CN102851237B

CN102851237B - 粘着箭菌及其应用

Info

Publication number: CN102851237B
Application number: CN201210277930.2A
Authority: CN
Inventors: 戴亦军; 王颖; 翟闪; 周广灿; 葛峰; 袁生
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: CN102851237A

Abstract

本发明公开了粘着箭菌EnsiferadhaerensCGMCC6315是一种具有固氮能力的细菌；该菌株也是一种植物根际促生细菌（plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR），可产生吲哚乙酸（IAA）、胞外多糖（EPS）、嗜铁素（siderophore）、水杨酸（SA）、2，3-二羟基苯甲酸（DHBA）、氰化氢（HCN）和氨。在含有氯化钠的盐胁迫条件下，接种了E.adhaerensCGMCC6315的黄豆可比未接种菌株的对照组具有更高的发芽率。

Description

粘着箭菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及固氮菌和植物根际促生细菌粘着箭菌Ensifer adhaerens CGMCC 6315在盐胁迫条件下提高黄豆发芽率的应用。

背景技术

植物根际促生菌PGPR是一类具有促进作物活力并增加产量，抑制植物病原菌、根际有害微生物的根际微生物。PGPR是生物肥料和生物农药的重要资源库，其筛选、开发和应用受到越来越多的重视。PGPR促进植物活力的机制可分为直接和间接促进作用两种方式。直接促进作用包括产生植物生长激素、固氮作用、加强对营养物质的吸收利用（主要是铁离子的利用和固态磷的溶解）等；间接促进作用方式主要是PGPR能抑制植物病原菌的生长及改善病原菌对植物的侵染条件，从而促进植物的生长。在直接促进作用方式中，PGPR可提供外源激素而影响作物的生长，一些PGPR能产生IAA，改善受盐胁迫的植物自身合成生长素IAA的能力受到抑制的不利影响。PGPR还可通过产生嗜铁素向植物提供铁-嗜铁素复合体，从而增加植物对铁营养的吸收。

土壤盐渍化对农业的影响是一个全球性的问题，全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁，我国的盐渍地总面积约1亿公顷。当盐浓度达一定值时会破坏植物细胞的正常生命活动，使植株的生长受到抑制，因而土壤盐渍化造成土地产出率低，农业综合生产能力严重不足，制约了农业生产的发展。

申请人筛选到一株命名为TMX-23的菌株，该菌株具有固氮能力，基因组中有两种不同的固氮酶还原酶基因（nifH）。该菌株产生吲哚乙酸、胞外多糖、嗜铁素、水杨酸、2，3-二羟基苯甲酸、氰化氢和氨。TMX-23菌株被鉴定为粘着箭菌E. adhaerens，TMX-23菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC 6315。目前尚未见有E. adhaerens作为植物根际促生菌的研究报道。E. adhaerens CGMCC 6315菌株可用作PGPR菌剂，显著提高盐胁迫下的黄豆发芽率。该菌株可应用于盐渍地的农业生产，提高作物的活力和产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有固氮能力和具有PGPR活性的菌株，及其应用于盐胁迫条件下的黄豆发芽率的提高。

本发明所提供的菌株为一种粘着箭菌E. adhaerens，该菌株现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 6315。其形态结构如图1所示。该菌株的基于16S rDNA序列分析的系统发育树如图2所示。

本发明提供的E. adhaerens CGMCC 6315菌株具有固氮能力。如图3所示，该菌株可在固氮培养基上生长。从其基因组DNA中克隆获得两个固氮酶还原酶基因nifH（图4泳道1中的条带3和4）片段。DNA序列遗传进化树分析（图5）显示这两个nifH基因片段分别与Ensifer sp. TJ170和蓝细菌Calothrix sp. MCC-3A的nifH基因的同源性为100%。

本发明提供了E. adhaerens CGMCC 6315菌株具有PGPR活性，可产生PGPR物质如吲哚乙酸、嗜铁素、水杨酸、2、3-二羟基苯甲酸、胞外多糖、氰化氢和氨等。

上述所述的应用是将E. adhaerens CGMCC 6315 接种至黄豆（Glycine max L.）上，在培养箱中进行发芽。在含有50-154mmol/L的氯化钠溶液的胁迫条件下，接种了E. adhaerens CGMCC 6315菌株的黄豆比未接种菌株的对照组具有更高的发芽率。

附图说明

图1 E. adhaerens CGMCC 6315的扫描电镜照片。

图2 E. adhaerens CGMCC 6315的16S rDNA序列系统发育树。

图3 E. adhaerens CGMCC 6315在固氮培养基上生长的菌落图。

图4 从E. adhaerens CGMCC 6315基因组中克隆nifH基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图5 E. adhaerens CGMCC 6315的nifH基因序列系统发育树。

具体实施方式

实例一：植物根际土壤固氮菌株的分离筛选、鉴定和生物学特性

1. 菌株分离

从江苏省南京市地区采集土壤，取2g土壤加入含10颗玻璃珠的18mL无菌水中，振荡5min，静置10min后，取10ml悬液加入250ml含1%葡萄糖的矿物盐培养基中。矿物盐培养基的组成为： 1.36 g/L KH₂PO₄，2.13g/L Na₂HPO₄，0.5 g/L MgSO₄·7H₂O和10mL/L金属离子液，pH 7.5。金属离子液组成为：0.40 g/L CaCl₂·2H₂O, 0.30 g/L H₃BO₃, 0.04 g/L CuSO₄·5H₂O, 0.10 g/L KI, 0.20 g/L FeSO₄·7H₂O，0.40 g/L MnSO₄·7H₂O，0.20 g/L NaMoO₄·2H₂O和10.0 mL/L浓盐酸。样品于30℃、转速为220rpm的摇床中培养1个月。取10ml悬液接种到上述新鲜的含1%葡萄糖的矿物盐培养基中，并在上述培养条件下培养1个月，重复上述步骤一次。取100μl样品稀释到10^-2-10^-4后，涂布于LB固体培养基上。LB培养基组成为：蛋白胨10g/L；酵母膏5g/L；NaCl 10g/L；pH7.2。从LB平板挑取形态不同的单菌落划线至LB平板上，30℃培养1-2天后，再次进行菌种平板划线纯化。获得3株形态不同的细菌。

固氮菌的筛选

将上述3种细菌接种到LB平板上，待其长出单菌落后，挑单菌落划线到Nfb固体培养基上，30℃培养。Nfb培养基组成为：KH₂PO₄ 1.2 g/L、K₂PO₄ 0.8 g/L、Glucose 5 g/L、MgSO₄ ^.7H₂O 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaCl^.2H₂O 0.02 g/L、FeSO₄ ^.7H₂O 0.002 g/L、金属离子液 2mL。金属离子液组成为：NaMoO₄ ^.2H₂O 1.0 g/L、MnSO₄ ^.H₂O 1.75 g/L、H₃BO₃1.4 g/L、CuSO₄ ^.5H₂O 0.04 g/L、ZnSO₄ ^.7H₂O 0.12 g/L。培养一周后，其中命名为TMX-23的菌株在固氮培养基上出现非常明显的菌落生长。

菌株的鉴定及生物学特性

在LB固体培养基上，TMX-23菌落呈乳白色、不透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。革兰氏阴性。如图1所示，TMX-23菌体呈杆状，大小为 0.4-0.6×1.0-1.5μm。无鞭毛，无芽胞。

采用16S rDNA序列分析进行TMX-23菌株的分子鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取适量的TMX-23菌体到20μl无菌水的离心管中，混匀，100℃加热处理10min，瞬时离心，待菌体冷却，每50μl PCR体系加入5μl作为模板。采用细菌16S rDNA基因扩增通用正向引物 K1和 K2进行16S rDNA片段的PCR扩增，引物K1的序列为: 5’- AACTGAAGAGTTTGATCC TGGCTC-3’ （SEQ ID No：1），引物K2的序列为: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ （SEQ ID No：2）。PCR扩增条件为：94℃预变性2min 后，94℃变性1min，59℃退火1.5min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃延伸10min。所得序列由生工生物工程（上海）有限公司测序后，得到的部分16S rDNA序列（SEQ ID No：3）在美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库中进行blast搜索并构建系统发育树。如图2所示，TMX-23菌株与Ensifer adhaerens处于同一个分支，相似性达到99%。因而TMX-23菌株被鉴定为E. adhaerens。TMX-23菌株于年2012年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院研究所；保藏编号为CGMCC 6315，分类命名为：粘着箭菌Ensifer adhaerens 。

固氮酶还原酶基因克隆

E. adhaerens CGMCC 6315在固氮培养基上出现非常明显的菌落生长（图3），因而进一步克隆其固氮酶还原酶基因进行验证。用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）提取E. adhaerens CGMCC 6315基因组DNA。采用巢式PCR克隆nifH基因。使用两对简并引物进行两轮PCR反应，引物序列分别为N-F-A（5’-GCNWTNTAYGGNAARGGNGG-3’）（ W表示碱基为A/T， Y表示碱基为C/T， N表示碱基为A/T/C/G或其它，R表示碱基为A/G， V表示碱基为A/C/G，B表示碱基为C/G/T）（SEQ ID No：4）、N-F-B （5’-GGNTGTG AYCCNAAVGCNGA-3’）（SEQ ID No：5）和N-R（5’-GCRTANABNGCCATCATYTC-3’）（SEQ ID No：6）。以基因组DNA为模板，以引物N-F-A和N-R为模板进行第一轮PCR扩增。反应体系（25μl）为：10 x PCR缓冲液2.5μl，dNTP 2μl，MgCl₂ 2μl，引物N-F-A 0.5μl, 引物N-R 0.5μl，模板（基因组）1μl，Ex-taq DNA 聚合酶 0.5μl，加水至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸1min，反应29个循环，最后72℃保温10min。用DNA纯化试剂盒对将上述PCR 产物进行纯化。以上述PCR纯化产物为模板，以N-F-B和N-R为引物进行第二轮PCR。反应体系和扩增条件同第一轮PCR。第二轮PCR扩增结果如图4所示。对PCR产物条带进行切胶回收和纯化。纯化产物采用pMD18-T载体试剂盒（TaKaRa公司）进行TA克隆后，送生工生物工程（上海）有限公司测序。测序结果显示图4中的条带1和2为非特异性扩增，条带3（SEQ ID No：7）和条带4（SEQ ID No：8）测得的序列均为368bp。在genbank数据库中Blast分析显示，条带3和条带4均为nifH基因，系统发育树分析（图5）显示条带3测得的DNA序列与Ensifer sp. TJ170的nifH基因同源性为100%；条带4测得的序列与蓝细菌Calothrix sp. MCC-3A的nifH基因的同源性为100%。上述结果表明E. adhaerens CGMCC 6315有两种不同的固氮酶还原酶基因。

实例二：E. adhaerens CGMCC 6315 菌株的PGPR活性测定

参照Bric等1991年报道的方法测定吲哚乙酸IAA的含量；参照Alexander和Zuberer1991年报道的方法在铬天青固体平板上测定铁载体siderophore的分泌；参照Reeves等1983年报道的方法测定水杨酸SA和2,3-二羟基苯甲酸DHBA的含量；胞外多糖EPS含量测定参照Mody等1989年报道的方法；磷的释放、氰化氢和氨的释放按照Schippers等1990年报道的方法进行检测。测定结果表明E. adhaerens CGMCC 6315菌株培养24h后产生8.2μg/mL吲哚乙酸、5.7 mg/mL胞外多糖、培养48h后产生6.9 μg/mL水杨酸和0.48 μg/mL2，3-二羟基苯甲酸；E. adhaerens CGMCC 6315分泌嗜铁素，氰化氢和氨，但不具有溶磷作用。上述结果表明E. adhaerens CGMCC 6315是一种植物根际促生细菌。

实例三：在盐胁迫条件下，在黄豆表面接种E. adhaerens CGMCC 6315可促进其发芽

挑取大小一致的黄豆若干颗，自来水浸泡6 h。用70%乙醇消毒30S，用无菌水冲洗去除乙醇。E. adhaerens CGMCC 6315菌体在LB液体培养基中培养16h，离心、无菌水洗涤后，用不同浓度的氯化钠溶液悬浮，菌体浓度调节为10⁸菌落形成单位（CFU）。将经上述处理过的黄豆分别放入含有菌株的不同浓度的NaCl溶液中浸泡30min。

在9cm无菌培养皿底放入一层灭菌滤纸，加入4mL上述不同浓度的NaCl溶液。每个培养皿放入20颗上述经处理的黄豆，培养皿放入培养箱中，28℃培养。实验设置三个平行，重复三次。4d后计算发芽率。在50mmol/L的NaCl浓度下，接种了E. adhaerens CGMCC 6315的黄豆的发芽率由对照组的58.9%提高到67.2%。

实例四：与实例三相同， NaCl浓度提高至100mmol/L。接种了E. adhaerens CGMCC 6315的黄豆的发芽率由对照组的52.8%提高到63.9%。

实例五：与实例三相同，在154mmol/L NaCl浓度下，接种了E. adhaerens CGMCC 6315的黄豆的发芽率由未接种菌株的42.8%提高到55.6%。

本发明并不仅仅限于上述的实施例。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 粘着箭菌Ensifer adhaerens CGMCC 6315及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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aactgaagag tttgatcctg gctc 24

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taggttacct tgttacgact t 21

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<212> DNA

<213> 粘着箭菌（Ensifer adhaerens）

<400> 3

ggggaaacac ctcgcggcgg cttaccatgc aagtcgagcg ccccgcaagg ggagcggcag 60

acgggtgagt aacgcgtggg aatctaccct tttctacgga ataacgcagg gaaacttgtg 120

ctaataccgt ataagccctt cgggggaaag atttatcggg aaaggatgag cccgcgttgg 180

attagctagt tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tccatagctg gtctgagagg 240

atgatcagcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtgggg 300

aatattggac aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgagtgat gaaggcccta 360

gggttgtaaa gctctttcac cggtgaagat aatgacggta accggagaag aagccccggc 420

taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta gcgttgttcg gaattactgg 480

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gaactgcctt tgatactggg tgtctagagt atggaagagg tgagtggaat tccgagtgta 600

gaggtgaaat tcgtagatat tcggaggaac accagtggcg aaggcggctc actggtccat 660

tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 720

cgccgtaaac gatgaatgtt agccgtcggg cagtttactg ttcggtggcg cagctaacgc 780

attaaacatt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagga attgacgggg 840

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa ccttaccagc 900

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<223> n is i

<220>

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<222> (12)..(12)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

ggntgtgayc cnaavgcnga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<221> misc_feature

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gcrtanabng ccatcatytc 20

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<212> DNA

<213> 粘着箭菌（Ensifer adhaerens）

<400> 7

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gatgttgact ttgtatctta tgacgttctt ggtgacgtag tttgtggtgg ttttgccatg 300

ccgatccgtg aggggaaagc tcaggagatc tacattgtga catcgggtga gatgatggct 360

ctctacgc 368

<210> 8

<211> 368

<212> DNA

<213> 粘着箭菌（Ensifer adhaerens）

<400> 8

gggtgtgatc cgaaggccga ctccacccgg ctgatcctgc acgcaaaggc tcaggacacg 60

atcctgtcgc tggccgccga agccggttcg gtggaagacc tggagatcga agacgtcatg 120

aagatcggct tccgcgacat ccgttgcgtg gagtccggtg gccccgagcc gggcgtcggc 180

tgtgccggcc gcggtgtgat cacctcgatc aacttcctgg aagaaaacgg cgcctatgac 240

ggcgtggact atgtgtccta cgacgtgctg ggtgacgtgg tgtgcggcgg cttcgccatg 300

cccatccgcg agaacaaggc ccaggaaatc tacatcgtca tgtcgggcga gatgatggca 360

gtctacgc 368

Claims

1.一种粘着箭菌（Ensifer adhaerens），它的保藏编号为：CGMCC 6315。

2.粘着箭菌（Ensifer adhaerens）CGMCC 6315在提高黄豆发芽率中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将粘着箭菌（Ensifer adhaerens）CGMCC 6315接种至黄豆上，在含有50mmol/L至154mmol/L浓度的氯化钠的盐溶液中进行培养发芽。