CN111424004B

CN111424004B - 一株亚麻假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN111424004B
Application number: CN202010429380.6A
Authority: CN
Inventors: 常栋; 贾方方; 顾建国; 洪权春; 许跃奇; 闫海涛; 马文辉; 刘冬梅
Original assignee: Henan Tobacco Co ltd Pingdingshan Branch; Shangqiu Normal University
Current assignee: HENAN TOBACCO Co.,Ltd. PINGDINGSHAN BRANCH; Shangqiu Normal University
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-05-20
Also published as: CN111424004A

Abstract

本发明属于微生物菌种领域，特别是指一株亚麻假单胞菌及其应用。所述亚麻假单胞菌已于2020年4月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC NO：19567。本申请的亚麻假单胞菌抑制黑胫病的效率高达94%，可分解过氧化氢酶，不耐盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性。该菌盆栽试验的相对防效大于75%，大田试验的防效高于63%，可显著降低发病率和病情指数。此外，该菌株发酵液可显著促进田间烟株的株高、茎围以及有效叶片数。

Description

一株亚麻假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌种领域，特别是指一株亚麻假单胞菌及其应用。

背景技术

烟草黑胫病是由烟草疫霉菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)引起的一种重要的土传病害，该病在高温、高湿环境下易流行爆发，典型症状为植株矮化、叶片自下而上凋萎发黄、根部和茎部萎缩、坏死，茎髓部呈碟片状。近年来，随着我国烟区连作烟田比例的增加^[3]，烟草黑胫病愈演愈烈，病害严重的地块发病率高达75％，甚至绝收，给我国烟叶生产带来重大威胁。生产上多采用种植抗病品种和通过化学药剂进行黑胫病的防治，但是当前尚未发现对烟草黑胫病免疫种，且品种抗性会随着黑胫病菌生理小种的消长而减低；同时，化学农药易造成环境污染及烟叶中农药残留，长期使用还会使病菌产生抗药性。因此，寻找一种安全、高效、无公害的烟草黑胫病防治方法已成为烟草生产的当务之急。

生物防治可修复和改良作物的微生态环境、抑制植物病害病原菌的生长并激活作物的防御反应，已成为目前国际上病害防治的首选。Luna等从香蕉幼苗中分离到了粘质沙雷菌(Serratia marcascens)，可提高香蕉植株的防御酶活性，进而抑制香蕉幼苗的枯萎病。Larran等^[13]从小麦中分离的内生菌株钩状木霉(Trichoderma hamatum)、青霉属(Penicillium sp.)、芽孢杆菌属和淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)等对小麦黄斑叶枯病具有明显的防治效果。这些研究均为从病害作物的抗病株中分离拮抗菌，除此之外，从其他非寄主植物中寻找生防菌，扩大内生菌的获得范围，也逐渐成为生物防治的重要途径。Prado等分离出的植物内生真菌木质素降解子囊菌(Paraconiothyriumvariabile)对病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生长可起到明显的拮抗作用，并抑制其致病毒素的产生。Romeralo等从地中海松中分离的内生真菌木霉属(Trichodermaspp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等均可对枯梢病病斑的扩展起到有效抑制作用。王兰英等从砂仁(Amomum villosumLour.)中分离得到的内生细菌SRJ-4菌株，对水稻纹枯病的盆栽和田间防效分别可达80.7％、79.4％。余杰颖等从石斛(Dendrobium nobileLindl)中分离的内生菌DEB-2可防治辣椒白星病。上述研究从非寄主作物中分离内生菌，皆取得了较好的防治效果，为进一步的生防菌剂复配研发奠定了基础。然而，当前烟草黑胫病的生防菌获取对象仍然局限于烟草，鲜见从其他不同植物中分离筛选拮抗菌，限制了生防菌株的来源及后期菌剂的研发推广。本研究从构树、枸杞、马铃薯、辣椒、曼陀罗、茄、夹竹桃、烟草等8种不同植物茎内，筛选烟草黑胫病的拮抗菌株，旨在扩大烟草黑胫病微生物防治菌的菌种来源，为研制开发烟草黑胫病生防菌剂提供菌种资源。

发明内容

本发明提出一株亚麻假单胞菌及其应用，解决了使用微生物菌株高效无害防治黑胫病的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一株亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)，所述亚麻假单胞菌已于2020年4月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，CGMCC NO：19567。

所述亚麻假单胞菌为革兰氏阳性杆菌，菌落呈圆形、半透明、无光泽、质地粘稠、边缘完整，无芽孢，菌体大小为0.5-1.0μm×1.5-4.0μm，可分解过氧化氢酶，不耐盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性。

上述的亚麻假单胞菌在高效防治黑胫病领域的应用。

所述亚麻假单胞菌抑制黑胫病的效率为91％-94％。

将亚麻假单胞菌接种于50mLNA液体培养基中，于30-40℃、130-140r/min振荡培养12-15h得到拮抗菌种子液，稀释20倍，每株灌根180-220mL。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请从8种植株茎中共分离出内生菌89株，获得烟草疫霉菌拮抗效果较好的菌株6株，分别为J11、J21(构树)，T3、T23(马铃薯)，G3(枸杞)和KY(烟草)。KY被鉴定为亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)，J11、G3和T3为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，T23为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，J21为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。KY、T23及J11的相对防效较好，盆栽相对防效分别为75.41％、63.93％、70.49％，大田相对防效分别为63.62％、51.11％、52.67％，且对烟株的株高、茎围均有促生作用。这些生防细菌可作为烟草黑胫病生物防治的有效菌剂资源。

2、本申请分离得到一株抑制黑胫病的效率94％的亚麻假单胞菌，为革兰氏阳性杆菌，菌落呈圆形、半透明、无光泽、质地粘稠、边缘完整，无芽孢，菌体大小为0.5～1.0μm×1.5～4.0μm，可分解过氧化氢酶，不耐盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性。该菌盆栽试验的相对防效大于75％，大田试验的防效高于63％，可显著降低发病率和病情指数。此外，该菌株发酵液可显著促进田间烟株的株高、茎围以及有效叶片数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为拮抗菌对烟草疫霉菌的平板拮抗作用对比图。

图2为成熟期不同拮抗菌处理的盆栽防效对比图。

图3为成熟期不同拮抗菌处理的大田防效对比图。

图4为16SrDNA全序列系统发育树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、烟草黑胫病致病菌株的分离鉴定：

从平顶山市郏县烟草种植地黑胫病发病严重地块选取具备烟草黑胫病典型症状的植株(中烟100)，经流水冲洗30分钟，切开茎，取片状髓部，置于胡萝卜固体培养基于28℃恒温培养，待长出菌丝后连续转移3-4次纯化。通过分离和纯化，获得烟草黑胫病病原菌菌株，观察其菌落、菌丝、孢子囊形态，并进行致病性的分析测定。培养基培养的烟草黑胫病菌CTAB法提取基因组DNA，利用通用引物ITS1、ITS4进行扩增，产物连接到克隆载体，送至南京金斯瑞生物有限公司进行测序。测序得到的序列在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST搜索比对，MEGA6.O软件进行Neighbor-Joining分析生成系统发育树，确定菌株为烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)。

二、烟草黑胫病拮抗菌株的分离筛选

1、不同植物内生菌的分离与纯化

采集构树、枸杞、马铃薯、辣椒、曼陀罗、茄、夹竹桃、烟草(发病地区健康烟株)的茎杆样品，按照如下方法进行植物内生细菌的分离：

将待分离植物置于流水下冲洗30分钟后切段，用75％的乙醇、2％次氯酸钠消毒、无菌水冲洗5次后再用灭菌滤纸吸干表面水分，最后用无菌刀切成2-3×3-5mm小段，置于装有灭菌水的三角瓶中，编号。震荡三角瓶，用吸管分别吸1ml菌液，涂抹于培养基上，28℃恒温培养1-3天，挑取不同形状的菌落重新置于新的平板上划线纯化。挑取划线培养的单个菌落移入试管斜面保存，备用。

2、拮抗菌的筛选、鉴定

2.1采用平板对峙培养法筛选2次，将分离出的内生菌和烟草疫霉菌接种到胡萝卜平板培养基上28℃黑暗培养3d。用半径5mm的打孔器将烟草疫霉菌接种到培养基的中心，在菌块离中心15mm处对称两侧接种3μL拮抗菌液(约1.0×10⁶cfu/mL)，倒置，观察黑胫病菌周围有无抑菌带，并测量其抑菌直径和抑菌率，每处理重复3次。选取平板对峙效果较好的拮抗菌按上述方法进行第2次室内拮抗实验。

抑菌率(％)＝[(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)]×100％

抑菌直径(mm)＝对照组病原菌菌落直径－处理组病原菌菌落直径

2.2不同植物源内生菌的分离与平板对峙作用结果：

从构树、枸杞、马铃薯、辣椒、曼陀罗、茄子、夹竹桃、烟草等8种不同植物茎内共分离出89种内生菌，室内平板对峙拮抗筛出10种有较好的拮抗作用的内生菌(表1)。从10株菌株中筛选出6株具有较强拮抗作用的内生菌(图1，表2)，分别为来自构树的J11、J21、G3，马铃薯的T3、T23，及烟草中的KY。平板拮抗试验下该6株拮抗菌株的抑菌带清晰透明，宽度均达到5mm以上，对病原菌的扩展具有明显的抑制作用。以T3、KY和J21的抑菌效果最好，其抑菌直径均达到48mm，抑菌率均高于91％。

表1不同植物茎内的拮抗菌分离筛选

表2拮抗菌对烟草疫霉菌生长的抑制效果

注：表格中的数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(0.01<P<0.05)，下同

2.3不同植物内生拮抗菌的形态观察与理化测试

结合表3的拮抗细菌形态观察和表4的生理生化反应结果可见，KY为革兰氏阳性杆菌，菌落呈圆形、半透明、无光泽、质地粘稠、边缘完整，无芽孢，菌体大小为0.5～1.0μm×1.5～4.0μm，可分解过氧化氢酶，不耐盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性；T23为革兰氏阳性杆菌，产芽孢，芽孢呈圆形，中生或偏生，包囊膨大不明显，菌落呈圆形，乳白色，表面隆起，有光泽，质地粘稠，菌体大小为0.6-0.7μm×2.0-3.0μm，可分解过氧化氢酶，耐盐性强，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均呈阴性；J11、G3和T3的形态和生理生化反应一致，均为革兰氏阳性杆菌，产芽孢，芽孢均为椭圆形，中生或偏生，孢囊略膨大，菌体大小为1.0-1.2μm×3.0-50μm，可分解过氧化氢酶，耐盐性较强，不能利用柠檬酸盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性；J21为革兰氏阳性杆菌，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或偏生，孢囊无明显膨大，菌落呈椭圆形，乳白色，扁平，表面有褶皱，边缘完整，菌体大小为0.7-0.8μm×2.0-3.0μm，生理生化测定各项指标除甲基红中为阴性外，其余各项与J11等相同。6株菌株均呈杆状，革兰氏反应阳性，均不可分解氧化酶。

表3拮抗细菌的形态观察

表4不同拮抗细菌的生理生化反应

注：“+”表示≥90％菌株为阳性，“-”表示≥90％菌株为阴性

菌株鉴定：综合室内平板对峙实验与盆栽防效结果，对拮抗和防病效果较好的拮抗菌，通过形态观察、生理生化测试和16S rDNA序列分析对菌株进行种属鉴定，测序过程和公司同烟草疫霉菌。

3、拮抗菌株对盆栽和田间烟草黑胫病的防治效果测定

从筛选出的拮抗细菌菌株斜面上挑取1环培养物接种于50mlNA液体培养基中，于35℃、140r/min振荡培养12h得到拮抗菌种子液。

选择抑菌活性均达显著水平的6个菌株进行温室盆栽试验，对照组CK为只接种病原菌处理：在烟苗还苗后，用手术刀划伤烟株茎基部，然后，采用灌根法接种10ml烟草黑胫病病原菌；处理1到处理6分别为J11、J21、T3、T23、G3和KY不同拮抗菌组，于烟苗还苗后，先采用灌根法接种拮抗菌发酵液(孢子浓度为1.0×10⁸cfu/mL)，每盆接种10ml，7d后接种烟草黑胫病病原菌10ml，此后每7d接种拮抗菌发酵液1次，发酵液共接种3次。每处理9株，各处理重复3次，接种14d后开始调查发病情况。

大田试验在平顶山市白龙庙村黑胫病高发地块进行，于2019年4月26日移栽，将拮抗菌发酵液稀释20倍，每株灌根200ml，保证其孢子总量同盆栽试验一致，考虑到大田烟株生育期比盆栽长，将大田接种时间间隔定为15d，共灌根3次。每处理63株，共重复3次。以自然条件下未作处理烟株为对照。烟草黑胫病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T 23222-2008)进行。

发病率＝(染病株数/调查总株数)×100％

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100％

相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

盆栽和大田防效测定：

表5不同处理盆栽及大田试验防治效果

盆栽试验在接种烟草疫霉菌两周后，各处理均不同程度地呈现烟草黑胫病的典型症状，于成熟期统计各处理最终的发病情况。其中对照发病率为100％，同对照相比，各拮抗菌处理的发病率和病情指数均得到明显控制，其中以KY的病情指数最低，相对防效最高，达到75.41％。J11、T23次之(表5，图2)。

大田试验于成熟期各处理开始呈现自然发病症状，由于所选试验田为往年黑胫病高发区，观其对照，发病率高达63.68％，极大降低了烟草的产量。采用灌根法接种不同拮抗菌发酵液后，病情得到了明显控制，发病率和病情指数显著降低，防治效果明显，相对防效仍以KY最高，达到63.62％，J11和T23次之，分别为52.67％和51.11％(表5，图3)。

三、拮抗菌培养液灌根对烟株生长的影响

为了解各拮抗菌对烟株农艺性状的影响，进一步调查了不同菌剂处理下烟株的农艺性状指标(表6)：于成熟期，分别从对照组和各处理组(处理1至处理6)中随机选择3株，测量其株高、茎围、有效叶片数、最大叶叶长、叶宽和叶面积。

同对照相比，各处理的株高、茎围均有显著性提高，株高以KY最大，茎围以J11最大；而有效叶片数、叶长、叶宽和叶面积四项指标各处理间差异均不显著。初步表明各拮抗菌株可通过抑制黑胫病病害的发生，进而影响烟株株高、茎围等的生长发育。

表6不同拮抗菌剂处理对大田烟株农艺性状的影响

四、烟草疫霉菌拮抗细菌的16SrDNA鉴定

KY、T23、J21的16SrDNA序列长度为1388bp，1385bp和1397bp，J11菌株、G3菌株和T3菌株的16SrDNA序列长度均为1400bp。将这6种菌株的16SrDNA序列用blast在数据库进行比对，然后用MEAG7建立系统发育树(图4)，KY菌株与Pseudomonas lini处于同一分支，同源性为99％；J11菌株、G3菌株和T3菌株均与Bacilluscereus处于同一分支，同源性为100％；T23菌株与Bacillus pumilus处于同一分支，同源性为100％；J21菌株与Bacillus subtilis处于同一分支，同源性为100％。结合形态观察、生理生化特性和16SrDNA序列同源性分析，KY初步鉴定为亚麻假单胞菌，登录号为KM-349418；J11菌株、G3菌株和T3菌株初步鉴定为蜡状芽孢杆菌，登录号为MK-675099；T23初步鉴定该菌为短小芽孢杆菌，登录号为MG-719573；J21初鉴定该菌为枯草芽孢杆菌，登录号为MK-680816。

五、高效拮抗黑胫病菌株的选定

本申请经二次平板对峙筛选出的6株拮抗菌中，除KY为从烟草中分离的内生菌外，其余5株均为从其他植物中分离筛选，且拮抗效果较好，表明从非寄主植物中亦可获取对烟草黑胫病防效显著的生防细菌，该结论扩展了前人将烟草或其根际土壤作为防治烟草病害生防菌筛选的单一来源的试验方法。此外，本文从烟草中分离筛选出的亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)在烟草黑胫病的生物防治中可实现单独使用室内平板试验抑菌率达到94％以上，盆栽试验达到75％以上，大田试验达到63％以上。

本申请筛选出的J11、G3、T3菌株，虽然同为腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的，其抑菌率、盆栽和大田防效均不稳定，造成这种差异的主要原因是分离纯化内生菌时选用的不同植物来源；另外，该试验工作量大，共持续进行了两年，内生菌的分离及筛选历经了不同的试验操作人员试验批次，也会对试验结果有一定的影响，下一步亟需建立一套高质高效的拮抗菌筛选体系。因此本申请选定KY作为最优的防治菌株，并进行了生物保藏。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株抑制黑胫病的效率为91%-94%的亚麻假单胞菌（Pseudomonas lini），其特征在于：所述亚麻假单胞菌已于2020年4月 13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC NO：19567。

2.根据权利要求1所述的亚麻假单胞菌，其特征在于：所述亚麻假单胞菌为革兰氏阳性杆菌，菌落呈圆形、半透明、无光泽、质地粘稠、边缘完整，无芽孢，菌体大小为0.5-1.0μm ×1.5-4.0μm，可分解过氧化氢酶，不耐盐，可分解利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，好氧性，淀粉酶和甲基红测定均显阳性。

3.权利要求1或2所述的亚麻假单胞菌在高效防治黑胫病领域的应用。

4.权利要求3所述的应用的方法，其特征在于：将亚麻假单胞菌接种于50mLNA液体培养基中，于30-40℃、130-140r/min振荡培养12-15h得到拮抗菌种子液，稀释20倍，每株灌根180-220mL。