CN113832060B - 一种抗重茬微生物菌剂及其在农业生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种抗重茬微生物菌剂及其在植物病害防治中的应用。所述微生物菌剂包含地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）、细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus），能有效改善重茬土壤的微生物结构，提高土壤肥力，减少病虫害发生，有利于提高作物产量和品质，减少农药对环境的污染，应用前景广泛。

Description

一种抗重茬微生物菌剂及其在农业生产中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种抗重茬微生物菌剂及其在农业生产中的应用。
背景技术
随着生产上化学药剂的大量使用，尽管对植物病害防治带来了诸多便利以及成效，然而，随之而来的环境污染、农产品农药残留超标以及病原菌抗药性的形成等负面效应已经引起社会的广泛关注。植物病原物在生长发育以及致病过程中均受到来自于寄主植物、环境条件的影响，利用有益微生物来控制病害发生发展的方法称之为植物病害生物防治，而这些有益微生物则称为植物病害生防菌。生物防治与化学防治不同，其不仅对人畜安全，而且对环境友好。同时，植物病害生防菌具有改善环境、获得长期效益作用，符合现阶段植物病害控制的发展方向。
生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的主要是真菌和细菌。生防真菌主要包括木霉菌、毛壳菌、青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌、盾壳霉、粘帚霉等；生防细菌一般包括芽孢杆菌属、游动放线菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属、链霉菌属、土壤杆菌属、产碱菌属、节杆菌属、固氮菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、小单孢菌属和根瘤菌属。例如，已有报道表明，哈茨木霉TGy040604、绿色木霉TGc050601，TGc050609，TZxj0506l0分别对香蕉炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、红麻灰霉病菌具有较好的抑菌效果。长枝木霉对烟草黑胫病的室内防效达97.6%，黄绿木霉T3对水稻纹枯病菌抑菌率为52.54%。球毛壳菌、角毛壳菌均可以较好地预防甘蔗猝倒病，以及较好地防治番茄枯萎病和苹果斑点病的发生，就对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌的抑制作用而言，球毛壳菌强于角毛壳菌。链霉菌属NEAU-W2显示了极强的抗大豆疫霉活性。枯草芽孢杆菌XG-1对西瓜枯萎病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，同时，枯草芽孢杆菌Henu11对禾谷丝核菌具有较好的抑制作用。
生防菌的筛选方法一直是生物防治研究领域的一个瓶颈，大多研究最常用的是离体平板筛选，即在平板上筛选对病原菌有抑制活性的菌株。常用的生防菌筛选方法为土壤稀释平板法。根据木霉属某些种可以寄生整齐小菌核特点，设计了诱捕法，也可根据不同的防治对象设定相应的病原菌作为诱饵开展木霉菌的分离。随着放线菌生态学研究的逐渐深入，设计出了综合法、诱导法以及毛细管分离方法。对于大量的土壤样本进行生防菌的分离是非常耗时的，现已开发出平板划线分离法分离土壤放线菌的技术。
在生防过程中，利用单一微生物防治植物病害的报道较多，但是单一菌株防病机制单一，需菌量大，在自然环境中受到各种因素的影响，适应能力较低，环境依赖性强，持效性差，很难发挥其应有的作用，防治效果偏低。通过生防菌复配来实现多菌株之间的优势互补，提高生防效果和稳定性不失为一个好的办法。将生防菌进行多菌组合，全面考虑各生防菌的特性进行适宜复配，利用复配菌剂防病可以发挥生防菌的互补优势与协同作用，增强其在自然环境中的竞争力及存活率，从而增强其防治植物病害的能力。复配生防菌剂比单一菌剂更能好的适应复杂的土壤、环境变化，充分发挥其生防效果，更好的防治病害。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗重茬微生物菌剂及其在植物病害防治中的应用。所述微生物菌剂能有效改善重茬土壤的微生物结构，提高土壤肥力，减少病虫害发生，有利于提高作物产量和品质，减少农药对环境的污染，应用前景广泛。
本发明一方面提供了一种抗重茬微生物菌剂，包含地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）、细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。
所述抗重茬微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌75-90份、巨大芽孢杆菌25-30份、内生芽孢杆菌22-35份、细黄链霉菌26-32份和淡紫拟青霉20-25份。
进一步优选的，所述抗重茬微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌90份、巨大芽孢杆菌27份、内生芽孢杆菌22份、细黄链霉菌32份和淡紫拟青霉20份。
所述抗重茬微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为109 CFU/g。
进一步优选的，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6），已于2020年6月1日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020162；
进一步优选的，所述巨大芽孢杆菌的编号为ACCC 04366。
进一步优选的，所述内生芽孢杆菌的编号为ACCC 02072。
进一步优选的，所述细黄链霉菌的编号为CGMCC 4.6144。
进一步优选的，所述淡紫拟青霉的编号为ACCC 32162。
本发明另一方面提供了所述抗重茬微生物菌剂在植物病害防治中的应用。
所述植物病害包括根腐病、叶斑病、茎基腐病、青枯病、炭疽病、早疫病、枯萎病、白灰霉病、根结线虫病中的任意一种。
所述植物病害包括花生根腐病、花生叶斑病、草莓根腐病、西红柿青枯病、草莓炭疽病、大姜茎基腐病、番茄早疫病、黄瓜枯萎病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、甜瓜根结线虫病中的任意一种。
所述抗重茬微生物菌剂可以单独施用，用量为10-20kg/亩。
所述抗重茬微生物菌剂还可以按15-30%（质量比）的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，用量为40-90kg/亩。
本发明还提供了一种抗重茬微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达10-100亿CFU/g的超浓缩菌粉；
（2）将步骤（1）制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：地衣芽孢杆菌 80份、巨大芽孢杆菌25份、内生芽孢杆菌35份、细黄链霉菌26份和淡紫拟青霉23份配制成抗重茬微生物菌剂。
有益效果
本发明提供的抗重茬微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LLH-6、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉五种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比含单一菌种的微生物菌剂更有利于改善重茬土壤的微生物结构，提高土壤肥力，减少重茬导致的病虫害，实现增产增收。
与空白对照组相比，在种姜前撒施本发明所述抗重茬微生物菌剂的各处理组大姜的茎基腐病病情指数均显著下降，防治效率最高达到89.8%，取得了意料不到的技术效果。
与无机肥对照组相比，施用本发明所述抗重茬微生物菌剂的实验组6花生的亩产提高了29.1%，且显著高于单独施用地衣芽孢杆菌LLH-6和巨大芽孢杆菌菌粉的实验组1和实验组2，取得了意料不到的技术效果。
除了大姜和花生外，本发明提供的抗重茬微生物菌剂还可以广泛用于西红柿、黄瓜、草莓、甜瓜等作物的重茬种植中，对花生根腐病、花生叶斑病、草莓根腐病、西红柿青枯病、草莓炭疽病、番茄早疫病、大姜茎基腐病、黄瓜枯萎病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、甜瓜根结线虫病等植物病害防治效率超过68%，增产15%以上，效果非常显著。
本发明提供的抗重茬微生物菌剂可以单独施用，也可以按15-30%（质量比）的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，能显著减少重茬病害发生，提高土壤肥力，普遍提高作物产量。所述抗重茬微生物菌剂的使用，能大大减少无机肥和农药的使用，对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌LLH-6菌落图。
具体实施方式
对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
本发明实施例中使用的巨大芽孢杆菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 04366；内生芽孢杆菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC02072；细黄链霉菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 4.6144；淡紫拟青霉购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 32162。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1 土壤中生防菌的分离与筛选
1、土壤样品：山东省青岛市莱西蔬菜种植区番茄根际土壤。
2、土壤稀释液的制备：
除去地表植物残体和表层土5cm-10cm，用多点采集的方法在每个采样点从土壤中采集10g样品，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将土壤样品缩分至约50g左右；然后置于含有250ml灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀，取上清液；取100ml上清液，12000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次12000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。
用移液枪分别吸取0.1ml土壤悬浮液至PDA平板（去皮土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L）上，涂抹均匀后放入培养箱培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离获得20株细菌，分别命名为H1，H2，H3，……，H20。
3、初筛：
采用对峙培养法进行病原真菌拮抗菌筛选。
将打好直径为5mm的番茄立枯丝核菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取上述分离得到的待测细菌悬浮液等距离（距平板中央3cm）点接2～3种细菌，放于培养箱中28℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度大于等于6mm的6个菌株进行复筛，依次为H3、H4、H6、H13、H15、H20进行复筛。
4、复筛：
将初筛获得的6株菌分别接种于NA培养基（蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，葡萄糖2g/L，琼脂15g/L，pH7.0）上，30℃培养2d。
取一接种环菌置入装有100ml NB培养基（蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0）的三角瓶中，在30℃、200rpm条件下培养48h。将发酵液用0.22μm细菌过滤器过滤得到发酵滤液，将滤液与50℃左右的PDA培养基按1∶19混匀倒入培养皿，冷却后在平板中央放入d＝6mm的立枯丝核菌菌饼，4d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照。
结果显示，初筛获得的6株拮抗菌中，H15菌株发酵液对立枯丝核菌的抑菌效果最明显， 抑制率达到91.8％。
实施例2 H15菌株的鉴定
1、分子生物学鉴定
挑取平板上H15菌株的单菌落于NB培养基（蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0）中，30℃培养48小时，然后取500ul菌株发酵液，利用试剂盒提取该菌株的基因组。以该基因组为模板，利用通用引物序列，PCR扩增16s rDNA 序列。
1）引物序列:
H15F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
H15R：CTACGGCTACCTTGTTACGA。
2）反应体系（50μL）
表1 16s rDNA PCR扩增体系
成分 反应体积
10×PCR buffer 5μL
dNTPs 4μL
A11F 2μL
A11R 2μL
DNA 2.5μL
rTaq 0.5μL
ddH2O 34μL
3）PCR 扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图谱结果显示，扩增得到的16s rDNA片段的长度为1500bp左右，符合常规的16s rDNA 序列长度。
4）PCR产物测序
将扩增后的 PCR 产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果显示H15菌株的16srDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI 数据库中进行BLAST比对，其与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的相似性最高。因此，初步确定H15菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
SEQ ID NO:1如下所示：
ttccggccggcctaatacatgcaagtcgagcaaacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcaaaagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccccggctaactacghgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcaaaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgaatctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagccctccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtgtaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagaaataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagggcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaagcatcattccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaagggtgaacagaagattcca。
2、菌落形态
将H15菌株在NA培养基上划线接种，37℃恒温培养过夜，观察菌落形态。
结果如图1所示，H15菌株的菌落呈乳白色，扁圆形，边缘不规则；菌体呈短杆状，常成串出现，可形成椭圆形的中生芽胞，革兰氏染色呈阳性。
结合H15菌株的16srDNA比对结果和菌落形态，申请人确认H15菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），命名为地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6）。
申请人已于2020年6月1日将上述地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020162。
实施例3 地衣芽孢杆菌LLH-6抑菌能力评价
1、菌液制备
将地衣芽孢杆菌LLH-6进行活化，挑取活化后的地衣芽孢杆菌LLH-6接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养24h，获得活菌量为108-109 CFU/ml的菌液。
2、病原菌的制备
将茄链格孢菌、灰霉病菌、茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、禾谷镰刀菌、白粉病菌、青枯假单胞菌、疫霉菌、藤仓赤霉菌等多种真菌性病原菌（山东省农科院植保所提供）分别接种于PDA培养基上纯化培养，30℃培养5天后备用。
3.平板抑菌试验
采用滤纸片法，在培养基中央接种直径为8mm的病原菌菌饼，将已经灭菌的滤纸片放于菌饼两侧距离培养皿中心30mm处，吸取10ul地衣芽孢杆菌LLH-6菌液点到滤纸片上；然后将培养皿放于30℃培养箱中培养，每天观察记录抑菌带的宽度，每种病原菌做三个重复，取平均值。抑菌效果详见表2。
表2地衣芽孢杆菌LLH-6对不同病原菌的抑菌效果
病原菌 抑菌带平均宽度（mm）
茄链格孢菌 26.0±1.0
灰霉病菌 27.0±0.6
茄病镰刀菌 30.0±0.4
立枯丝核菌 34.0±0.2
腐霉菌 31.0±1.1
禾谷镰刀菌 27.0±1.2
白粉病菌 23.0±1.0
青枯假单胞菌 30.0±0.5
疫霉菌 31.0±0.8
藤仓赤霉菌 26.0±0.6
从表2的数据可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对上述10种病原菌均具有明显的抑制作用，其中对茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、青枯假单胞菌和疫霉菌的抑菌效果较强，抑菌带宽度均超过30mm，取得了意料不到的技术效果。
实施例4 地衣芽孢杆菌LLH-6固氮能力测定
1、氮标准曲线绘制：
将硫酸铵在105℃烘箱中烘1h；称取0.4716g硫酸铵溶于100mL水中，得到的硫酸铵溶液中氮的含量为1mg/mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL溶液于100mL容量瓶，定容，即为氮标准液。取标准液各1.0mL于15mL刻度试管中，每管加水1.0mL，加奈氏试剂4.0mL，摇匀，水浴加热15min，冷却后于420nm处测定吸光值。根据不同浓度含氮标准溶液吸光值可得氮标准曲线。
2、将地衣芽孢杆菌LLH-6、对照菌株(多粘芽孢杆菌、褐球固氮菌)分别接种到固氮菌液体培养基中，同时做不接菌空白对照，30℃，200r/min摇瓶培养分别在第2、3、5天取菌液。
分别吸取上述待测菌液1.0ml于50ml消化管中，加3mL硫酸，0.1g催化剂和5d双氧水消煮至清亮，冷却后加少许蒸馏水，摇匀，滴加400g/L氢氧化钠至出现沉淀，加25％酒石酸钾钠溶液去除沉淀，摇匀。过滤，吸取滤液5.0mL于15ml刻度试管中，加0.5mL氢氧化钠，0.5mL酒石酸钾钠，1.5mL奈氏试剂，摇匀，显色2～3min，于420nm处测定吸光值。计算氮含量，具体结果见表3。
W（氮含量，g/50ml）＝（x×100×50）/（V×1000）。
其中：x—标准曲线上查出的样品含氮量（μg/ml）；
V—吸取固氮液体积（ml）。
表3 地衣芽孢杆菌LLH-6的固氮效果分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从表3的数据可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6在第2、3、5天时固氮量均显著高于对照菌，其中第5天时固氮量高达29.63 mg/50ml，固氮能力非常强，取得了意料不到的技术效果。
实施例5 地衣芽孢杆菌LLH-6产吲哚乙酸（IAA）能力检测
1、将活化的的地衣芽孢杆菌LLH-6种子液按2％的接种量接种于pH 9.0的DF培养基（蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，蒸馏水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min）和pH 9.0的DF+培养基（DF培养基中加入0.50g/L色氨酸）中，30℃，150rpm摇瓶培养7天；7天后，将发酵液在4℃、12000rpm条件下离心5min，用Salkowkin比色法测定发酵液中吲哚乙酸IAA的含量。
检测结果显示：在DF培养基中，地衣芽孢杆菌LLH-6产吲哚乙酸的量为19.21±0.45mg/L，在DF+培养基中吲哚乙酸的产量为40.33±0.81mg/L。
2、通过HPLC分析进一步确认地衣芽孢杆菌LLH-6合成的吲哚乙酸产量。
将地衣芽孢杆菌LLH-6在30℃，150rpm条件下培养7天，将发酵液在4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清液30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液，减压蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22μm滤膜过滤。
检测仪器：waters2998高效液相色谱；色谱柱：AgilertZorbaxSB-C18250mm×4.6mm，5μm；流动相，甲醇：乙腈：0.6％冰乙酸水溶液（50：5：45，v/v/v）；进样量：20μL；流速0.8mL/min；柱温：室温；检测波长：255nm。
检测结果显示：在DF培养基中，地衣芽孢杆菌LLH-6吲哚乙酸的量为19.87±0.19mg/L，在DF+培养基中吲哚乙酸的产量为40.45±0.33mg/L。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能高效分泌吲哚乙酸，因此，该菌株有望开发成微生物肥广泛应用于农业生产中，促进作物生长。
实施例6地衣芽孢杆菌LLH-6对油菜的增产效果实验
1、实验地点：
青岛市平度油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。
2、实验过程
设置20个实验区，每个实验区为3m×3m的方形区域，且每个实验区之间保持1米的间隔。
实验共设2个组：①空白对照组：不添加任何物质；②地衣芽孢杆菌LLH-6处理组：在每个实验区中按30mL/m2的比例均匀喷施地衣芽孢杆菌LLH-6发酵菌液（活菌量为108-109 CFU/ml），然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。
1）种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥；
2）播种与收获：在每个实验区均匀播种50g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种50天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。
结果显示：喷施地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了302.1%和281.4%，增产效果非常显著。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能有效提升土壤肥力，促进作物生长，显著提高作物产量，取得了意料不到的技术效果。
实施例7地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的盆栽防治试验
实验地点：青岛市城阳区夏庄草莓种植大棚。
每个盆钵中装入约3.5kg灭菌土壤。选取长势一致的、无叶斑的健康草莓植株移栽到盆钵中。在缓苗后15天后，按50-100ml/盆将地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液（浓度约109cfu/ml）加入各盆草莓植株根部土壤中，48h后按50ml/盆接入病原菌立枯丝核菌悬液（浓度约107cfu/ml）。
对照组：只接种立枯丝核菌；
处理组1：按50ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液，接种立枯丝核菌；
处理组2：按100ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液，接种立枯丝核菌.
每个处理设置3个平行组，每个平行组30盆，每盆1株草莓。统一田间管理，14天后开始调查草莓根腐病的发病情况，计算其病情指数及根腐病防治效率，具体结果见表4。
根腐病病害分为6级：0 级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。
病情指数＝[Σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。
相对防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
表4 地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的防治效果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表4的结果可以看出，与对照组相比，施用地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组草莓根腐病的发病率显著下降，防治效率达到85.3%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的防治效果非常明显，取得了意料不到的技术效果。
实施例8 地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治试验
实验地点选在青岛市平度姜家管村大姜种植区，该地块连年种姜，有严重的重茬病害—茎基腐病。
选取20m×6m的区域作为一个实验区，每个实验区内种10垄姜，约500±30株。共设置12个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。实验设计如下：
（1）空白对照组：不撒施任何菌粉，直接在姜沟中种姜；
（2）菌粉处理组：先将地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉（活菌量约为10亿/g）按2-6kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内，然后在姜沟中种姜。其中：
处理组1：LLH-6菌粉用量为2 kg/亩；
处理组2：LLH-6菌粉用量为4 kg/亩；
处理组3：LLH-6菌粉用量为6 kg/亩。
在姜的生长过程中，对各实验区域均采用相同的田间管理方法。在姜收获时，统计姜茎基腐病的发病情况，计算地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治效率，具体结果见表5。
病害分级标准：0级，姜株健康无病；1级，母姜株局部发病，子孙姜株健康无病；2级，子孙姜株有病斑，但无枯死；3级，姜丛局部枯死（30%～50%）；4级，姜丛基本枯死或完全枯死，姜肉变色腐烂60%以下；5级，姜丛完全枯死，姜肉腐烂60%以上。
病情指数和相对防治效果计算公式分别为：
病情指数=（∑（各级发病株数×对应发病级数）/（调查总株数×最高发病级数））×100；
相对防效（%）=[（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。
表5 地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治效果
实验分组 病情指数 防治效率
空白对照组 81.7 -
LLH-6菌粉处理组1 30.1 63.2%
LLH-6菌粉处理组2 19.7 75.9%
LLH-6菌粉处理组3 11.3 86.2%
从表5的结果可知，与空白对照组相比，各处理组通过在种姜前撒施地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉，可大幅度降低姜茎基腐病的病情指数，防治效率高达86.2%。从而说明本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对姜茎基腐病具有显著的防治效果，取得了意料不到的技术效果。
实施例9 地衣芽孢杆菌LLH-6对西红柿青枯病的防治试验
首先将供试土壤曝晒2天，消毒后装盆，每盆钵装土约5kg，然后按200mL/盆接种青枯假单胞菌液（菌液浓度约108cfu/ml），搅拌均匀，保湿培养5天。
选取长势一致的4-6叶西红柿幼苗移栽到预处理过青枯假单胞菌的盆钵中，移栽时在地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液（菌悬液浓度约1010cfu/ml）中蘸根10min，移栽7天后，按每盆40-80ml的接种量进行地衣芽孢杆菌菌悬液灌根处理。
具体试验设计如下：
对照组：只接种青枯假单胞菌；
处理组1：接种青枯假单胞菌，按40ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液。
处理组2：接种青枯假单胞菌，按80ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液。
每个处理设置3个平行组，每个平行组30盆，每盆1株西红柿苗。试验期间正常水分管理。移栽20天后，记录西红柿青枯病发病情况，计算其病情指数及青枯病防治效率，具体结果见表6。
青枯病发病情况按标准划分为5级：0级：全株无病；1级：植株1/4以下叶面表现萎蔫症状；2级：植株1/4到1/2叶面表现萎蔫症状；3级：植株1/2以上叶面表现萎蔫症状：4级：全株萎蔫死亡。
病情指数＝[Σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。
相对防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
表6 地衣芽孢杆菌LLH-6对西红柿青枯病的防治效果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
由表6的数据可以看出，与对照组相比，灌施地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液的处理组西红柿，青枯病的病情指数得到显著下降，防治效率高达78.3%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能显著抑制青枯假单胞菌的生长繁殖，有效防治西红柿青枯病，取得了意料不到的技术效果。
除了草莓根腐病、大姜茎基腐病、西红柿青枯病外，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓炭疽病、番茄早疫病、黄瓜白粉病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、葡萄灰霉病、甜瓜根结线虫病，以及苹果轮纹病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等多种植物病害均有显著的防治效果，防治效率达到60.8%-75.5%。
综上所述，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6可单独作为防治根腐病、青枯病、茎基腐病、炭疽病、灰霉病、早疫病、白粉病、根结线虫、溃疡病等植物病害的生防菌剂、生物肥等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、固氮菌、解磷菌、链霉菌等进行组合，用于其他常见植物病害的防治，防治效率普遍高于60%，促生增产效果达到15%以上，效果显著，应用前景广阔。
实施例10
一种抗重茬微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌LLH-6 80份、巨大芽孢杆菌25份、内生芽孢杆菌35份、细黄链霉菌26份和淡紫拟青霉23份。
上述抗重茬微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1）将地衣芽孢杆菌LLH-6、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达10-100亿CFU/g的超浓缩菌粉；
2）将步骤（1）制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：地衣芽孢杆菌LLH-6 80份、巨大芽孢杆菌25份、内生芽孢杆菌35份、细黄链霉菌26份和淡紫拟青霉23份配制成抗重茬微生物菌剂。
实施例11
一种抗重茬微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌LLH-6 75份、巨大芽孢杆菌30份、内生芽孢杆菌30份、细黄链霉菌29份和淡紫拟青霉25份。
抗重茬微生物菌剂的制备方法参照实施例10。
实施例12
一种抗重茬微生物菌剂，其各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌LLH-6 90份、巨大芽孢杆菌27份、内生芽孢杆菌22份、细黄链霉菌32份和淡紫拟青霉20份。
抗重茬微生物菌剂的制备方法参照实施例10。
实施例13抗重茬微生物菌剂对大姜病害的防治效果
实验地点：青岛市平度姜家管村大姜重茬种植区，该地块有严重的重茬病害—茎基腐病。
选取20m×6m的区域作为一个实验区，每个实验区内种10垄姜，约500±30株。共设置12个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。实验设计如下：
（1）空白对照组：不撒施任何菌粉，直接在姜沟中种姜；
（2）菌剂处理组：先将实施例10-12所述抗重茬菌剂（活菌量约10亿/g）按5kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内，然后在姜沟中种姜。
在姜的生长过程中，对各实验区域均采用相同的田间管理方法。在姜收获时，统计大姜茎基腐病的发病情况，计算本发明提供的抗重茬微生物菌剂对大姜茎基腐病的防治效率，具体结果见表7。
表7 抗重茬微生物菌剂对大姜茎基腐病的防治效果
实验分组 病情指数 防治效率
空白对照组 80.1 -
实施例10菌剂处理组 12.1 84.9%
实施例11菌剂处理组 14.7 81.6%
实施例12菌剂处理组 8.2 89.8%
从表7的结果可知，与空白对照组相比，在种姜前撒施抗重茬微生物菌剂的各处理组大姜的茎基腐病病情指数均显著下降，防治效率最高达到89.8%。从而说明本发明提供的抗重茬微生物菌剂能有效解决大姜在重茬种植过程中茎基腐病严重的问题，取得了意料不到的技术效果。
实施例14抗重茬微生物菌剂对重茬花生产量的影响
（1）微生物菌剂
样品1：地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉，有效活菌数约10亿CFU/g；
样品2：巨大芽孢杆菌菌粉，有效活菌数约10亿CFU/g；
样品3：内生芽孢杆菌菌粉，有效活菌数约10亿CFU/g；
样品4：细黄链霉菌菌粉，有效活菌数约10亿CFU/g；
样品5：淡紫拟青霉菌粉，有效活菌数约10亿CFU/g；
样品6：实施例12所述抗重茬微生物菌剂，由地衣芽孢杆菌LLH-6、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉组成，总有效活菌数约10亿CFU/g；
（2）实验过程
地点：青岛市莱西葛家泊村重茬花生种植地块。
分别于播种时（4月27日）沟施，开花期（6月25日）和结荚期（8月10日）随水施用上述样品1-6，施肥量10kg/亩，同时，以施用等量无机肥作为对照组，采取相同的方法进行田间管理。9月20日收获花生。对实验组和对照组的花生产量进行测评，结果如表8所示。
表8 抗重茬微生物菌剂对花生产量的影响
处理 施肥 亩产（kg） 亩产较CK±%
对照组 无机肥 323 -
实验组1 样品1 386 19.5%
实验组2 样品2 341 5.6%
实验组3 样品3 325 0.6%
实验组4 样品5 284 -12.1%
实验组5 样品4 305 -5.6%
实验组6 样品6 417 29.1%
从表8的数据可以看出：
（1）单独施用地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉的实验组1花生产量显著高于无机肥对照组亩产提高了19.5%；单独施用巨大芽孢杆菌菌粉的实验组2花生的产量略高于无机肥对照组，亩产比对照组分别提高5.6%。从而说明地衣芽孢杆菌LLH-6或巨大芽孢杆菌单独作用，均能改善重茬土壤的肥力，减少花生病害发生，实际增产效果优于等量的无机肥；
（2）单独施用内生芽孢杆菌菌粉的实验组3花生的产量与对照组相当，说明内生芽孢杆菌单独作用对重茬土壤肥力的提升效果与等量的无机肥相当；
（2）单独施用细黄链霉菌菌粉的实验组4和单独使用淡紫拟青霉菌粉的实验组5花生的亩产均显著低于无机肥对照组，说明细黄链霉菌或淡紫拟青霉单独作用对重茬土壤肥力的提升效果不如等量的无机肥；
（3）施用含相同菌量的由地衣芽孢杆菌LLH-6、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉组成的抗重茬微生物菌剂的实验组6，花生的亩产显著高于实验组1和实验组2，亩产比对照组提高了29.1%。
上述结果说明，本发明提供的抗重茬微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LLH-6、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉五种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比含单一菌种的微生物菌剂更有利于改善重茬土壤的微生物结构，提高土壤肥力，减少重茬导致的病虫害，实现增产增收，产生了意料不到的技术效果。
除了大姜和花生外，本发明提供的抗重茬微生物菌剂还可以广泛用于西红柿、黄瓜、草莓、甜瓜等作物的重茬种植中，对花生根腐病、花生叶斑病、草莓根腐病、西红柿青枯病、草莓炭疽病、大姜茎基腐病、番茄早疫病、黄瓜枯萎病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、甜瓜根结线虫病等植物病害防治效率超过68%，增产15%以上，效果非常显著。
本发明提供的抗重茬微生物菌剂可以单独施用，也可以按15-30%（质量比）的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，能显著减少重茬病害发生，提高土壤肥力，普遍提高作物的产量。所述抗重茬微生物菌剂的使用，能大大减少无机肥和农药的使用，对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
序列表
<110> 青岛力力惠生物科技股份有限公司
<120> 一种抗重茬微生物菌剂及其在农业生产中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1496
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
gtttgattct ggctcaggac gaacggtggc ggcgtgccta atacaagcaa gtcgagcgga 60
gcacttcggt gcttagcggc ggacgggtga gtaacacgta ggcaacctgc ctgtaagatc 120
gggataacta ccggaaacgg tagctaagac cggatagctg gtttccgtgc atgccggaat 180
catgaaacac ggggcaacct gtggcttacg gatgggcctg cggcgcatta gctagttggc 240
ggggtaacgg cccaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcgtccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360
ggcgcaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaagctc 420
tgttgccagg gaagaatgtc gtggagagta actgctctgc gaatgacggt acctgagaag 480
aaagccccgg ctaactacgt gccaggagcc gcggtaatac gtagggggca agcgttgtcc 540
ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcttttaa gtctggtgtt taagcccggg 600
gctcaacccc ggttcgcacc ggaaactgga agacttgagt gcaggagagg aaagcggaat 660
tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720
tctggactgt aacggacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aggtgttagg ggtttcgata cccttggtgc 840
cgaagtaaac acaataagca ctccgcctgg ggagtacgct cgcaagagtg aaactcaaag 900
gaattgacgg ggacccgcac aagcagtgga gtatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tccctctgaa agccctagag atagggtcct ccttcgggac 1020
agaggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaaccctt gactttagtt gccagcattg agttgggcac tctagagtga 1140
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200
ctgggctaca cacgtactac aatggccggt acaacgggaa gcgaagtcgc gagatggagc 1260
gaatccttag aagccggtct cagttcggat tgcaggctgc aactcgcctg catgaagtcg 1320
gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac 1380
accgcccgtc acaccacgag agtttacaac acccgaagcc ggtggggtaa cccgcaaggg 1440
ggccagccgt cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt cgtaacaagg taaccg 1496

Claims (6)

1.一种抗重茬微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂由地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）、细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）组成；所述地衣芽孢杆菌已于2020年6月1日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020162，所述巨大芽孢杆菌的编号为ACCC04366，所述内生芽孢杆菌的编号为ACCC 02072，所述细黄链霉菌的编号为CGMCC 4.6144，所述淡紫拟青霉的编号为ACCC 32162。
2.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌75-90份、巨大芽孢杆菌25-30份、内生芽孢杆菌22-35份、细黄链霉菌26-32份和淡紫拟青霉20-25份。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中各组分及其重量分别为：地衣芽孢杆菌 90份、巨大芽孢杆菌27份、内生芽孢杆菌22份、细黄链霉菌32份和淡紫拟青霉20份。
4.如权利要求1-3任一所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为109 CFU/g。
5.权利要求1-3任一所述的微生物菌剂在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述植物病害为草莓根腐病、西红柿青枯病、大姜茎基腐病中的任意一种。
6.权利要求1所述的抗重茬微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、细黄链霉菌和淡紫拟青霉分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量为10-100亿CFU/g的超浓缩菌粉；
（2）将步骤（1）制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：地衣芽孢杆菌 80份、巨大芽孢杆菌25份、内生芽孢杆菌35份、细黄链霉菌26份和淡紫拟青霉23份配制成抗重茬微生物菌剂。
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