CN108728374B - 一株粘着剑菌dt8菌株及其在降解多效唑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株及其在降解多效唑中的应用，所述Ensifer adhaerens dt8菌株于2018年4月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60351。本发明所述Ensifer adhaerens dt8菌株在生长与代谢过程中可以分泌胞外物质将多效唑降解，可应用于制备降解土壤中多效唑的菌剂，应用于降解耕作土壤中多效唑，解除多效唑对作物或其他植物抑制顶端生长的胁迫作用，以及降低作物携带多效唑进入食物链的可能性，具有较大的应用前景。

Description

一株粘着剑菌dt8菌株及其在降解多效唑中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术及农作物药剂生物降解处理领域，更具体地，涉及一株粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株及其在降解多效唑中的应用。

背景技术

多效唑，分子式为C₁₅H₂₀N₃OCl，化学名(2RS,3RS)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1,2,4-三唑-1-基)戊-3-醇，代号PP333，一种人工合成的高效低毒植物生长延缓剂和广谱型杀菌剂有机化合物。多效唑可以控制营养生长，延缓茎的伸长，并使更多光合产物运输到生殖器官，从而达到抑制植物生长、促进花芽分化、提高植物抗倒伏和抗逆性、抑制细菌和害虫，并使植物抗衰老和促产量。然而研究表明，土施多效唑应用与植物时，其在第二年的残留量达到最高，并且危害效用也是在第二年最为明显，在土壤中的残留时间也较长，残效性长达2～3年，对下茬作物生长发育会造成很大影响。除此之外，在土壤中具有较高的吸附率，在田间的淋溶、渗透性较差，影响后茬作物生长。并且喷施浓度、频率过高，也会造成对植物的过分抑制、生长停滞，植株不能恢复正常生长等药害症状，遗留的未分解的多效唑，会造成来年的第二茬蔬菜作物农药残留超标。对多效唑的传统处理方法，既在第二茬作物种植前进行耕翻，亦或是增施氮肥或赤霉素解救；适当增加土壤中有效铁离子浓度和pH以有效降低土壤中的多效唑含量；另一种方法就是改种其他对多效唑具有强抗性的作物，如百合科的大葱、大蒜和韭菜等；而对含有多效唑蔬菜可以用清水或者臭氧水浸泡以达到降低蔬菜中的多效唑含量。除此之外，多效唑对水环境的慢性影响不容忽视，对水生生物具有严重影响，如影响大型蚤的存活率、生长发育和繁殖。因此，降低土壤中的残留农药多效唑含量，降低多效唑在后茬作物中的含量等问题已至关重要。并且目前尚无微生物对三唑类（包括多效唑）农药微生物降解方面的报道。

粘着剑菌（Ensifer adhaerens）与1982年被Casida第一次从土壤中分离得到，并作为一个新属发表；而在后期的研究中，在农杆菌属和根瘤菌属命名委员会上，将剑菌属和中华根瘤菌属合并为一个属，而属中的模式菌株为Sinorhizobium adhaerens，但由于剑菌属较中华根瘤菌属发现较早，因此此合并也未有最终结果。粘着剑菌（Ensifer adhaerens）是一类固氮菌，为革兰氏阴性菌，既可以存活于土壤，也可以定殖于植物体内。可以降解水体中的三致污染物三氯联苯（PCBs）；降解难降解的除草剂乙草胺（我国用量三大农药除草剂之一，难降解）、高毒、高残留农药甲拌磷和降解烟碱类杀虫剂噻虫嗪与噻虫啉；降解多环芳烃（PAHs）中的芘，并且降解效果显著。除此之外，粘着剑菌可以降解连坐土壤中的羟基苯甲酸（PHBA），调节黄瓜叶片抗氧化酶，土壤酶活性，以缓解黄瓜连坐障碍；同时研究表明，粘着剑菌有拮抗烟草黑胫病病原菌烟草疫霉，以及拮抗烟草青枯病病原菌青枯罗尔氏菌。另外饲料中添加粘着剑菌后，可以提高虾对白斑综合症病毒的抗病力。

但是，目前还未见有可以降解多效唑的粘着剑菌的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一株可有效降解株粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株。

本发明的第一个目的是提供一株粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株。

本发明的第二个目的是提供所述粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株在降解多效唑中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株粘着剑菌Ensifer adhaerens dt8菌株，所述菌株于2018年4月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60351，分类命名为粘着剑菌（Ensifer adhaerens），保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

所述粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株呈短杆状。

b、菌落形态特性：在LB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现乳白色，中间凸起，边缘湿润整齐（30℃，生长24小时），菌落直径1.8-2.0 cm。最适生长温度是30 °C及最佳生长pH值7。

c、生理生化特性：兼性好氧，能利用L-谷氨酸、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇木糖、木糖醇、肌醇、酒石酸盐、纤维二糖、马尿酸、尿素、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、L-丙氨酸、L-天门冬氨酰胺、L-谷氨酰胺、去氧胆酸盐、柠檬酸钠盐、蔗糖、苹果酸为唯一碳源生长；不能水解明胶和淀粉。菌株耐NaCl的浓度达3.0%。

进一步地，所述Ensifer adhaerens dt8菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株能够在含有多效唑的固体培养基中生长，并且长势较好，其可以分泌胞外酶将培养中的多效唑降解，降低多效唑的含量，解除多效唑对菌体的毒害作用。因此，本发明还请求保护粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株在耐受多效唑生长和/或降解多效唑中的应用。

优选地，是在降解土壤中多效唑含量中的应用。

同时，本发明还请求保护所述Ensifer adhaerens dt8菌株在制备降低多效唑含量的菌剂中的应用。

一种耐受多效唑和/或降解多效唑的菌剂，所述菌剂含有如上所述的Ensifer adhaerens dt8菌株或其发酵液。

优选地，所述发酵液的OD₆₀₀为1.5。

优选地，所述菌剂还含有蛭石，发酵液与蛭石的质量体积比为1L：2kg。

同时，本发明还请求保护上述菌剂在降解土壤中多效唑含量中的应用。

一种降解土壤中多效唑含量的方法，将上述菌剂施用于受多效唑污染的土壤中。

优选地，所述土壤为常年污染的香蕉地或者芒果土壤，所述受污染土壤种植的农作物为香蕉或小麦。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株，该菌株在含多效唑培养基中可以生长，可以降解多效唑以减少其在培养基中的含量，以达到解除多效唑的毒害作用，其可以制备成为微生物肥料或者土壤修复菌株，应用于降解耕作土壤中多效唑，解除多效唑对作物或其他植物抑制顶端生长的胁迫作用，以及降低作物携带多效唑进入食物链的可能性，可广泛应用于农业生产和土壤修复及改良等方面，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为菌株dt8稀释后涂布于LB固体培养基上培养24小时后菌落图。

图2为菌株16S rDNA PCR产物电泳图。

图3为菌株dt8稀释后涂布于多效唑无机盐固体培养基上培养24小时后菌落图。

图4为菌株dt8施用香蕉苗葡效果图，左边为喷清水对照，右边为施用dt8菌株。

图5为菌株dt8对多效唑污染土壤的修复效果测试图，左边为喷清水对照，右边为施用dt8菌株。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 菌株的分离、纯化及筛选

发明人从海南省澄迈县福山镇香蕉园土壤中分离纯化得到耐受农药多效唑的微生物，具体分离纯化步骤如下：其中多效唑无机盐培养基为：氯化钠1g，氯化镁0.2g，氯化铵0.5g，氯化钙0.02g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水1000mL，PH自然（6.5），固体加琼脂粉18g/L，121℃灭菌20分钟，灭菌后加15%多效唑粉末1g。

将从海南省澄迈县福山镇香蕉园中采取回来的土样用灭过菌的碾砵碾碎，称取10g土样用90mL磷酸缓冲液（PBS）震荡悬浮10分钟，取100µL菌液涂布平板，28度培养箱培养。而用液体培养基培养时，利用液体培养基（不加琼脂粉），吸取100μL菌液28度摇床培养7天，待培养液很浑浊吸5μL涂平板分离纯化。观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势较好并不同形态特征的菌苔，用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色（石碳酸复红染色）和显微镜镜检（油镜），进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。将纯化后的dt8菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃保存。

实施例2 菌株的生理生化特性及分类地位

菌株的鉴定及保藏：实施例1分离得到的dt8菌株具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：所述菌株呈短杆状。

b、菌落形态特性：在LB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈现乳白色，中间凸起，边缘湿润整齐（30℃，生长24小时），菌落直径1.8-2.0 cm。最适生长温度是30 °C及最佳生长pH值7。

c、生理生化特性：兼性好氧，能利用L-谷氨酸、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇木糖、木糖醇、肌醇、酒石酸盐、纤维二糖、马尿酸、尿素、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、L-丙氨酸、L-天门冬氨酰胺、L-谷氨酰胺、去氧胆酸盐、柠檬酸钠盐、蔗糖、苹果酸为唯一碳源生长；不能水解明胶和淀粉。菌株耐NaCl的浓度达3.0%。

d、分子分类地位的确定

提取实施例1分离得到的dt8菌株的DNA，扩增16S rDNA基因，并琼脂糖凝胶检测，其扩增产物点电泳图如图2所示；将PCR扩增产物交由广州擎科生物技术有限公司直接进行测序，获得菌株的16S rDNA序列（如SEQ ID NO：1所示），将16S rDNA序列输入GenBank进行Blast比对，初步确定本发明的dt8菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的dt8菌株，与粘着剑菌（Ensifer adhaerens）模式菌株ATCC 33212相似性为99.86%。因此将本发明的dt8菌株应归属于粘着剑菌（Ensifer adhaerens）。

本发明所述的粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8已于2018年4月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60351，分类命名为粘着剑菌（Ensifer adhaerens），保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3

多效唑无机盐培养基：氯化钠 1g，氯化镁 0.2g，氯化铵 0.5g，氯化钙 0.02g，磷酸氢二钾 0.5g，磷酸二氢钾 0.5g，蒸馏水定容至1L，pH 自然（6.5），琼脂粉18g，121℃灭菌20分钟，灭菌后加15%多效唑粉末1 g。

将分离纯化的粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株活化后，制成菌悬液，OD₆₀₀=0.2；稀释10^-2后，涂布于灭菌的多效唑无机盐培养基上，37℃培养24～36小时。

结果如图3所示，菌株dt8稀释后涂布于多效唑无机盐固体培养基上培养24小时后，菌株能够利用多效唑作为碳源生长。

实施例4

将粘着剑菌（E. adhaerens）dt8配制为OD=0.5的菌悬液，以1%的接种量，接种到含100mL多效唑无机盐液体培养基（配方见实施例3，不加琼脂）的500mL体积的三角瓶中培养，以80 rpm摇瓶培养，三个重复，3天后，平均有67.2±1%的多效唑被降解；5天后，平均有85.3±0.6%的多效唑被降解；7天后，平均有93.5±0.7%的多效唑被降解。

实施例5

挑取活化得到的粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8单菌落于灭菌PBS中震荡混匀，接种于液体LB培养基中，30℃培养36～48小时，致使菌体浓度OD₆₀₀达到1.5。用蛭石作载体，将粘着剑菌发酵液与蛭石（1:2）混合（如1升培养液混合2公斤蛭石），制备成菌数达1.5～2.0´10⁹ CFU.g^-1的菌剂。

将粘着剑菌-蛭石接种剂0.5kg施用于海南地区受多效唑污染的香蕉苗葡，另外，以不施用菌剂的香蕉苗圃作为对照，种植香蕉苗，待其长大。

结果如图4所示，与对照相比，施用菌剂dt8后，香蕉苗茎秆恢复正常生长，而对照香蕉茎秆变矮，表明粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株可有效降解受多效唑污染的土壤中的多效唑，促进作物的生长。

实施例6

海南芒果区受控梢控花技术的限制，多年使用大量的多效唑，而多效唑难被土壤微生物降解，因此常年富集，不仅容易抑制芒果树及其他作物的生长，更容易破坏土壤生态。选取海南芒果园区多效唑污染较重的园区土壤为测试对象，对比多效唑降解菌dt8对该土壤的修复效果。

挑取活化得到的粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8单菌单菌落于灭菌PBS中震荡混匀，后涂布于固体培养基平板上，30℃培养36～48小时。待平板上长满菌体，收集菌体于无菌水中，稀释菌体浓度制备菌悬液OD₆₀₀为1.0。将从海南芒果园区多效唑污染较重的园区采到的供试土壤装入一次性塑料杯中，种植小麦（共十杯，试验组和对照组各5杯），待小麦出芽后淋施菌悬液一次，而对照则淋施自来水，一个月后观察小麦幼苗长势；

结果如图5所示，结果表明粘着剑菌（Ensifer adhaerens）dt8菌株具有降低土壤中多效唑含量能力，施用了多效唑菌悬液处理的小麦幼苗长势较对照好，并且也较对照更绿更高，从而减轻了多效唑对小麦的危害作用。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株粘着剑菌dt8菌株及其在降解多效唑中的应用

<130> YG18103569AX037

<141> 2018-05-08

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1465

<212> DNA

<213> 粘着剑菌dt8(Ensifer adhaerens dt8)

<400> 1

cgaaccctgg cggcaggctt acacatgcaa gtcgagcgcc ccgcaagggg agcggcagac 60

gggtgagtaa cgcgtgggaa tctacccttt tctacggaat aacgcaggga aacttgtgct 120

aataccgtat acgcccttcg ggggaaagat ttatcgggaa aggatgagcc cgcgttggat 180

tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat 240

gatcagccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa 300

tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg 360

gttgtaaagc tctttcaccg gtgaagataa tgacggtaac cggagaagaa gccccggcta 420

acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc 480

gtaaagcgca cgtaggcgga catttaagtc aggggtgaaa tcccggggct caaccccgga 540

actgcctttg atactgggtg tctagagtat ggaagaggtg agtggaattc cgagtgtaga 600

ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctcac tggtccatta 660

ctgacgctga ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720

ccgtaaacga tgaatgttag ccgtcgggca gtttactgtt cggtggcgca gctaacgcat 780

taaacattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 840

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc 900

ttgacatccc gatcgcggat tacggagacg ttttccttca gttcggctgg atcggagaca 960

ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcacgagc 1020

gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcacc tctaagggga ctgccggtga 1080

taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac 1140

taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac 1200

acacgtgcta caatggtggt gacagtgggc agcgagaccg cgaggtcgag ctaatctcca 1260

aaagccatct cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag 1320

taatcgcaga tcagcatgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccatggg agttggttct acccgaaggt agtgcgctaa ccgcaaggag gcagctaacc 1440

acggtagggt cagcgactgg ggtgc 1465

Claims (9)

1.一株粘着剑菌，其特征在于，所述菌株为粘着剑菌(Ensifer adhaerens)dt8，该菌株于2018年4月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No：60351。

2.权利要求1所述粘着剑菌在降解多效唑中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是在降解土壤中多效唑含量中的应用。

4.权利要求1所述粘着剑菌在制备降低多效唑含量的菌剂中的应用。

5.一种降低多效唑含量的菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的粘着剑菌或其发酵液。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述发酵液的OD₆₀₀为1.5。

7.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，还含有蛭石，发酵液与蛭石的质量体积比为1L：2kg。

8.权利要求5～7任一项所述菌剂在降解土壤中多效唑含量中的应用。

9.一种降解土壤中多效唑含量的方法，其特征在于，将权利要求5～7任一项所述菌剂施用于受多效唑污染的土壤中。

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