CN104164394B - 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。本发明拮抗菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH‑1，微生物保藏号为CGMCC NO.9025。本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH‑1是从杨树根部土壤中分离获得，能防治杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌和枣缩果病菌引起的植物病害，并且本发明的拮抗菌产生的抑菌挥发物也能防治杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌和枣缩果病菌引起的植物病害。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH‑1是一种防效高，防治范围广，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株产抑菌挥发物的植物病原真菌的拮抗细菌及其应用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。
背景技术
植物病害的生物防治是指通过人以外的一种或多种生物来降低病原菌数量或减弱病原菌的致病活力，从而减少病害的发生，并且有利于有益生物如作物、树木、动物、益虫及微生物。植物病害生物防治上可供利用的微生物种类包括真菌、放线菌、细菌、病毒甚至高等植物等。其中，枯草芽孢杆菌是最常用到的拮抗微生物之一。
枯草芽胞杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性细菌，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无害，不污染环境。它生长速度快、营养需求简单，能产生耐热抗逆的芽孢，在植物的表面易于存活、定殖和与繁殖，而且生产枯草芽胞杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方面，存储期长，是一种理想的生防微生物。近几年来，国内外专家进行了大量研究，发现枯草芽孢杆菌有很多的抑菌机制。包括营养和空间位点的竞争；分泌抗菌物质，如抗菌肽和蛋白类物质等；溶菌作用，使病原菌菌体破裂、解体等以及促进植物生长的作用。
植物病害是世界上一种非常普遍的自然灾害。植物病害在世界范围分布广泛，其种类繁多，侵染的寄主植物广，造成生态、经济以及社会的损失巨大。例如，板栗疫病几乎毁灭了全部美国的美国栗林。榆树荷兰病的发生使欧洲许多国家的城市庭园、行道榆树大量死亡。据联合国粮农组织((FAO)统计，每年因遭受植物病害引起的减产平均损失为总产量的10％～15％。植物病害在我国也有广泛的发生，其中杨树炭疽病就是一种重要的病害。杨树是我国造林绿化、生态环境建设和社会经济发展的重要树种，具有适应性广、生长速度快等特点。目前，我国杨树林面积已经超过800万ha，蓄积量达到4.29亿m3，居世界首位，超过其他国家的杨树人工林面积的总和。近年来，杨树炭疽病等病害的发生给我们国家造成了巨大的经济和生态损失。杨树炭疽病的主要病原为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。其主要侵染杨树的叶片和枝条，引起早期的落叶和枯梢，导致树势降低而诱发其它次期性生物灾害或枯死。我国南北杨树栽培区中杨树炭疽病均有不同的危害。陕西省毛白杨(Populus tomentosa)当年扦插苗发病株率可达78％，4～5年幼树发病株率可达100％，叶片受害率达100％。京津冀地区作为防护林、行道树广泛栽植的北京杨(Populus×beijingens)的炭疽病发病尤为严重，2005年延庆、昌平防护林的病株率高达100％。
目前，植物病害的防治主要是使用化学农药(杀菌剂)，化学农药的长期使用不仅使植物病原菌产生抗药性，而且会污染环境，影响人类健康，破坏生态环境。随着可持续发展战略的实施，人们越来越意识到了使用化学农药的弊端。自20世纪80年代中期，在生物防治蓬勃发展的带动下，植物病害的生物防治作为了一种安全、有效的控制植物病害的新途径，渐渐被人们所重视，并成为热点研究方向。应用枯草芽孢杆菌来防治植物病害已经有很多的报道。从杨树根部土壤中分离筛选获得的一株能广谱的高效抑制植物病原真菌并能产生抑菌挥发物的拮抗菌，使生物防治应用范围更加广泛、使用更加灵活，拮抗菌产生的抑菌挥发物为防治植物真菌病害提供了一个新的思路和方法，这些对于植物真菌病害的防治具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是针对植物病害防治中存在的植物病原菌产生抗药性的技术问题提供一株抑菌谱广、植物病原真菌抑制效率高、而且还能产生抑菌挥发物的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1。
本发明从杨树根部土壤中分离筛选获得的拮抗菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1对多种植物病原真菌具有高效拮抗作用并且还能产生挥发性抑菌物质，是一种广谱生防细菌菌株，应用本发明的拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌株解决了目前植物病害化学农药防治难，环境污染严重的问题。
本发明的目的之二是提供上述拮抗菌株Bacillus subtilis ZSH-1在防治植物病原真菌方面的用途，拮抗菌株Bacillus subtilis ZSH-1在防治杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌和枣缩果病菌上的多种应用，特别是在防治由胶孢炭疽菌引起的杨树炭疽病方面的用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的拮抗菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1，其微生物保藏号是：CGMCC NO.9025；分类命名是：Bacillus subtilis；保藏时间：2014年4月9日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的拮抗菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1能高效防治杨树炭疽病，抑制杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌和枣缩果病菌；而且还能产生抑菌挥发物，产生的抑菌挥发物也能很好的抑制杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌和枣缩果病菌的生长。
本发明所述拮抗杨树炭疽病菌的细菌菌株的形态特征：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约0.5-0.8um×1.2-2.5um，有芽孢，周生鞭毛，能运动。
菌体在LB培养基平板上呈白色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整。
其中，每1000ml所述LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，水1000ml，pH7.0-7.2。
本发明拮抗杨树炭疽病菌的细菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1的分离筛选方法：
1)取杨树根部土壤5g，装入装有45mL无菌水的灭菌三角瓶中，于28℃下180rpm振荡30min，静置，得到的菌悬液(即为10-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的土壤溶液)；然后用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-3、10-4、10-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养。
2)连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在LB培养基平板上进行划线纯化培养，获得多株杨树根部土壤细菌菌株，并在4℃下保存备用。
3)将杨树炭疽病菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC80308)接种于马铃薯琼脂培养基PDA(每1000mL含有马铃薯200g，葡萄糖20g,，琼脂粉17g，水1000ml，pH7.0-7.2)平板上，在28℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，并将新鲜的、直径为6mm的杨树炭疽病菌菌饼置于另一PDA平板中央，接着用接种环分别挑取少许步骤2)分离纯化后的土壤细菌，并在距离杨树炭疽菌菌饼2cm处轻轻划线，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。
4)培养7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树炭疽病菌具有最强抑制效果，抑菌带最宽的土壤细菌菌株。
观察结果表明ZSH-1菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度≥10mm。
本发明枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1的筛选及防治杨树炭疽病菌特性测定采用的培养基如下：
筛选培养基(LB平板培养基)成分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，水1000ml，pH7.0-7.2。
NB液体培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，水1000ml，pH7.0-7.2。
马铃薯琼脂(PDA)平板培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，水1000ml，pH7.0-7.2。
发酵培养基(液体)成分：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NH4Cl 3.0g，Na2HPO4 1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000ml，pH7.0-7.2。
TYB固体培养基成分：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏3g，葡萄糖20g，KH2PO40.5g，MgSO4 0.3g，MnSO4 0.07g，FeSO4 0.3g，柠檬酸0.3g，琼脂15g，水1000ml，pH7.0-7.2。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的培养特性：
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1生长温度范围为10℃～50℃，最适生长温度范围为28℃～30℃；生长pH范围为5～10，最适生长pH范围为6～7.5；能在0.2％～10％的NaCl浓度的NB培养基中生长。能氧化L-阿拉伯糖、甘露醇、D-木糖，产酸；能氧化葡萄糖，但不产气，接触酶、氧化酶、V-P实验呈阳性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵磷脂的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸盐，不能利用柠檬酸盐，具有糖酵解能力、硝酸盐还原能力，能产硫化氢，能液化明胶，石蕊牛奶实验变红。
根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株ZSH-1的形态特征、生理生化特性以及系统发育树分析鉴定菌株ZSH-1为Bacillus属菌株，并确认本发明菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ZSH-1。
本发明还包括以上述菌株的能高效防治杨树炭疽病的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1，微生物保藏号为CGMCC NO.9025的各种代谢产物。
以上述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1，微生物保藏号为CGMCC NO.9025为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明的拮抗杨树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1在防治杨树炭疽病中的应用；所述应用还包括枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、无菌滤液、培养物、生长过程中产生挥发性代谢物(抑菌挥发物)在防治杨树炭疽病中的应用；所述应用又包括枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、抑菌挥发物对杨树炭疽病病菌的离体防治。
其中，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌液、无菌滤液及抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的平板抑制作用明显。菌株ZSH-1的菌液在6d内对杨树炭疽病菌的平板抑制率达到100％，ZSH-1的无菌滤液在6d内对杨树炭疽病菌的平板抑制率随着培养时间的增加而减小，在第1d时抑制率达到100％，在第6d时抑制率达到48.49％。ZSH-1生长过程中产生挥发性代谢物(抑菌挥发物)在60h内对杨树炭疽病的平板抑制率随着培养时间的增加而增大，在60h时，其抑制率达到30.06％。
另外，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌液和生长过程中产生挥发性代谢物(抑菌挥发物)对杨树炭疽病菌的离体叶片防治效果明显。ZSH-1的菌液在不同的处理下对杨树炭疽病菌的离体叶片防治效果明显。其中，先在离体叶片上接种ZSH-1菌液，培养2d后再接种杨树炭疽病菌孢子的处理的离体叶片防治效果最好，抑制率达到100％。ZSH-1的抑菌挥发物对杨树炭疽病菌也有很好的离体叶片防治效果，其抑制率达到35.83％。
另一方面，本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1用于拮抗杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌；还包括枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、无菌滤液、培养物、生长过程中产生挥发性代谢物(抑菌挥发物)用于拮抗杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌。
ZSH-1无菌滤液对杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、海棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌的抑制效果强烈，对苹果腐烂病菌也有很好的抑制作用，其中对杨树腐烂病菌的抑制率达到100％。另外，ZSH-1抑菌挥发物也对这些植物病原真菌的平板抑制效果明显，其对杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、海棠腐烂病菌的抑制活性很强，对苹果腐烂病菌和枣缩果病菌的抑制活性也比较好，对尖孢镰刀菌也有一定的抑制活性，其中，ZSH-1抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的抑制作用最强，抑制率达到63.22％。
本发明的拮抗杨树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1在防治杨树炭疽病方面的作用极为显著，对杨树炭疽病菌有很强的抑制作用，能明显抑制杨树炭疽病菌菌丝的生长，并且枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1能产生抑菌挥发物，抑制杨树炭疽病菌菌丝的生长。另外，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的无菌滤液和抑菌挥发物对杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌也有很好的平板抑制活性。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1作为生物防治菌株，具有很好的防治杨树炭疽病菌引起的植物病害的潜力，同时它也有生物防治菌株来防治杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌引起的植物病害的潜力，为防治由杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1在LB平板培养基的菌落形态图。
图2为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的显微形态图(10×500)。
图3为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1基于16S rDNA序列的系统发育树；；图中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。
图4为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板抑制效果图，其中A为空白对照组平板培养图；B为ZSH-1菌液对杨树炭疽病菌抑制效果图；C为ZSH-1无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板抑制效果图。
图5为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1培养过程中产生抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的平板抑制效果图，其中A为空白对照组平板培养图；B为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1抑菌挥发物对杨树炭疽病菌抑制效果图。
图6为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1对杨树炭疽病的离体叶片防治效果图，其中A为空白对照组的离体叶片防治效果图；B为处理Ⅰ组的离体叶片防治效果图；C为处理Ⅱ组的离体叶片防治效果图；D为处理Ⅲ组的离体叶片防治效果图。
图7为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1培养过程中产生抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的离体叶片防治效果图，其中A为对照组的离体叶片防治效果图；B为拮抗处理组离体叶片防治效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的分离、筛选及其鉴定
1、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1的分离与筛选
本发明的菌株采集自北京市海淀区北京林业大学森林保护实验站杨树实验田土壤中。
1A)取杨树根部土壤5g，装入装有45mL无菌水的灭菌三角瓶中，置于摇床上，在28℃条件下180rpm振荡30min，静置，得到的菌悬液(即为10-1浓度的土壤稀释液)；然后采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-3、10-4、10-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；每个处理设置水平重复3组，其中LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，水1000ml，pH7.0-7.2。
1B)连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在LB培养基平板上进行划线纯化培养，获得多株土壤细菌菌株，并在4℃下保存备用。
1C)将杨树炭疽病菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC80308)接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在28℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，并将新鲜的、直径为6mm的杨树炭疽病菌菌饼置于另一PDA平板中央，接着用接种环分别挑取少许步骤1B)分离纯化后的土壤细菌，并在距离杨树炭疽菌菌饼2cm处轻轻划线，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次，其中，PDA平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，水1000ml，pH7.0-7.2。
1D)培养7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树炭疽病菌具有最强抑制效果的1株杨树土壤细菌菌株。
结果表明ZSH-1菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度≥10mm。
2、菌株ZSH-1的鉴定
参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社，2001:349-398)以及蔡妙英等人编著的《芽孢杆菌属》(北京:农业出版社，1983:19-108)中介绍的方法以及16S rDNA对ZSH-1菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
2A)枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1在LB培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，水1000ml，pH7.0-7.2)平板上呈白色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整，如图1所示。
2B)通过显微镜观察表明Bacillus subtilis ZSH-1菌体大小约0.5-0.8um×1.2-2.5um之间，有芽孢，周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，如图2所示。
2C)生化实验结果表明，Bacillus subtilis ZSH-1，好氧，接触酶、氧化酶、V-P实验呈阳性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵磷脂的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸盐，不能利用柠檬酸盐，具有糖酵解能力、硝酸盐还原能力，能产硫化氢，能液化明胶，石蕊牛奶实验变红。
依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对Bacillus subtilis ZSH-1菌株的形状、大小、其它生理生化反应进行检测，明确形态和基本生理生化特性。本发明的Bacillussubtilis ZSH-1菌株的形态和基本生理生化特征如表1所示。
表1 Bacillus subtilis ZSH-1菌株的形态和基本生理生化特性
| 项目 | 结果 | 项目 | 结果 |
| 菌体大小 | 0.5-0.8um×1.2-2.5um | 丙二酸盐利用 | + |
| 菌落颜色 | 白色，不透明 | 淀粉水解 | + |
| 菌落形状 | 光滑，中央隆起，边缘完整 | 硫化氢生成 | + |
| 菌体形态 | 杆状 | 苯丙氨酸脱氨酶测定 | － |
| 鞭毛 | 周生 | 石蕊-牛奶 | 变红 |
| 芽孢 | + | 形成吲哚 | － |
| 革兰氏染色 | + | 在pH＝5.7营养肉汤中生长 | + |
| 运动性 | + | 硝酸盐还原 | + |
| 接触酶反应 | + | 酪氨酸水解 | － |
| 氧化酶反应 | + | 酪蛋白水解 | + |
| 厌氧生长 | － | 卵黄水解 | + |
| 甲基红反应 | － | 利用葡萄糖产酸 | + |
| V-P反应 | + | 利用D-木糖产酸 | + |
| V-P反应后pH值 | 6.89-7.13 | 利用L-阿拉伯糖产酸 | + |
| 10％NaCl生长 | + | 利用甘露醇产酸 | + |
| 明胶液化 | + | 利用葡萄糖产气 | － |
| 柠檬酸盐利用 | － |
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
2D)挑取少量单菌落，放入盛有200ul无菌水的EP管中，100℃煮沸10min，后10000r/min、2min，取上清，4℃保存，即为菌株ZSH-1的基因组DNA。以菌株ZSH-1的基因组DNA为模板，采用如下引物：
63f：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’
1387r：5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’
(参见Marchesi JR等，Design and evaluation of useful bacterium-specificPCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA，Applied andenvironmental micro-biology,1998,64(2):795-799)进行PCR扩增，扩增体系为20ul，含有10×TaqE缓冲液2ul、dNTP1.6ul、正反向引物各1ul、DNA Taq聚合酶0.1ul、DNA模板1ul，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为20ul。扩增条件：94℃4min，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min，最后系统温度降至4℃，反应结束。
PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，PCR扩增出约为1.3kb左右的产物片段，测序结果表明序列含有1281个碱基，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将该序列经Chromas序列拼接软件校正，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，采用MEGA5.0软件用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，进行系统发育分析，各支上的数字是1000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比。
通过在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现菌株ZSH-1与Bacillus subtilis(EF830714)的同源性达到99％。基于系统发育分析(见图3)，发现菌株ZSH-1与菌株Bacillus subtilis(EF830714)亲缘性最近，并聚在同一分支中，而与其他菌株的亲缘性较远。结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌。
结合菌株的形态特征及生理生化特性以及16S rDNA，鉴定菌株ZSH-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株已于2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC NO.9025。
实施例2 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1生物学特性的探究
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有40mL NB液体培养基(每1000mL含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml pH7.0-7.2)的100mL的三角瓶中，然后置于摇床上，于28℃、200rpm振荡培养1d，制得Bacillussubtilis ZSH-1菌株种子液，其中，Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.3；
1B)按照1％(V/V)的接种量将Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液接入到装有40mL的不同盐(NaCl)浓度、pH值的NB液体培养基的100mL三角瓶中，于28℃，200rpm的条件下振荡培养2d后，分别吸取0.4mL的Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液接入到装有40mLNB液体培养基的100mL的三角瓶中，分别置于不同温度，200rpm条件下振荡培养2d，然后将各个培养液稀释10倍后测定OD600值。
测定结果表明：Bacillus subtilis ZSH-1菌株能在pH范围为5.0～10.0的条件下能够生长，在偏酸的条件下均生长良好，最适生长pH范围为6～7.5；菌株ZSH-1在10℃～50℃的条件下能够生长，其中最适生长温度温度范围为28℃～30℃；在NaCl浓度为0.2％～10％的NB培养基中菌株ZSH-1能够生长，最适生长NaCl浓度为2％～5％。菌株的生物学特性如表2所示。
表2 Bacillus subtilis ZSH-1菌株的生物学特性
注：“+++”表示生长最好，“++”表示生长较好，“+”表示生长好，“-”不能生长。
实施例3 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液和无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000ml，pH7.0-7.2)的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)，其中，Bacillussubtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5，该种子液即为平板拮抗作用测定所用的菌液，备用；
1B)按照1％(V/V)的接种量，将ZSH-1菌株种子液接种到装有100mL发酵培养基(液体)(每1000mL含有葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NH4Cl 3.0g，Na2HPO4 1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000ml，pH7.0-7.2)的500mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的滤液在4℃，12000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.45um细菌滤膜过滤除菌，得到本发明枯草芽孢杆菌ZSH-1无菌滤液，备用；
1C)分别吸取步骤1A)制备的ZSH-1菌液、步骤1B)制备的ZSH-1无菌滤液各自混入到灭菌、冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中菌液、无菌滤液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的杨树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)菌饼，分别作为处理组Ⅰ和处理组Ⅱ；对照组为在PDA培养基中倒入与菌液、无菌滤液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的杨树炭疽病菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，每天测量菌落直径，计算抑制率，直到对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上为止，其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。
其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。
测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液和无菌滤液对杨树炭疽病都有很好的拮抗活性(如表3，图4所示)；其中ZSH-1菌液对杨树炭疽病菌的平板抑制率从培养1d到培养6d都为100％(图4B)；ZSH-1无菌滤液对杨树炭疽病的平板抑制作用随着培养时间的增加而不断减小，在第1d时，ZSH-1无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板抑制率达到100％，到第6d时，ZSH-1无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板抑制率仍达到48.49％(图4C)。
表3 Bacillus subtilis ZSH-1菌液及无菌滤液对杨树炭疽病菌的平板拮抗活性
实施例4 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1无菌滤液对其他植物病原真菌的平板拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000ml，pH7.0-7.2)的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)，其中，Bacillussubtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5；
1B)按照1％(V/V)的接种量，将ZSH-1菌株种子液接种到装有100mL发酵培养液(液体)(每1000mL含有葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NH4Cl 3.0g，Na2HPO4 1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000ml，pH 7.0-7.2)的500mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的滤液在4℃，12000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.45um细菌滤膜过滤除菌，得到本发明枯草芽孢杆菌ZSH-1无菌滤液，备用；
1C)吸取ZSH-1无菌滤液混入到灭菌、冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中无菌滤液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板，接着在不同的平板中央分别各自接入直径为6mm的新鲜的植物病原真菌菌饼，作为处理组1-6，其中所述植物病原菌如表4所示：
表4 其他植物病原菌的名称、来源
| 病原菌的名称 | 来源 |
| 杨树腐烂病菌Valas sordida | 中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC8114 |
| 柳树腐烂病菌Valas sordida | 中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC86011 |
| 苹果腐烂病菌Valsa mali | 中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC7267 |
| 海棠腐烂病菌Valsa ceratosperma | 中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC84640 |
| 尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum | 中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CFCC82468 |
| 枣缩果病菌Fusicoccum aesculi | 河南农业大学，保藏编号ZS082 |
对照组为在PDA培养基中倒入与无菌滤液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在不同的平板中央分别各自接入直径为6mm的新鲜的如表5中所示的植物病原菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，等到对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，测量菌落直径，菌落直径采用十字交叉法测定，计算抑制率，菌落直径法测抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。
其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。
测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1无菌滤液对多种植物病原真菌均有平板抑制活性(如表5所示)。ZSH-1无菌滤液对杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、海棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌的抑制效果强烈，对苹果腐烂病菌也有很好的抑制作用，其中对杨树腐烂病菌的抑制率达到100％。
表5 Bacillus subtilis ZSH-1无菌滤液对其他植物病原真菌的平板拮抗活性
| 病原菌 | 拉丁学名 | 抑制率(％) |
| 杨树腐烂病菌 | Valas sordida | 100.00±0.00 |
| 柳树腐烂病菌 | Valas sordida | 89.09±1.91 |
| 苹果腐烂病菌 | Valsa mali | 30.81±9.51 |
| 海棠腐烂病菌 | Valsa ceratosperma | 97.81±1.82 |
| 尖孢镰刀菌 | Fusarium oxysporum | 74.06±0.59 |
| 枣缩果病菌 | Fusicoccum aesculi | 82.84±0.64 |
实施例5 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1培养过程中产生的挥发性代谢物对杨树炭疽病的平板拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)备用，其中，Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5；
1B)菌株ZSH-1挥发物抑菌活性的测定采用二分格培养皿法进行，具体方法如下：
先在二分格培养皿的一侧倒上本发明的拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1生长的TYB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏3g，葡萄糖20g，KH2PO40.5g，MgSO4 0.3g，MnSO4 0.07g，FeSO4 0.3g，柠檬酸0.3g，琼脂15g，水1000ml，pH7.0-7.2)、另一侧倒上病原菌杨树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长的PDA培养基，待凝固后，吸取100ul步骤1A)制备的ZSH-1菌液到TYB平板上，用涂布器将菌液均匀涂布在平板上，作为拮抗菌处理组；对照组是在TYB平板上涂布等量的无菌水，然后放置于30℃恒温培养箱中培养1d；
1C)在拮抗菌平板的另一边的PDA平板上接上6mm新鲜的杨树炭疽病菌菌饼，用双层封口膜将二分格培养皿封住，倒置放置于28℃恒温培养箱中培养，每隔12h测量一次菌落直径，计算抑制率，直到对照组菌落直径达到培养皿直径一半的3/4以上为止。其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。
其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。
测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1生长过程中产生抑菌挥发性气体，该种抑菌挥发性气体能显著抑制杨树炭疽病菌，抑菌挥发性气体对杨树炭疽病有很好的拮抗活性(如表6，图5所示)。ZSH-1生长过程中产生的抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的抑制率随着培养时间的增加而不断增大。当培养时间为60h时，菌株ZSH-1抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的平板抑制率达到30.06％(图5B)，菌落生长直径明显比对照组(图5A)小。
表6 Bacillus subtilis ZSH-1抑菌挥发物对杨树炭疽病菌的平板拮抗活性
实施例6 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1培养过程中产生的挥发性代谢物对其他植物病原真菌的平板拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)备用，其中，Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5；
1B)菌株ZSH-1挥发物抑菌活性的测定采用二分格培养皿法。具体方法如下：
先在二分格培养皿的一侧倒上本发明拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1生长的TYB培养基、另一侧倒上如表5所述的其他植物病原菌生长的PDA培养基，待凝固后，吸取50ul步骤1A)制备的ZSH-1菌液到TYB平板上，用涂布器将菌液均匀涂布在平板上，作为处理组1-6；对照组是在TYB平板上涂布等量的无菌水，然后放置于30℃恒温培养箱中培养1d；
1C)在每个处理组的拮抗菌平板的另一侧的PDA平板上分别接上如表5所示的直径为6mm新鲜的植物病原真菌菌饼，用双层封口膜将二分格培养皿封住，倒置放置于28℃恒温培养箱中培养，等到对照组菌落直径达到培养皿直径一半的3/4以上时，测量菌落直径，计算抑制率。其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。
其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。
测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1在培养过程中产生抑制多种病原菌生长的抑菌挥发性气体，产生的抑菌挥发性气体对多种植物病原真菌具有显著的拮抗活性(如表7所示)。其中，ZSH-1抑菌挥发性气体对杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、海棠腐烂病菌的拮抗活性最强，对苹果腐烂病菌和枣缩果病菌的拮抗活性比较好，对尖孢镰刀菌也有一定的拮抗活性，其中，抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的抑制作用能达到63.22％。
表7 Bacillus subtilis ZSH-1抑菌挥发物对植物病原真菌的平板拮抗活性
| 处理组 | 病原菌 | 拉丁学名 | 抑制率(％) |
| 1 | 杨树腐烂病菌 | Valas sordida | 63.22±4.21 |
| 2 | 柳树腐烂病菌 | Valas sordida | 46.72±1.88 |
| 3 | 苹果腐烂病菌 | Valsa mali | 17.40±0.28 |
| 4 | 海棠腐烂病菌 | Valsa ceratosperma | 44.44±5.61 |
| 5 | 尖孢镰刀菌 | Fusarium oxysporum | 7.81±3.13 |
| 6 | 枣缩果病菌 | Fusicoccum aesculi | 33.05±2.61 |
实施例7 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1对杨树炭疽病菌的离体叶片防治试验
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)备用，其中，Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5；
1B)用无菌水冲洗杨树炭疽病菌平板，得到杨树炭疽病菌孢子，配成浓度为1.0×106spores/mL的孢子悬浮液备用；
1C)选取大小一致新长出来的杨树叶片，进行表面消毒，先用75％的乙醇浸泡1min，然后用2％的次氯酸浸泡30s，用无菌水漂洗三次，得到表面消毒后的杨树叶片备用；
1D)在无菌培养皿里垫上一块无菌吸水滤纸，再加3mL无菌水在滤纸上，将表面消毒后的杨树叶片背面朝上放在滤纸上，用无菌棉浸湿后包住叶柄；然后用步骤1A)制备的ZSH-1菌液及杨树炭疽病菌孢子悬浮液接种叶片。处理设3种接种处理：处理Ⅰ为在表面消毒后的杨树叶片背面同时接种ZSH-1菌液和杨树炭疽病菌孢子悬浮液，即将ZSH-1菌液和杨树炭疽病菌孢子悬浮液同时点在叶片背面；处理Ⅱ为先在叶片背面接种杨树炭疽病菌孢子悬浮液，培养2d后再在叶片背面接种ZSH-1菌液；处理Ⅲ是先在叶片背面接种ZSH-1菌液，培养2d后再将杨树炭疽病菌悬浮液接种于叶片背面；以只接种杨树炭疽病菌孢子悬浮液作为对照处理组，每个处理三次重复。接种后将杨树叶片置于28℃保湿培养8d，测量发病面积，计算抑菌率，抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组病斑面积—处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。
测定结果表明：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1对杨树炭疽病有很好的离体叶片防治效果(如表8，图6所示)。其中处理Ⅲ防治效果最好(图6D)，抑制率达到100％，其次是处理Ⅰ(图6B)，其抑制率也能达到63.99％，处理Ⅱ也有一定的防治效果(图6C)，说明菌株ZSH-1用在预防和前期防治杨树炭疽病上作用明显。
表8 ZSH-1菌株对杨树炭疽病菌离体叶片防治效果
| 处理 | 处理Ⅰ | 处理Ⅱ | 处理Ⅲ | 对照 |
| 病斑面积(cm2) | 2.27±0.13 | 4.97±0.30 | 0 | 6.30±0.26 |
| 抑制率(％) | 63.99±2.11 | 21.08±4.81 | 100±0.00 | 0 |
实施例8 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1产生的挥发性代谢物对杨树炭疽病菌的离体叶片防治试验
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1菌株，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液(即ZSH-1菌液)备用，其中，Bacillus subtilis ZSH-1菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.5；
1B)选取大小一致新长出来的杨树叶片，进行表面消毒，先用75％的乙醇浸泡1min，然后用2％的次氯酸浸泡30s，用无菌水漂洗三次，得到表面消毒后的杨树叶片备用；
1C)菌株ZSH-1挥发物对杨树炭疽病菌的离体防治效果采用二分格培养皿法测定，具体操作方法如下：
在二分格培养皿一侧倒上本发明拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1生长的TYB培养基，另一侧垫上无菌滤纸片，待培养基凝固后，吸取100ul菌株ZSH-1菌液到TYB平板上，用涂布器将菌液均匀涂布在平板上，作为拮抗菌处理组；对照组是在TYB平板上涂布等量的无菌水，然后放置于30℃恒温培养箱中培养1d；
1D)在二分格培养皿另一侧放置的滤纸片上加入2 mL无菌水，将表面消毒后的杨树叶片背面朝上放在滤纸上，用无菌棉浸湿后包住叶柄。在叶背面中央位置接上直径为6mm的新鲜杨树炭疽病菌菌饼，用两层封口膜将二分格培养皿封住，放置于28℃恒温培养箱中培养，3d后，计算抑菌率，抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照组病斑面积—处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。
测定结果表明：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZSH-1在生长过程中产生抑制杨树炭疽病菌的抑菌挥发物(挥发性代谢产物)，产生的抑菌挥发物对杨树炭疽病的离体叶片防治效果(如表9，图7所示)显著。在ZSH-1挥发物的作用下，3d后处理组杨树叶片上的病斑面积(图7B)明显比对照组(图7A)小，抑制率达到35.83％。
表9 ZSH-1菌株抑菌挥发物对杨树炭疽病菌离体叶片防治效果
| 处理 | 处理 | 对照 |
| 病斑面积(cm2) | 0.84±0.10 | 1.31±0.35 |
| 抑制率(％) | 35.83±7.27 | 0 |
Claims (9)
1.一株拮抗植物病原真菌的细菌菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZSH-1，其微生物保藏号为CGMCC NO.9025。
2.如权利要求1所述的细菌菌株，其特征是所述植物病原菌为杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌。
3.如权利要求1所述的细菌菌株的菌株培养物。
4.如权利要求1所述的细菌菌株的菌株发酵培养液、发酵培养液的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物。
5.如权利要求1或2所述的细菌菌株为活性成分的生物菌剂。
6.如权利要求1所述的细菌菌株在拮抗杨树炭疽病中的应用。
7.如权利要求1所述的细菌菌株在拮抗植物病原菌中的应用，其中，所述的病原菌为杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌。
8.如权利要求3所述的菌株培养物在拮抗病原菌中的应用，其中，所述病原菌为杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌。
9.如权利要求4所述的菌株发酵培养液、发酵培养液的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物在拮抗病原菌中的应用，其中，所述病原菌为杨树炭疽病菌、杨树腐烂病菌、柳树腐烂病菌、苹果腐烂病菌、甘棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、枣缩果病菌。
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| CN102586130A (zh) * | 2011-01-14 | 2012-07-18 | 辽宁省农业科学院 | 能防治葡萄炭疽病的生防菌株、菌剂及其应用 |
| CN103114055A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-05-22 | 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌9a及其应用 |
| CN103194415A (zh) * | 2013-04-24 | 2013-07-10 | 牛赡光 | 一株枯草芽孢杆菌及其应用 |
-
2014
- 2014-08-04 CN CN201410379855.XA patent/CN104164394B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475922A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-07-08 | 中南林业科技大学 | 一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌y13及其应用 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| 芒果炭疽病拮抗细菌筛选及生防潜能测定;李春玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)农业科技辑》;20130215;摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104164394A (zh) | 2014-11-26 |
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