CN111117924B

CN111117924B - 复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法

Info

Publication number: CN111117924B
Application number: CN202010030941.5A
Authority: CN
Inventors: 柴彦亮; 刘杰; 满丽萍; 邱鹏飞; 冷伟锋
Original assignee: Sinochem Agriculture Linyi Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Sinochem Agriculture Linyi Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111117924A

Abstract

本发明一种复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法。所述复合菌剂包括选自下列中的至少两种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844。所提供的肥料含有所述复合菌剂。通过所提供的复合菌剂或者肥料，可以用来防治根腐病，提高品质和产量。

Description

复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法

技术领域

本发明涉及微生物和肥料领域，具体涉及一种复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法。

背景技术

草莓易于栽培、当年结果、口感优良、产量高、经济效益好，在国内、国际市场上具有重要的经济地位。但是，随着草莓种植面积的扩大，栽培品种多，也出现了长年连作、病害逐年加重现象，且长期施用不足或未经完全腐熟的畜禽粪便作为底肥，带入病原菌、影响土壤养分平衡。同时，农户草莓苗来源多变，草莓苗仅采购部分无菌苗，大部为经脱毒处理，无法科学预防种苗带病问题，使得重茬病害现象严重，尤其是根腐病易爆发，难根治，叶片、根系受损，造成产量和品质受影响。连作导致土壤理化性质改变，其土壤盐含量升高、板结严重，影响根系生长。草莓根腐病发病受连作年限、种植地域，草莓苗质量的影响，目前应对草莓根腐病主要通过闷棚、翻地、控温、控湿等物理手段，使用苯并咪唑类保护性杀菌剂等化学手段，以及使用具有抗重寄生、抗病、诱导产生抗病性功能的生物制剂进行生物防治。但物理手段效果较差、化学手段容易造成二次污染，生物手段因环境友好、抗病针对性强，是防治草莓根腐病病害的优良手段。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法。

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：抑菌蛋白类，脂肽类蛋白质，伊枯草菌素A，表面活性物质，芬芥素，芽孢菌素D，大环内酯类，寡肽酶，肽类，聚酮化合物等。解淀粉芽孢杆菌对多种作物的致病真菌有较好的抑制效果，可制成生物制剂应用于植物病害防治上，因此其生物学特性和生产工艺的研究具有非常重要的意义。本研究中以临沂地区多见的镰刀菌根腐病致病菌作为靶标真菌进行拮抗菌的筛选与鉴定，进行草莓根腐病生防菌的研究，筛选拮抗活性高的菌株，并对其进行生产应用技术探究。所筛选获得了四株解淀粉芽孢杆菌，其能够降低灰霉病、立枯病、根腐病和炭疽病等多种农作物病害的发病指数。例如可以防治因拟盘多毛孢、镰刀菌引发的根腐病，能够产生抗生素、胞外溶解酶来抑制病原微生物拟盘多毛孢和镰刀菌的菌丝生长，致菌丝畸形，减少孢子产生，达到杀死病害菌群的目的，适应草莓种植过程中抗病改土的需求。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括选自下列中的至少两种解淀粉芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844；所述解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明提供的四种解淀粉芽孢杆菌中的任意一株，对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢、镰刀菌的平明拮抗率均在75％以上，当四株解淀粉芽孢杆菌同时使用时，对拟盘多毛孢、镰刀菌的拮抗率均在85％以上。而且针对性强，针对由拟盘多毛孢、镰刀菌单独引发或同时引发的草莓根腐病，在草莓定植之前与底肥共同施用，能够提高对草莓根系的保护；而且与其他菌的共生性好，使用本发明所提供的复合菌剂后，草莓叶片褐斑、根系变褐现象明显减少9％～33％。

根据本发明的实施例，以上所述的复合菌剂可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂为干粉状，每克所述复合菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为1×10⁸以上，优选为1×10⁹～1×10¹¹。

在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂中任意两种解淀粉芽孢杆菌的重量比为1～3： 1～3，优选为1～1.5：1～1.5。由此可以有效防治草莓根腐病。

在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂进一步包括选自下列中的至少一种：胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉。本发明中所提供的复合菌剂包含四株解淀粉芽孢杆菌中任意两种，其中每一株都能对拟盘多毛孢、镰刀菌产生防效，与胶质芽孢杆菌、绿色木霉和/或土曲霉同时使用后防效增强。在施用进土壤后，能够有效的抑制病原微生物菌丝及孢子的发育，从而起到防治草莓根腐病的作用。

在本发明的一些实施例中，所述胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉中的任意一种与所述解淀粉芽孢杆菌中的任意一种的重量配比为1:3，优选为1:1.5。由此可以有效防治草莓根腐病。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备复合菌剂的方法，所述复合菌剂为本发明第一方面所述的复合菌剂，所述方法包括：将菌株分别进行发酵处理，基于发酵处理的产物获得微生物菌剂；将所述微生物菌剂进行复配，以便获得所述复合菌剂。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包含本发明第一方面任一实施例所述的复合菌剂。

根据本发明的实施例，以上所述的肥料可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥、有机复合肥、有机无机复混肥中的至少一种，所述复合菌剂的含量为所述基础肥料的含量的1‰～5‰。

在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料和5～15重量份的硅酸钙。在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的炭基肥和20重量份的小分子有机料，和10重量份的硅酸钙。本发明所提供的一种肥料含有发酵牛粪，炭基肥和小分子有机料，以及复合菌剂；其中炭基肥能够增强土壤保水保肥能力和缓冲性，对土壤物理性质有改善；小分子有机料能够有效补充土壤有机质，增加土壤碳氮养分，为丰富根系微生物菌群提供养分。小分子有机料和炭基肥中含有氨基酸成分，在土壤中施用后能够促进植株根系生长，达到壮苗、健株、增强叶片的光合功能及作物的抗逆性。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种防治根腐病的方法，包括：

对植物施用有效量的复合菌剂或者肥料，所述复合菌剂为本发明第一方面任一实施例所述的复合菌剂，所述肥料为本发明第三方面任一实施例所述的肥料。

在本发明的一些实施例中，所述植物为草莓，所述根腐病为镰刀菌和/或拟盘多毛孢引起的根腐病。

菌种保藏信息

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17841，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17842，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17843，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17844，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)在LB培养基上的的菌落形态。

图2是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)拮抗草莓根腐病的效果图。

图3是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)的16srRNA的系统发育树图。

图4是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17842)在LB培养基上的平皿形态图片。

图5是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17842)对镰刀菌的平皿拮抗效果图。

图6是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17842)的16srRNA的系统发育树图。

图7是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)在LB培养基上的平皿形态图。

图8是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)对拟盘多毛孢的平皿拮抗效果图。

图9是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)的16SrRNA的系统发育树图。

图10是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)在LB培养基上的平皿形态图。

图11是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)对棒状拟盘多毛孢的平皿拮抗效果。

图12是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)的16SrRNA的系统发育树图。

图13是根据本发明的实施例提供的PCR反应条件的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质含量的百分比。

本发明通过大量筛选工作得到四株能够防治多种植物病害的解淀粉芽孢杆菌菌株，将这些解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCC No.17844。这些该解淀粉芽孢杆菌无论是作为微生物菌剂单独使用，还是复配使用，在防治草莓根腐病中均显示出非常高效的防治效果。例如可以用于草莓的根腐病防治，从而可以提高草莓的品质和产量。另外所提供的解淀粉芽孢杆菌还可以与其他微生物菌剂复配使用，或者直接添加到肥料中，作为肥料的一部分使用；也可以与肥料配合使用，表现出广泛应用前景。

复合菌剂、制备方法和应用

在本发明的一个方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂含有至少两种解淀粉芽孢杆菌，各解淀粉芽孢杆菌均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，各保藏编号分别为CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCCNo. 17844。

在本发明的至少一些实施方式中，所述复合菌剂中任意两种解淀粉芽孢杆菌的重量配比为1～1.5：1～1.5。在本发明的至少一些优选实施方式中，所述复合菌剂含有解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCC No.17844，其重量配比为1～1.5:1～1.5:1～1.5：1～1.5；复合菌剂可以为干粉状，每克所述复合菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为1×10⁸～1×10¹¹。

在本发明的另一些实施方式中，所述复合菌剂除了含有以上所提到的四种解淀粉芽孢杆菌，还可以含有胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉中的至少一种。在本发明的一些优选实施方式中，所述复合菌剂包括解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCC No.17844、胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉，其重量配比为1～1.5:1～1.5:1～1.5:1～1.5:1:1:1；复合菌剂可以为干粉状，每克所述复合菌剂中含有的有效活菌数为1.7×10⁹～8.2×10¹⁰。

所提供的复合菌剂可以用于防治根腐病，例如可以用于防治因拟盘多毛孢和/或镰刀菌侵染导致的根腐病。复合菌剂的应用方式多样化，可以直接用于作物，也可以与作物底肥配合施用，也可以在有机肥、有机无机肥、复合肥制造过程中添加。

本发明还提供了制备上述复合菌剂的方法。所提供的复合菌剂可以通过将不同的微生物发酵获得微生物菌剂，然后将不同的微生物菌剂复配获得。在将不同的微生物菌剂复配时，按照复合菌剂中各微生物菌剂的比例混合均匀即可。

通过相似的条件发酵获得解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841微生物菌剂、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842微生物菌剂、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843微生物菌剂或者解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842微生物菌剂。以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842为例，本发明提供了一种制备该微生物菌剂的方法，包括：对解淀粉芽孢杆菌CGMCC No. 17842进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物菌剂。在本发明的至少一些实施方式中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵培养，以便获得发酵培养液；将所述发酵培养液接种在固体发酵培养基中进行固体发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。在至少一些实施方式中，可以利用LB培养液进行所述液体发酵培养，所述液体发酵培养的时间为10小时以上，优选为10～16小时。

在本发明至少一些实施方式中，将所述发酵培养液按照接种量为5％～10％接种在固体发酵培养基中进行发酵培养。所用到的固体发酵培养基包括3～10重量份的麦麸，2～8重量份的玉米粉，0.5～5重量份的豆粕，0.5～5重量份的葡萄糖，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5 重量份的氯化钠和水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。

在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，3重量份的玉米粉，1重量份的豆粕，1重量份的葡萄糖，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为55％。

胶质芽孢杆菌可以按照与解淀粉芽孢杆菌相似的条件进行发酵，制备胶质芽孢杆菌菌剂。在至少一些实施方式中，胶质芽孢杆菌菌剂通过下述方法发酵获得：将胶质芽孢杆菌进行液体发酵培养，然后将发酵培养液接种到第一固体发酵培养基上。在至少一些实施方式中，该第一固体发酵培养基包括：3～10重量份的麦麸，2～8重量份的玉米粉，0.5～5重量份的豆粕，0.5～5重量份的葡萄糖，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，3重量份的玉米粉，1重量份的豆粕，1重量份的葡萄糖，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为55％。在一些实施方式中，可以将发酵液按照5％～10％接种量进行接种。

绿色木霉和土曲霉可以采用相似的条件发酵制备绿色木霉菌剂或者土曲霉菌剂。在本发明的至少一些实施方式中，可以将绿色木霉和土曲霉分别在PDA液体培养液中发酵，然后将发酵培养液接种到第二固体发酵培养基上，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中，可用的第二固体发酵培养基包括：2～5重量份的麦麸，1～5重量份的玉米淀粉，0.5～3 重量份的大米碎渣，0.5～3重量份的小米，0.3～1.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为55％～65％。在一些优选实施方式中，第二固体发酵培养基包括：2重量份的麦麸，1.5重量份的玉米淀粉，1重量份的大米碎渣，1重量份的小米，0.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为60％。将得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物分别进行烘干粉碎，获得粉末状的土曲霉菌剂和绿色木霉菌剂，其中每克土曲霉菌剂含有土曲霉的有效活菌数为3×10¹⁰以上，优选为5×10¹⁰；每克绿色木霉菌剂含有绿色木霉的有效活菌数为2×10¹⁰，优选为4×10¹⁰。

肥料、制备方法和应用

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料含有上述复合菌剂。本发明所提供的肥料可以将生物有机肥、有机复合肥、有机无机复混肥、无机复合肥等与复合菌剂复配获得。在本发明的至少一些实施方式中，所提供的生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料和5～15重量份的硅酸钙；优选地，所提供的生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的炭基肥和20重量份的小分子有机料，和10重量份的硅酸钙。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下示例中涉及的原料用量均为按重量比例计，其中重量单位可以是g、kg、吨等重量单位。

实施例1菌株的分离、筛选、鉴定

实施例1提供了四株解淀粉芽孢杆菌，其分离、筛选、鉴定分别如下：

1、解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)的分离、筛选与鉴定

(1)菌株的分离与筛选

从山东省临沂市河东区观塘镇种植草莓的地区收集100份健康土壤样品，从土壤样品中分离拮抗草莓根腐病的土壤微生物。将采集到的土壤样品称取1g左右装于250mL三角瓶中，加入少量玻璃珠，三角瓶中预先装入100mL的无菌蒸馏水。将三角瓶放入摇床内震荡培养过夜，取出静止后吸取上层液1ml打入装有9ml无菌水的试管中，以此10倍逐级稀释，稀释至10³-10⁶倍。取100μl各级稀释液均匀涂布在固体平板上，分别以高氏1号培养基、LB培养基作为基质。每处理3次重复，培养条件为28℃。培养2-5d后挑取代表性菌株，进行平皿拮抗筛选，通过与草莓根腐病菌拮抗，筛选出拮抗效果明显的菌株。

将所筛选得到的拮抗效果好的一菌株编号为J1，其在LB培养基中的菌落形态如图1 所示；其与草莓根腐病原菌的平皿拮抗效果图如图2所示。

(2)菌株的鉴定

提取菌株总DNA：将拮抗效果好的JI菌株接种于营养液体培养基中培养1d，取1.0-2.0mL发酵液离心后，取菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒-离心柱型(北京天根生物公司)进行菌株总DNA的提取，将DNA产物保存在-20℃，以防降解。若菌株为较难破壁的革兰氏阳性菌，则先加入溶菌酶，37℃处理30min以上。

16S rRNA基因的PCR扩增及回收：利用扩增细菌16S rRNA的通用引物(即下述SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，由宝生物工程(大连)技术有限公司合成)按照下述PCR反应体系以及下述PCR反应条件扩增该菌株的16S rRNA。

上游引物：5’一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物：5’一GGCTACCTTGTTACGACT一3’(SEQ ID NO:2)。

PCR反应体系：

PCR反应条件如图13所示。

PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测片段长度和纯度后，送至宝生物工程(大连)有限公司测序部进行测序，结果经NCBI网站对比分析，构建系统发育树，鉴定菌株种类。

所扩增的编码该J1菌株16S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示：

GCTCACTTGGGCTACCTCACCGACTTGGTGGTGTTACAAACTCTCGAGGTGTGACGG GCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTA GCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATT TGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGT GTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCAT GCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGA TGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC TTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGC GGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGC ACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTT CGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAC ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTT CCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGA AACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGC CGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAAC CTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTA CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCT CTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATG CGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCG GTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGG CAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTCGAAAGTAT(SEQ ID NO:3)。

该菌株的系统发育树如图3所示，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，将其保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.17841。

2、解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17842)的分离、筛选与鉴定

(1)菌株的分离与筛选

利用平板涂布法和平板划线法分离获得抗病菌株：在山东莒南草莓大棚根腐病发病田块中选取健康草莓植株，将根部土壤轻轻抖落，用清水冲洗干净，然后将其放置在称量纸上用刀片轻刮草莓根系，全部收集混匀，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在NA培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。

初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在草莓根腐病病原菌(镰刀菌)边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将菌株用牙签接种在平板四周， 25℃恒温培养，逐日观察菌株对病原菌的抑制作用。

复筛：将筛选得到的对镰刀菌具有高效拮抗作用的菌株进行复筛，主要经过耐温、耐盐性试验，筛选得到耐性较好的菌株，进行后续复配和在微生物肥料的中的效果试验。

经过上述分离以及筛选，获得一耐性好的、抗病菌株，命名为J2菌株，该菌株在LB培养基上的菌落形态如图4所示。其对于镰刀菌表现出较高的拮抗率，其拮抗效果图如图 5所示。

(2)鉴定

将所获得的J2菌株进行微生物特性的鉴定以及分子生物学特性的鉴定，其结果如下所示：

微生物学特性：在NA培养基上菌落形态为圆形，乳白色微黄，表面粗糙起褶皱，在NA培养基上，28℃培养2d后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。

分子生物学特性：其所编码16r RNA的序列如SEQ ID NO:4所示，根据该16s rDNA基因序列所构建的系统发育树如图6所示。

ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCC TGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGT GAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATC GTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGAC GGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC(SEQ ID NO:4)。

综上，该J2菌株经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为GGMCC No.17842。

3、解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17843)的分离、筛选与鉴定

(1)分离与筛选

初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在草莓根腐病病原菌(拟盘多毛孢和镰刀菌)边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将菌株用牙签接种在平板四周，25℃恒温培养，逐日观察菌株对病原菌的抑制作用。

复筛：将筛选得到的对两株病原菌均具有高效拮抗作用的菌株进行复筛，主要经过耐温、耐盐性试验，筛选得到耐性较好的菌株，即得到本发明所述的解淀粉芽孢杆菌。

经过上述分离以及筛选，获得一耐性好的、抗病菌株，命名为J3菌株，该菌株在LB培养基上的菌落形态如图7所示。其对于镰刀菌表现出较高的拮抗率，其拮抗效果图如图8所示。

(2)菌株的鉴定过程包括：

分子生物学特性：其16S rRNA序列如SEQ ID NO:5所示，根据该16srDNA基因序列所构建的系统发育树如图9所示。

J3菌株的16S rRNA测序结果：

ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCC TGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGT GAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATC GTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGAC GGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGT(SEQ ID NO:5)

综上，该J3菌株经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17843。

4、解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)的分离、筛选与鉴定

(1)分离与筛选

通过分离草莓根腐病病株，分离得到草莓根腐病的致病菌-棒状拟盘多毛孢(ZH-G01)，经ITS序列测定，并MEGA7.0做系统发育树分析，结果表明分离得到的菌株是棒状拟盘多毛孢。

棒状拟盘多毛孢ZH-G01的ITS序列如下所示(SEQ ID NO:6)：

TACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCA TTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTAT TCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGG AATCTACTTCTTTTATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTC TGAGCGTAGTAATTTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAAC CCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA(SEQ ID NO:6)

利用平板涂布法和平板划线法分离获得抗病菌株：在山东莒南草莓大棚根腐病病株中选取发病部位组织，用清水冲洗干净，并表面消毒后，经研钵研磨，取1ml研磨组织样本放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴，选取 3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在NA培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。

选择对上述棒状拟盘多毛孢(ZH-G01)表现出良好的拮抗效果的菌株，将其编号为J4 菌株。该J4菌株的菌落形态如图10所示，其对棒状拟盘多毛孢的平皿拮抗效果如图11所示。

(2)鉴定

对该J4菌株通过16S rRNA序列测定，获得相应的序列(如下SEQ ID NO:7所示)，并根据该16S rRNA序列，利用MEGA7.0做系统发育树分析，其结果如图12所示。

J4菌株的16S rRNA序列：

ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCC TGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGT GAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATC GTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGAC GGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG(SEQ ID NO:7)

经鉴定，该J4菌株是解淀粉芽孢杆菌，将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17844。

实施例2四种解淀粉芽孢杆菌的平皿拮抗效果

将本发明所述的解淀粉芽孢杆菌与市场外采解淀粉芽孢杆菌(W1、W2、W3)以及外采胶质芽孢杆菌(W4)、枯草芽孢杆菌(W5)分别在30℃，180rpm培养条件下24小时液体LB培养基进行培养，获得发酵液，并分别利用拟盘多毛孢和镰刀菌进行平皿拮抗试验，测定平皿拮抗率。其中平皿拮抗试验如下：

采用平皿对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在病原菌(拟盘多毛孢或者镰刀菌)边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将不同的菌株用牙签接种在平板四周，接种后将培养皿在25℃恒温培养，观察不同菌株对于病原菌的抑制作用。2～3天后测定相应的平皿拮抗率。

平皿拮抗率通过下述方法计算获得：

拮抗率(％)＝(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径*100

其结果如下表1所示：

表1平皿拮抗效果

从表1给出的结果可以看出，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17841)菌液对拟盘多毛孢菌的拮抗效果好于其他处理15-30％，而对镰刀菌的抑制则无明显差异；解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17842)针对草莓根腐病病原菌镰刀菌的拮抗率具有20％-34％的提升；解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17843)针对草莓根腐病两种病原菌的拮抗率，具有14.7％～27.4％的提升；解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17844)对拟盘多毛孢的平板拮抗率达到80％，与市场上其他解淀粉芽孢杆菌相比，拮抗率提升10-15％。

实施例3四种解淀粉芽孢杆菌的盆栽防效

在山东省临沂市中化农业(临沂)研发中心有限公司试验大棚内进行草莓盆栽抗病试验，四种解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、 CGMCCNo.17844作为试验组，外采菌剂W1-W5作为对照。按照实施例2给出的方法制备各发酵液。

在草莓盆栽缓苗15天后将各发酵液(同时以清水作为空白对照)加入各盆植株根部土壤中，48h后接入病原菌(每盆接种两种病原菌100ml，浓度为10⁶cfu/ml)，14天后开始调查，统一田间管理，按照下述方法计算发病率。

发病率的计算方法如下：

叶子发黄或干枯后，拔出检查根部，统计根部的发病情况，将根腐病病害分为6级：0 级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。

发病率(％)＝∑(病害级别×该级别植株数)/(总株数×病害最高级值)×100

其结果如表2所示：

表2菌剂盆栽防病效果

编号	处理	发病率
			CK	清水	85％
T1	解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17841)发酵液	5％
			T2	解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17842)发酵液	5％
T3	解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17843)发酵液	5％
			T4	解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17844)发酵液	25％
T5	解淀粉芽孢杆菌(W1)发酵液	27％
			T6	解淀粉芽孢杆菌(W2)发酵液	45％
T7	解淀粉芽孢杆菌(W3)发酵液	40％
			T8	胶质芽孢杆菌(W4)发酵液	36％
T9	枯草芽孢杆菌(W5)发酵液	65％

从表2给出的结果可以看出，相较于市购的解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌，本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌能够显著降低菌株的发病率。

实施例4复合菌剂

实施例4提供了含有不同的解淀粉芽孢杆菌的复合菌剂，为了表述方便，将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCC No.17844 依次简称为J1、J2、J3、J4。方法如下：

1、分别制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、CGMCC No.17842、CGMCC No.17843、CGMCC No.17844微生物菌剂。

将不同的解淀粉芽孢杆菌的分别接种到1000ml摇瓶中进行活化培养，摇瓶中装有LB 液体培养基，获得种子液；然后将各种子液分别接种至10L的液体发酵罐中进行发酵培养，转速为160rpm，其中接种量、发酵温度、发酵时间分别如表3所示。

其中液体发酵罐中装有液体发酵培养基，液体发酵培养基的配方按照下述比例制备：蛋白胨10g，硫酸铵2.5g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，聚乙烯醇5g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

发酵结束后将发酵产物进行喷雾干燥，获得粉末状的微生物菌剂(菌粉)，每克菌粉中含有的各菌株的有效活菌数分别如表3所示。

2、将所获得的菌粉分别按照表3中给出的混合比例进行混合，获得相应的复合菌剂，每克复合菌剂中含有的有效活菌数如表3所示。

表3复合菌剂

分别对上述复合菌剂的盆栽防治效果以及田间防治效果进行验证，如下所示：

1、盆栽防治效果

盆栽试验于山东省中化农业(临沂)研发中心有限公司进行，草莓品种为红颜。将上述制备的复合菌剂1～10样品作为不同的处理组，分别编号为T1～T10；以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照(各菌剂参照实施例2的方法获得发酵液，烘干获得)，分别编号为W1、W5、W4。同时设置对照组 CK1(不做任何处理)和对照组CK2(只接草莓根腐拟盘多毛孢和镰刀菌病原菌孢子悬液，浓度为10⁶cfu/ml)。实验过程如下：

每处理组和对照组各20盆，每盆种植一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为30cm×20cm×30cm(盆口直径×盆底直径×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。

在缓苗后15天后各处理组的各盆植株根部土壤中分别加入各菌剂，48h后接入病原菌 (孢子悬液浓度同对照组CK2)，试验期为30天，各处理每天浇水量相同，统一管理，30天时计算发病率。具体实验结果见表4：

表4菌剂盆栽拮抗效果

编号	处理	发病率
			CK1	空白	3％
CK2	草莓根腐病原菌孢子悬液	85％
			T1	复合菌剂1	8％
T2	复合菌剂2	9％
			T3	复合菌剂3	9％
T4	复合菌剂4	12％
			T5	复合菌剂5	8％
T6	复合菌剂6	10％
			T7	复合菌剂7	11％
T8	复合菌剂8	9％
			T9	复合菌剂9	8％
T10	复合菌剂10	11％
			W1	解淀粉芽孢杆菌W1	21％
W5	枯草芽孢杆菌W5	38％
			W4	胶质芽孢杆菌W4	45％

实验结果表明，施用本发明所提供的复合菌剂用于防治草莓根腐病病原菌，效果明显，发病率仅为8％～12％，相较于外采菌剂，能降低发病率9％～33％。说明本发明所提供的复合菌剂对于草莓根腐病的预防效果更好，专一性更强，使用更方便，不需要多次喷施，不会造成土壤和环境污染。

2、田间防治效果

试验于山东省临沂市莒南县草莓大棚进行，草莓品种为红颜。以上述制备得到的复合菌剂1～10样品作为不同的处理组，编号为T1～T10；以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照(各菌剂参照实施例2的方法获得发酵液，烘干获得)，分别编号为W1、W5、W4。同时设置对照组CK1(农户常规施肥，不使用菌剂)。其中鲜重(g/株)代表草莓植株的重量；结果数(个/株)代表每株植株上所结的草莓的个数；产量(g/株)代表草莓果实的重量；甜度(％)通过糖度仪检测获得。需要说明的是，以下各实施例中鲜重、结果数、产量、甜度等均与该实施例具有相同的含义以及相同的计算方式其中甜度利用糖度仪进行检测。实验结果如下：

表5草莓大棚试验结果

编号	处理	产量(kg/亩)	发病率(％)	甜度(％)
					CK1	常规施肥	2056	38	15.12
T1	复合菌剂1	2214	10	17.38
					T2	复合菌剂2	2143	13	16.6
T3	复合菌剂3	2255	10	16.43
					T4	复合菌剂4	2537	14	15.97
T5	复合菌剂5	2521	11	15.68
					T6	复合菌剂6	2276	14	17.39
T7	复合菌剂7	2209	11	17.26
					T8	复合菌剂8	2514	15	16.66
T9	复合菌剂9	2094	10	16.33
					T10	复合菌剂10	2277	15	17.12
W1	解淀粉芽孢杆菌W1	2152	19	15.42
					W5	枯草芽孢杆菌W5	2226	28	14.21
W4	胶质芽孢杆菌W4	2216	32	16.12

从实验结果可以看出，本发明所提供的复合菌剂能够有效降低草莓根腐病的发病率，且有增产、促进果实糖分的积累，提高品质的效果。具体来说，使用本发明所提供的复合菌剂，与未使用菌剂相比，草莓产量提升17％～25％，发病率降低23％～28％，甜度增加1.4％～2.5％。与外采菌剂相比，草莓产量提升8％～19％，发病率降低4％～22％，甜度增加 0.34％～3.4％。且果实饱满，畸形果少，味甜、口感好。

实施例5复合菌剂

实施例5提供了复合菌剂，所提供的复合菌剂在本发明实施例4所提供的含有不同的解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂的基础上，进一步复配了胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉中的一种或几种，具体的复配成分以及相应的复配比例如下表6所示。

各复合菌剂制备方法如下：

1、复合菌剂中含有的解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂参照实施例4的方法制备。

2、制备胶质芽孢杆菌菌剂。

将胶质芽孢杆菌接种到1000ml摇瓶中进行活化培养，摇瓶中装有LB液体培养基，获得种子液；然后将种子液分别接种至10L的液体发酵罐中进行发酵培养，转速为160rpm，接种量为8％，30℃发酵28h后得到发酵产物，进行喷雾干燥得到菌粉，其中每克菌粉中含有胶质芽孢杆菌的有效活菌数为1×10¹¹。

3、制备土曲霉、绿色木霉菌剂。

采用相同的方法制备土曲霉和绿色木霉菌剂。分别将土曲霉、绿色木霉接种在100ml PDA液体摇瓶中培养，温度为27摄氏度，转速为120rpm，培养28小时得到菌丝球。随后将菌丝球接种到固体发酵培养基上，接种量为8％，30℃发酵，光照24小时后黑暗培养24 小时，连续发酵7天，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物并干燥粉碎，每克土曲霉菌剂中含有的土曲霉的有效活菌数为5×10⁹，每克绿色木霉菌剂中含有的绿色木霉的有效活菌数为5×10⁹。

其中该固体发酵培养基的配方按重量组分计为麦麸：玉米淀粉：大米碎渣：小米：秸秆渣＝2:1.5:1:1:0.5，含水量60％。

3、按照表6中所列出的各混合比例进行复合得到复合菌剂11～复合菌剂20。

表6复合菌剂

对所制备的复合菌剂11～复合菌剂20进行根腐病盆栽防治效果以及田间防治效果的验证：

1、盆栽防治效果

盆栽试验于山东省中化农业(临沂)研发中心有限公司进行，草莓品种为红颜。以说制备的复合菌剂11～20样本作为不同的处理组，分别编号为T11～T20；以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照(各菌剂参照实施例2的方法获得发酵液，烘干获得)，分别编号为W1，W5和W4。同时设置对照组 CK1(不做任何处理)和对照组CK2(只接拟盘多毛孢和镰刀菌病原菌孢子悬液，浓度为10⁶cfu/ml)。实验过程如下：

每处理各20盆，每盆种植一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为 30cm×20cm×30cm(盆口直径×盆底直径×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。

在缓苗后15天后各处理组的各盆植株根部土壤中分别加入各菌剂，48h后接入病原菌 (孢子悬液浓度同对照组CK2)，试验期为30天，各处理每天浇水量相同，统一管理，30天时计算发病率。

具体实验结果见表7：

表7菌剂盆栽拮抗效果

编号	处理	发病率
			CK1	空白	3％
CK2	草莓根腐病原菌孢子悬液	85％
			T11	复合菌剂11	11％
T12	复合菌剂12	8％
			T13	复合菌剂13	8％
T14	复合菌剂14	9％
			T15	复合菌剂15	12％
T16	复合菌剂16	8
			T17	复合菌剂17	8％
T18	复合菌剂18	11％
			T19	复合菌剂19	9％
T20	复合菌剂20	9.5％
			W1	解淀粉芽孢杆菌W1	21％
W5	枯草芽孢杆菌W5	38％
			W4	胶质芽孢杆菌W4	45％

实验结果表明，施用本发明所提供的复合菌剂用于防治草莓根腐病病原菌，发病率为 8％～12％，相较外采菌剂，能降低发病率9％～33％。

2、田间防治效果

试验于山东省临沂市莒南县草莓大棚进行，草莓品种为红颜。以上述制备的复合菌剂 11～20号样品作为不同的处理组，分别编号为T11～T20，以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照，分别编号为W1、W5、 W4。对照组CK1(农户常规施肥，不使用菌剂)。

实验结果如下表8所示：

表8草莓大棚试验结果

从实验结果可以看出，本发明所述的复合菌剂能够有效降低草莓根腐病的发病率，且有增产、促进果实糖分的积累，提高品质的效果。具体来说，使用本发明所提供的复合菌剂，与未使用菌剂相比，草莓产量提升17％～25％，发病率降低23％～28％，甜度增加1.4％～2.5％。与外采菌剂相比，草莓产量提升8％～19％，发病率降低4％～22％，甜度增加 0.34％～3.4％。且果实饱满，畸形果少，味甜、口感好。

实施例6肥料

实施例6提供了一种肥料，该肥料通过将复合菌剂与发酵牛粪、炭基肥、小分子有机料掺混获得。其制备方法如下：

1、参照实施例4或者实施例5中的各方法制备解淀粉芽孢杆菌菌剂、胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂和土曲霉菌剂。

2、按照表9中所列出的各比例将发酵牛粪，炭基肥，小分子有机料，硅酸钙进行混掺，获得生物有机肥。掺混后均匀加入占所述生物有机肥0.2-5‰由步骤1得到的菌剂，掺混，即得到肥料。具体实施例及每克各肥料所含有的有效活菌数如表9所示。

表9肥料

对上述制备的肥料进行盆栽防治效果以及田间防治效果的验证：

1、盆栽防治效果

盆栽试验于山东省中化农业(临沂)研发中心有限公司进行，草莓品种为红颜。以实上述制备的肥料1～5号样品作为不同的处理组，分别编号为T1～T5，以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照，分别编号为W1、W5、W4。同时设置对照组CK1(不做任何处理)和对照组CK2(只接草莓根腐病原菌孢子悬液，浓度为10⁶cfu/ml)。实验过程如下：

每处理20盆，每盆种植一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为30cm×20cm×30cm (盆口直径×盆底直径×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。

在缓苗后15天后在各盆植株根部土壤中加入各肥料，48h后接入病原菌(孢子悬液浓度同对照组CK2)，试验期为30天，各处理每天浇水量相同，统一管理，30天时计算发病率。

具体实验结果见表10：

表10菌剂盆栽拮抗效果

编号	处理	发病率
			CK1	空白	3％
CK2	草莓根腐病原菌孢子悬液	85％
			T1	肥料1	10.8％
T2	肥料2	10％
			T3	肥料3	11％
T4	肥料4	8％
			T5	肥料5	9％
W1	外采解淀粉芽孢杆菌W1	21％
			W5	外采枯草芽孢杆菌W5	38％
W4	外采胶质芽孢杆菌W4	45％

试验结果表明，施用本发明实施例所提供的肥料能够降低发病率，发病率仅为8％～11％，相较外采菌剂，能降低发病率9％～33％。

2、田间防治效果

试验于山东省临沂市莒南县草莓大棚进行，草莓品种为红颜。以上述制备的肥料1～5 作为不同的处理组，编号为T1～T5；以外采解淀粉芽孢杆菌菌剂W1、枯草芽孢杆菌菌剂W5、胶质芽孢杆菌菌剂W4处理组作为对照，分别编号为W1、W5、W4。同时设置对照组CK1(农户常规施肥，不使用菌剂)。

实验结果如表11所示：

表11草莓大棚试验结果

从实验结果可以看出，本发明所述提供的肥料有效降低草莓根腐病的发病率，且有增产、促进果实糖分的积累，提高品质的效果。具体来说，使用本发明所提供的肥料，与对照相比，草莓产量提升17％～25％，发病率降低23％～28％，甜度增加1.4％～2.5％。与外采菌剂相比，草莓产量提升8％～19％，发病率降低4％～22％，甜度增加0.34％～3.4％。且果实饱满，畸形果少，味甜、口感好。

实施例7肥料

本发明所提供的复合菌剂可以在有机肥、有机无机肥造粒后，在包膜工段添加。该实施例提供了一种肥料，并对其田间效果进行了验证。

在山东省临沂市中化农业(临沂)研发中心有限公司中试基地进行试验样品制备，在山东省临沂市莒南县草莓大棚进行，草莓品种为红颜。分别以实施例4、实施例5中制备的复合菌剂1～20号样品做为供试样品，添加到70-10(70指有机质含量，10指氮磷钾含量)有机复合肥中，添加比例为2‰。应用于田间试验。另设置两组为外采菌肥W1、W2。常规对照为施用70-10有机肥。

表8草莓大棚田间试验结果

从表8可以看出，添加了复合菌剂的有机肥，与对照(未添加复合菌剂)相比，草莓产量提升15％～17％，发病率降低22％～24％，甜度增加1.9％～2.6％，与外采菌肥相比，草莓产量提升6％～9.3％，发病率降低22％～24％，甜度增加1.4％～2.0％。

本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司

<120> 复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法

<130> PIDC3194243

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

ggctaccttg ttacgact 18

<210> 3

<211> 1416

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841

<400> 3

gctcacttgg gctacctcac cgacttggtg gtgttacaaa ctctcgaggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120

tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat 180

tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240

aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300

agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 360

gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc 420

tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg 480

ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540

tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg 600

cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac 660

cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca 720

gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg 780

gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg 840

agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat 900

tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960

tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac 1020

aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 1080

cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta 1200

cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt 1260

tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta 1320

tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg 1380

agcaagctcc catctgtccg ctcgactcga aagtat 1416

<210> 4

<211> 599

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17842

<400> 4

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaacc 599

<210> 5

<211> 564

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17843

<400> 5

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggt 564

<210> 6

<211> 468

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 棒状拟盘多毛孢

<400> 6

taccttttgt tgcctcggca gaagttatag gtcttcttat agctgctgcc ggtggaccat 60

taaactcttg ttattttatg taatctgagc gtcttatttt aataagtcaa aactttcaac 120

aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga 180

attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccat tagtattcta 240

gtgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa cccttaagcc tagcttagtg ttgggaatct 300

acttctttta ttagttgtag ttcctgaaat acaacggcgg atttgtagta tcctctgagc 360

gtagtaattt tttttctcgc ttttgttagg tgctataact cccagccgct aaacccccaa 420

ttttttgtgg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaa 468

<210> 7

<211> 560

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844

<400> 7

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg 560

Claims

1.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括选自下列中的至少两种解淀粉芽孢杆菌：

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.17841，

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.17842，

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.17843，

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.17844；

所述解淀粉芽孢杆菌均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂为干粉状，每克所述复合菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为1×10⁸以上。

3.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂为干粉状，每克所述复合菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为1×10⁹~1×10¹¹。

4.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中任意两种解淀粉芽孢杆菌的重量比为1~3：1~3。

5.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中任意两种解淀粉芽孢杆菌的重量比为1~1.5：1~1.5。

6.根据权利要求4或5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂进一步包括选自下列中的至少一种：

胶质芽孢杆菌、

绿色木霉、

土曲霉；

所述胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉中的任意一种与所述解淀粉芽孢杆菌中的任意一种的重量配比为1~3:1~3。

7.根据权利要求6所述的复合菌剂，其特征在于，所述胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉中的任意一种与所述解淀粉芽孢杆菌中的任意一种的重量配比为1~1.5：1~1.5。

8.一种制备权利要求1~7中的复合菌剂的方法，其特征在于，包括：

将菌株分别进行发酵处理，基于发酵处理的产物获得微生物菌剂；

将所述微生物菌剂进行复配，以便获得所述复合菌剂。

9.一种肥料，其特征在于，所述肥料包含权利要求1~7中任一项所述的复合菌剂。

10.根据权利要求9所述的肥料，其特征在于，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥、有机复合肥、有机无机复混肥中的其中一种，所述复合菌剂的含量为所述基础肥料的含量的1‰~5‰。

11.根据权利要求10所述的肥料，其特征在于，所述生物有机肥包括30~50重量份的发酵牛粪、20~40重量份的炭基肥、10~30重量份的小分子有机料和5~15重量份的硅酸钙。

12.一种防治根腐病的方法，其特征在于，包括：

对植物施用有效量的复合菌剂或者肥料，所述复合菌剂为权利要求1~7中任一项所述的复合菌剂，所述肥料为权利要求9~11中任一项所述的肥料；

所述根腐病为镰刀菌和/或拟盘多毛孢引起的根腐病。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述植物为草莓。