CN109266589B - 一株抑制炭疽菌和镰刀菌的杰米拉类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抑制炭疽菌和镰刀菌的杰米拉类芽孢杆菌及其应用。本发明从深海沉积物中分离获得一株杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)，该菌株已于2018年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16231。该菌株对多种植物病原菌均有广谱抗性，对由胶孢炭疽菌引起的果树(柑橘、苹果、葡萄)炭疽病和由尖孢镰刀菌引起的蔬菜枯萎病均具有良好的防治效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术防治领域，具体涉及一株杰米拉类芽孢杆菌及其在抑制病原真菌与防治真菌病害中的应用。
背景技术
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)是分布最广泛，寄主最多的一种病原菌，可以为害果树、蔬菜、林木等。苹果炭疽病是危害果实上的重要病害，在发病果园，一般病果率30％左右，严重的可达50％～60％，在易感病的品种上，可导致毁灭性损失。柑橘炭疽病是我国柑橘产区普遍发生的病害，该病主要危害叶片、枝条、花和果实，造成大量落叶、枝条枯死、大量落花和落果，带菌果实在贮藏期间继续危害，从而影响食用品质和商品价值，造成了严重的经济损失。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生，镰刀菌经常侵染寄主植物的维管束系统，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡，影响产量和品质。
目前生产上常采用化学药剂防治植物真菌病害，这样不仅严重污染生态环境，而且增加农产品中有毒化学物质的残留量，对人类健康带来潜在危害，同时也易诱导病原菌抗药性的产生。生物防治具有无毒、无残留、无致病性、对人畜安全、环境相容性好等优点，所以必将推动农业的可持续发展。如今，对于生物防治的研究已经成为国内外的研究热点，利用生防细菌来防治植物病害是生物防治的一种主要手段。经检索，目前还没有杰米拉类芽孢杆菌用于植物真菌病害生物防治的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04以及在防治炭疽菌和镰刀菌引起的炭疽病和枯萎病方面的应用。本发明的菌株具有抗菌谱广、防治效果好、对环境友好的优势，因而具有良好的开发应用前景。
本发明所提供的菌株为杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)ZDC-04，分离于东海海底沉积物，已于2018年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.16231。该菌株具有以下生物学特性：菌体长杆状，大小为(0.5～1.1)μm×(3.2～5.2)μm，产芽孢，革兰氏染色呈阳性，在LB培养基上30℃培养48h，菌落呈白色，圆形，边缘凸起。
本发明的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的培养方法包括：
(1)普通培养保存采用2216E培养基或LB培养基：酵母提取物1g，蛋白胨5g，琼脂15-20g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，水1000mL，pH调至7.0-7.2。
(2)液体培养采用2216E液体培养基或LB液体培养基：酵母提取物1g，蛋白胨5g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL，pH调至7.0-7.2。
(3)发酵培养基：玉米粉15g，豆粕粉10g，麸皮8g，蔗糖6g，碳酸钙5g，磷酸二氢钾5g，氯化钠2g，水1000mL，调节pH为6.5。
本发明还提供了一种杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04制备的发酵液，优选采用上述的发酵培养基发酵制得。
本发明还提供了杰米拉类芽孢杆菌菌株ZDC-04及其发酵液在防治胶孢炭疽菌或者尖孢镰刀菌引起的植物病害中的用途。所述胶孢炭疽菌引起的植物病害有柑橘炭疽病、苹果炭疽病或葡萄炭疽病等。所述尖孢镰刀菌引起的植物病害有蔬菜枯萎病等。
本发明还提供了一种防治胶孢炭疽菌或者尖孢镰刀菌引起的植物病害的方法，其特征在于，植物生长过程中，对具有胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌植物病害的植物进行喷雾处理。
本发明的有益效果：
1.本发明通过试验证明：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的发酵液对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率分别为100％和96.5％，可以用于防治胶孢炭疽菌引起的柑橘炭疽病、苹果炭疽病或葡萄炭疽病；尖孢镰刀菌引起的蔬菜枯萎病。本发明还通过田间试验证明：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的发酵液对柑橘炭疽病的叶片和果实的防效分别为81.53％和81.82％，因此杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04具有防治效果好，抗菌谱广的优点；
2.本发明所提供的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04防治效果稳定，对环境友好，大规模生产发酵工艺简单、生产成本低廉，能有效解决果树炭疽病和蔬菜枯萎病化学农药防治所带来的农业残留和环境污染问题。在炭疽病和枯萎病的生物防治方面具有巨大的应用潜力，为研制和开发微生物农药提供了优良的基础菌株。
具体实施方式
下面实施例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，一般为常规方法。
实施例1杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离与筛选
(1)杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离方法
本发明的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04分离于东海海底沉积物(120.6°E，34°N)，水深17米，采用稀释涂布法分离获得，具体方法为：称取10g海底沉积物样品溶于90mL无菌水中，置于摇床中振荡30min，使样品与水充分混合，即获得10-1稀释液。取1ml上述稀释液至9ml无菌水中，摇匀即获得10-2稀释液。相同的方法得到10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。分别取10-4、10-5、10-6的稀释液100μL于倒好的LB平板中，用涂布器将稀释液涂布均匀，每个浓度重复3次。置于30℃的恒温箱中培养48h，挑取培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，并分别编号保存。
(2)胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙平板法，以胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌为靶标，PDA平板中央划线接种细菌，距细菌2.5cm的两端接种病原菌菌饼，25℃恒温培养，对照只接种病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，测量抑菌带宽度，筛选出对上述病原菌有明显拮抗作用的细菌菌株。
②复筛：初筛后的细菌菌株制备种子液，取2mL种子液接种于100mL LB培养基中，180r/min、30℃恒温振荡培养48h。采用菌丝生长速率法，将发酵液与融化后冷却的PDA培养基(45～50℃)混匀，倒平板，以加入等体积LB液体培养基的PDA培养基作为对照，于平板中央接种直径为5mm的病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，十字交叉法测量对照组及处理组菌落直径，计算抑菌率，筛选出对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌拮抗效果最优的细菌菌株。
抑制率(％)＝(对照菌落半径(mm)―处理菌落半径(mm))/对照菌落半径(mm)×100
(3)结果与分析：利用稀释平板法从海底沉积物中分离得到20株细菌，对峙平板法筛选出7株对上述病原菌有明显抑制效果的拮抗菌株，占所分离菌株的35％，其中菌株ZDC-04拮抗效果最好，对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的抑菌带宽度分别为17.00mm和15.50mm。选取该菌株的发酵液于PDA培养基中稀释10倍进行菌丝生长速率法试验，结果表明该菌株的发酵液对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率分别为100％和96.5％。
实施例2杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的鉴定
(1)菌株形态：菌体长杆状，大小为(0.5～1.1)μm×(3.2～5.2)μm，产芽孢，革兰氏染色呈阳性。在LB培养基上30℃培养48h，菌落呈白色，圆形，边缘凸起。
(2)分子鉴定结果
该菌株的16S rRNA基因序列测定结果(SEQ-1)如下：
AAGCTTGCTTCTAATTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGATCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATCTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC
根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株ZDC-04与Paenibacillus jamilae序列相似性为100％，故将菌株ZDC-04鉴定为杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)。该菌株已于2018年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.16231。
实施例3杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04发酵过程
2216E培养基：酵母提取物1g，蛋白胨5g，琼脂15-20g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，水1000mL，pH调至7.0-7.2。
2216E液体培养基：酵母提取物1g，蛋白胨5g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL，pH调至7.0-7.2。
发酵培养基：玉米粉15g，豆粕粉10g，麸皮8g，蔗糖6g，碳酸钙5g，磷酸二氢钾5g，氯化钠2g，水1000mL，调节pH为6.5。
发酵方法，包括以下步骤：
(1)将低温保藏的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04用2216E培养基或LB培养基进行活化，并置于30℃恒温培养箱培养48h；
(2)将步骤(1)中的培养物挑起一环菌移接到2216E或LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h得到种子液；
(3)将步骤(2)的种子液接种至发酵培养基中，接种量5％(V/V)，置于30℃培养48h得到发酵液。
实施例4杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04发酵液对柑橘炭疽病田间效果验证
(1)供试药剂：杰米拉类芽孢杆菌发酵液(有效活菌数达0.5×109cfu/mL)；46％咪鲜胺·几丁聚糖水乳剂(市售)。
(2)供试作物：柑橘，品种为“砂糖桔”；防治对象：炭疽病。
(3)试验地情况：试验于2017年在广西桂林市荔浦县柑橘园进行，土壤为酸性壤土，水肥条件中等，管理水平与当地栽培条件一致。
(4)试验设计及调查方法
本试验设计了杰米拉类芽孢杆菌发酵液400倍、600倍、800倍，46％咪鲜胺·几丁聚糖水乳剂2000倍液及清水对照共5个处理，每个小区20m2，重复5次，共25个小区，各小区随机排列。
在打药前调查病情基数，并于最后一次施药14天后进行调查；叶片炭疽病防效调查：每小区随机调查2株果树，每株按东西南北中五个方向各固定2个新梢，调查全部叶片，记录总叶数、各级病叶数、统计病情指数及防治效果；果实炭疽病防效调查：每小区随机调查2株果树，每株按东西南北中五个方向取样，调查全部果实，统计病情指数及防治效果。病害分级标准如下：
叶片的分级标准：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶面积的6％～10％；
5级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；
7级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；
9级：病斑面积占整个叶面积的51％以上。
果实的分级标准：
0级：果上无病斑；
1级：病斑占果实面积的5％以下；
3级：病斑占果实面积的6％～10％；
5级：病斑占果实面积的11％～25％；
7级：病斑占果实面积的26％～50％；
9级：病斑占果实面积的51％以上。
按下列公式计算病情指数和防治效果：
(5)供试药剂对柑橘炭疽病的防治效果
杰米拉类芽孢杆菌对柑橘炭疽病的田间防效见表1，从表中可以看出，药后14d，杰米拉类芽孢杆菌发酵液稀释400倍液对叶片的防效显著高于46％咪鲜胺·几丁聚糖水乳剂2000倍液的处理，二者防效分别为81.53％和78.13％；就果实的防效而言，发酵液稀释400倍液的防效显著高于46％咪鲜胺·几丁聚糖水乳剂2000倍液的处理，二者防效分别为81.82％和76.90％。
表1杰米拉类芽孢杆菌发酵液防治柑橘炭疽病的田间效果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110> 青岛中达农业科技有限公司
<120> 一株抑制炭疽菌和镰刀菌的杰米拉类芽孢杆菌及其应用
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<212> DNA
<213> 杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的16S rRNA基因序列
<400> 1
aagcttgctt ctaattaacc tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgccca 60
caagacaggg ataactaccg gaaacggtag ctaatacccg atacatcctt ttcctgcatg 120
ggagaaggag gaaaggcgga gcaatctgtc acttgtggat gggcctgcgg cgcattagct 180
agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg 240
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 300
cgcaatgggc gaaagcctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt 360
aaagctctgt tgccagggaa gaacgcttga tagagtaact gctcttgaag tgacggtacc 420
tgagaagaaa gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc 480
gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggc tctttaagtc tggtgtttaa 540
tcccgaggct caacttcggg tcgcactgga aactggggag cttgagtgca gaagaggaga 600
gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 660
gcgactctct gggctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 720
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttaggggt ttcgataccc 780
ttggtgccga agttaacaca ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 840
ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cagtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa 900
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc ctctgaccgg tctagagata gatctttcct 960
tcgggacaga ggagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg cttagttgcc agcaggtcaa gctgggcact 1080
ctaagcagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1140
ccttatgacc tgggctacac acgtactaca atggccggta caacgggaag cgaaggagcg 1200
atctggagcc aatcctagaa aagccggtct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta 1260
catgaagtcg gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1320
tcttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttacaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1380
cc 1382
Claims (5)
1.杰米拉类芽孢杆菌（Paenibacillusjamilae）菌株ZDC-04，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.16231。
2.权利要求1所述的杰米拉类芽孢杆菌菌株ZDC-04在抑制胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌方面的应用。
3.权利要求1所述的杰米拉类芽孢杆菌菌株ZDC-04制备的发酵液，其特征是，它由下述方法制备而成，包括以下步骤：
（1）将低温保藏的杰米拉类芽孢杆菌菌株ZDC-04用2216E培养基或LB培养基进行活化，并置于30℃恒温培养箱培养48h；
（2）将步骤（1）中的培养物挑起一环菌移接到2216E或LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h得到种子液；
（3）将步骤（2）的种子液接种至发酵培养基中，接种量5%（V/V），置于 30℃培养48h得到发酵液；
所述2216E培养基为：酵母提取物1g，蛋白胨5g，琼脂15-20g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；所述LB培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，水1000mL，pH调至7.0-7.2；
所述2216E液体培养基为：酵母提取物1g，蛋白胨5g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5；所述LB液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL，pH调至7.0-7.2；
所述发酵培养基为：玉米粉15g，豆粕粉10g，麸皮8g，蔗糖6g，碳酸钙5g，磷酸二氢钾5g，氯化钠2g，水1000mL，调节pH为6.5。
4.权利要求3所述的发酵液在防治柑橘炭疽病方面的用途。
5.一种防治柑橘病害的方法，其特征在于，柑橘生长过程中，对具有柑橘炭疽病病害的柑橘采用权利要求3所述的发酵液进行喷雾处理。
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Denomination of invention: A Bacillus Jamila strain for inhibiting anthrax and Fusarium and its application Effective date of registration: 20211220 Granted publication date: 20200918 Pledgee: Qingdao high technology financing Company limited by guarantee Pledgor: CHINA KINGDOM AGRITECH (QINGDAO) CO.,LTD. Registration number: Y2021370010140 |
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Date of cancellation: 20230104 Granted publication date: 20200918 Pledgee: Qingdao high technology financing Company limited by guarantee Pledgor: CHINA KINGDOM AGRITECH (QINGDAO) CO.,LTD. Registration number: Y2021370010140 |
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