条件：

(1)营养琼脂(NA)培养基，10g蛋白胨，5g氯化钠，5g牛肉膏，15g琼脂粉，1L蒸馏水，pH 7.2-7.4，28℃下培养，实验室液体培养采用营养肉汤(NB)培养基；

(2)大量发酵培养采用小米培养基，具体为：葡萄糖10g、蛋白胨3g、NaCl2.5g、CaCO₃ 2g，小米10g、蒸馏水1000ml、pH值7.2-7.4。

上述的链霉菌生防菌株可作为生物农药，用于防治水稻纹枯病、稻瘟病或青钱柳叶黑枯病。防治水稻纹枯病，防治效果可达67.1％；防治稻瘟病，防治效果可达74.8％；防治青钱柳叶黑枯病，防治效果可达64.8％。

本发明的有益效果，具体体现在如下几个方面：

(1)本发明的链霉菌QJK-26为植物根际有益放线菌，能在植物体表和体内定殖，防治效果持久稳定。

(2)本发明的链霉菌QJK-26对环境友好。

(3)本发明的链霉菌QJK-26可以防治多种植物病害，对水稻纹枯病和稻瘟菌的防治效果显著，因而有利于控制主要的水稻病害；对青钱柳叶黑枯病的防治效果也显著。

(4)本发明的链霉菌QJK-26培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用潜力。

附图说明

图1是链霉菌QJK-26对青钱柳叶黑枯病菌的体外抑菌活性测定实验结果图。

图2是本发明实施例1—链霉菌QJK-26对水稻纹枯病菌的体外抑菌活性测定实验结果图。

图3是本发明实施例2—链霉菌QJK-26对稻瘟菌的体外抑菌活性测定实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实验实例及附图对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：链霉菌QJK-26的分离筛选与鉴定。

本发明的链霉菌，其属名为Streptomyces，种名为Streptomyces sp.，株名为QJK-26，菌株是从湖南科技大学生物园(海拔44.5m北纬27°55'东经112°55')青钱柳植株下的根际土壤中分离，通过土壤连续梯度稀释法和平板对峙试验筛选获得，所述筛选方法属于本领域常规实验方法。

具体方法及过程描述如下：取根际土样(距土表层约10cm深)1g于99mL无菌水中制成10^-2的土壤悬液，28℃180rpm摇瓶30min取出，静置30min后取上清液，采用连续梯度稀释法分离放线菌，挑选单菌落后，采用平板划线法进行多次纯化，获得放线菌的纯培养，共获得8株典型的土壤放线菌，经平板对峙法筛选，获得一株青钱柳叶黑枯病拮抗放线菌，相对抑菌率为70.0％，结果参见图3。菌株经形态学(培养)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，即本发明的链霉菌QJK-26菌株。

平板对峙法筛选过程如下：

青钱柳叶黑枯病菌CB3(由本申请人分离保存)，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上25℃培养5d，用0.8cm的打孔器制成菌饼，置另一PDA平板中心位置，在距平板中心3cm处放置分离纯化的放线菌菌饼，以不接放线菌菌饼的PDA平板作为对照，试验设3个重复，28℃下培养，直至对照中菌丝扩展至平板边缘，记录实验结果(照相)。相对抑菌率＝(对照菌落扩展直径－处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径×100％。其中，菌落扩展直径(cm)＝菌落的平均直径－0.8(菌饼直径)。

菌株鉴定涉及的相关内容如下：

(1)形态学(培养)特征：革兰氏阳性菌，孢子丝呈现柔曲的对生生长形态，兼性厌氧。NA培养基上培养7d后菌落圆滑，表面褶皱，呈脐突状隆起，边缘完整，基内菌丝体黄褐的橄榄色；气生菌丝体丰富，白色；无可溶性色素。NB液体培养3d发酵液呈黄褐色，澄清透明，菌体生长旺盛。在不同的培养基上的培养特征如表1所示，颜色参照文献(Ridgway R.Colorstandards and color nomenclature[J].1912.)比对完成。

(2)生理生化特征如表2所示。

表1链霉菌QJK-26菌株的培养特征

表2链霉菌QJK-26菌株的生理生化特征

注：“++”表示生长良好；“+”表示能生长或反应阳性；“-”表示不能生长或反应阴性

(3)16S rRNA基因序列分析

提取菌株QJK-26的基因组DNA后，采用通用引物引物27f和1492r进行PCR扩增，将纯化后的扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序，使用EzBioCloud数据库进行16S rRNA基因序列同源性比对分析，查看与同源菌株的相似性情况，初步确定菌株QJK-26的分类地位为链霉菌(Streptomyces sp.)，链霉菌QJK-26菌株很可能是潜在新种，新种鉴定有待后续工作。

实施例2：链霉菌QJK-26对水稻纹枯病菌的体外抑菌活性测定实验。

以水稻纹枯病菌(HN-7，本实验室分离保存)为供试菌，实施平板对峙试验，具体按实施例1所述。

结果表明，链霉菌QJK-26菌株对纹枯病菌菌丝生长的抑制率为71.1％，如表3所示。

表3链霉菌QJK-26菌株对水稻纹枯病菌的体外抑菌活性

实施例3：链霉菌QJK-26防治水稻纹枯病的田间试验。

链霉菌QJK-26发酵液的制备：将保存的菌种接种到NA试管斜面，于28℃培养5d。用接种环从斜面上挑取菌落接种到装有NB培养液的三角瓶中，摇床振荡培养3d(28℃，180r/min)制备种子液，按5％的接种量接种到装有小米培养基的发酵罐中发酵培养48h(28℃，180r/min)。

田间试验在湖南省湘乡市月山镇金坪村进行，该村常年自然发生水稻纹枯病。水稻品种为杂交中稻隆两优华占。将田块分为4×5m的小区，随机区组试验，秧苗移栽后20d和35d，对稻苗喷雾两次，分4种处理，3次重复：(1)清水对照，750L/ha；(2)链霉菌QJK-26发酵悬液(1×10⁸cfu/mL)，750L/ha；(3)井冈霉素(质量分数为20％的可湿性粉剂)，施用量225g/ha，兑水750L/ha。在第二次喷雾处理后30d，按国际水稻所(IRRI)1980年制定的水稻纹枯病分级标准调查病情，随机调查200株。病情指数＝Σ[各级病叶(叶鞘)数×各级相对病级值]/[调查总叶数(叶鞘)]×最高病级值。防治效果(％)＝(对照病情指数―处理病情指数)/对照病情指数×100。

如表4所示，试验结果表明，链霉菌QJK-26菌株对水稻纹枯病的防效达67.1％，略低于井冈霉素的防效(70.9％)，但两者之间没有显著差异(P＞0.05)。

表4链霉菌QJK-26对水稻纹枯病的田间防效

实施例4：链霉菌QJK-26对稻瘟菌的体外抑菌活性测定实验。

以稻瘟菌R01-1菌株(由本申请人实验室保存)为供试菌，实施平板对峙试验，具体按实施例1所述。

如表5所示，结果表明，链霉菌QJK-26菌株对稻瘟菌菌丝生长有明显的拮抗作用，相对抑制率为84.0％。

表5链霉菌QJK-26对稻瘟菌的拮抗作用

实施例5：链霉菌QJK-26防治稻瘟病的田间试验。

田间试验地点同实施例3，该地点常年自然发生稻瘟病。水稻品种为杂交中稻隆两优华占。将田块分为4×5m的小区，随机区组试验，秧苗移栽后20d和40d，对稻苗喷雾，分4种处理，3次重复：(1)清水对照，750L/ha；(2)链霉菌QJK-26发酵悬液(1×10⁸cfu/mL)，750L/ha；(3)三环唑(质量分数为75％的可湿性粉剂)，施用量300g/ha，兑水750L/ha。在第二次喷雾处理后40d，按稻瘟病测报调查规范(GB/T 15790-1995)计算防治效果(防效)。病情指数＝Σ[各级病叶数×各级相对病级值]/[调查总叶数]×最高病级值。防效(％)＝(对照病情指数―处理病情指数)/对照病情指数×100。

如表6所示，试验结果表明，链霉菌QJK-26菌株对稻瘟病的防效达74.8％，与三环唑的防效(75.9％)没有显著差异(P＞0.05)。

表6链霉菌QJK-26对稻瘟菌的田间防效

实施例6链霉菌QJK-26防治青钱柳叶黑枯病菌的温室试验。

将青钱柳叶黑枯病菌(CB3)接种在PDA培养基上，25℃，培养22d，收集分生孢子，用无菌水配制10⁶/mL的孢子悬液。田间取土，晾晒1-2d，碾碎，过筛，用普通塑料喷壶均匀喷洒孢子悬液，充分拌匀，制作带菌土，装入上口径60cm、底部口径为45cm的陶瓷盆中，装土量为陶瓷盆容积的2/3。每盆栽植1年龄健康青钱柳苗，置室外温室培养。培养条件：温度25-28℃(昼)/20℃-23℃(夜)，相对湿度85％—90％，自然光周期。采用下述3中处理：(1)清水对照；(2)链霉菌QJK-26发酵悬液(1×10⁸cfu/mL)；(3)甲基硫菌灵(质量分数为70％的可湿性粉剂)。青钱柳苗栽植前蘸根，将根充分浸泡在上述3种处理液中20min。栽植30d后用上述3种处理液喷雾，让植株充分湿润，喷雾量以液体不下流为止，喷雾处理后60d后调查病情。

病级标准：0级，无叶黑枯症状；1级，1-25％的叶出现叶黑枯症状；2级，26-50％的叶出现叶黑枯症状；3级，51-75％的叶出现叶黑枯症状；76％及以上的叶出现叶黑枯症状。病情指数＝Σ[各级病叶数×各级相对病级值]/[调查总叶数]×最高病级值。防效(％)＝(对照病情指数―处理病情指数)/对照病情指数×100。

如表7所示，试验结果表明，链霉菌QJK-26菌株对青钱柳叶黑枯病的防效达64.8％，低于甲基硫菌灵(P＜0.05)，两者只相差4.3％。

表7链霉菌QJK-26对青钱柳叶黑枯病的温室防效

Claims (4)

1.一种链霉菌生防菌株，其特征在于，其分类命名为Streptomyces sp. QJK-26，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018434，保藏日期为2018年7月2日。

2.如权利要求1所述的链霉菌生防菌株在防治水稻纹枯病中的应用。

3.如权利要求1所述的链霉菌生防菌株在防治稻瘟病中的应用。

4.如权利要求1所述的链霉菌生防菌株在防治青钱柳叶黑枯病中的应用，所述青钱柳叶黑枯病由杜仲拟茎点霉引起。

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