CN110172429A - 一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法 - Google Patents

一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基，组分包括马铃薯、蔗糖、玉米黄浆、L‑谷氨酸钠、磷酸盐、MgSO4·7H2O、CaCl2、柠檬酸铁、MnSO4·H2O、植酸、L‑脯氨酸、苏氨酸、四甲基戊二酸、γ‑氨基丁酸、硝普钠、氢化可的松、LaCl3、氨基寡糖素、洋甘菊浸出液、芹菜汁。将生防芽孢杆菌种子液接种到上述培养基中进行变温发酵培养，不仅能促进芽孢杆菌生长繁殖，还能有效激发芽孢杆菌的活性，增强其抑菌物质的分泌和病原菌水解酶的活性，从而显著提高其对植物病原真菌如尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、核盘菌等的抑菌活性，为生防芽孢杆菌的进一步开发应用提供理论基础。

Description

一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及 培养方法
技术领域
本发明涉及的是植物保护技术领域，具体涉及的是一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法。
背景技术
我国是农业大国，植物病害是影响农业生产的主要因素之一。植物病害的种类很多，根据病原的种类可分为两大类：1）非侵染性病害：由非生物引起，例如营养元素的缺乏，水分的不足或过量，低温的冻害和高温的灼病，肥料、农药使用不合理，或废水、废气造成的药害、毒害等；2）侵染性病害：由生物引起，有传染性，病原体多种，如真菌、细菌、病毒、线虫或寄生性种子植物等。而侵染性病害往往对农作物的危害较大，一旦发病则大量减产，给农业生产带来巨大的经济损失。植物真菌病害是最常见、最普遍的病害，约占植物病害70~80%，其症状类型多且比较复杂，可以出现在植物的各个部位，例如由疫霉属（Phytophthora）引起的烟草黑胫病和马铃薯晚疫病，核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的十字花科、豆科菌核病，霜霉属（Peronospora）和盘梗霉属（Bremia）引起的十字花科、菊科霜霉病，白粉菌（Erysiphe）引起的小麦、大麦、黄瓜白粉病，灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的茄科、葫芦科灰霉病，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的的葫芦科、茄科、豆科以及香蕉枯萎病，大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）引起的茄科、葫芦科、豆科黄萎病等。
化学防治是利用各种化学物质及其加工产品控制有害生物的防治方法，具有防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、使用简单等特点，是长期以来农业生产上最主要的病害防治手段，对农作物的增产增收产生了十分重要的作用。我国化学农药的生产和使用量都非常大，近年来来农药产量都在100万吨以上。由于长期依赖于农药的使用，许多重要的病虫害都产生了抗药性。此外农药的大量使用也产生了诸多负面影响，如环境污染、农药残留、伤害非靶标生物等问题，严重危害了人类健康和生态平衡。
为了达到有效防治植物病害、减少化学农药使用量的目的，使用生物防治技术控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。生物防治是指利用有益生物和生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法。其原理包括：1）抗菌作用：一种生物通过其代谢产物抑制或影响另一种生物的生长发育或生存的现象；2）竞争作用：2种或 2种以上的微生物之间争夺空间、营养、氧气和水分等的现象；3）重寄生作用：植物病原物被其他微生物寄生的现象；4）交互保护作用：植物在事先接种一种弱致病力的微生物后不感染或少感染强致病力病原物的现象；5）溶菌作用：植物病原真菌和细菌的芽管细胞或菌体细胞消解的现象，有自溶性溶菌和非自溶性溶菌之分；6）捕食作用：土壤中的某些原生动物、线虫和真菌，捕食真菌的菌丝和孢子、细菌或线虫的现象。与传统的化学防治相比，生物防治具有不污染环境、对人和其他动物安全、防治作用持久、产品无残留、对病虫的杀伤特异性强，易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点。特别是随着人们对保护环境意识的增强，对绿色食品需求的增加，以及对生态环境建设，保护生物多样性和农业可持续发展的要求，使得植物病虫害的生物防治和生物农药的研究开发成为了世界范围内热点。
可用于生物防治的微生物种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、盾壳霉、粘帚霉等；细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌、放射性土壤杆菌和巴氏杆菌；放线菌主要有链霉菌及其变种。芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌，在自然界中分布广泛，也是土壤中的优势微生物种群。芽孢杆菌具有很强的抗菌防病能力，通过定殖在植物的根际、体表或者体内，同病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以及酶类等机制抑制病原菌的生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。芽孢杆菌的主要防治对象为真菌所引起的植物病害，并且抑制病原真菌的范围很广，包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害，是一种理想的生防微生物。芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，此外芽孢杆菌能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，对外界环境的适应能力更强，因此用其开发生防制剂具有制作简单，储存期长，使用方便等特点，并且对人畜无害，作为生物农药有很大的开发潜力。
目前应用于生物防治的芽孢杆菌主要包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌等。但是据报道，已经开发的生防芽孢杆菌制剂对植物病害防治的效果和稳定性还达不到化学农药的水平，主要原因是生防活菌制剂中微生物活性在加工、储存和使用过程中容易受到周围环境中不利因素的影响而降低。此外，相对于化学农药，生防活菌制剂的生产成本比较高，这些因素都限制了生防芽孢杆菌制剂大规模推广应用并逐步替代化学农药的进程。为提高生防芽孢杆菌制剂的使用效果，本研究利用几种对植物真菌病害有较好生防能力的芽孢杆菌，并对其做抑菌活性增效因子筛选，以期找到能够增强其抑菌效力的物质，并确定其最佳使用浓度，为生防芽孢杆菌制剂的进一步开发打下基础。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种可以提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法，为芽孢杆菌制剂的进一步应用尤其在防治植物真菌病害方面的应用提供研究基础。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基，其特征在于：所述培养基由以下组分及其浓度组成：马铃薯195~205g/L，蔗糖14~20g/L，玉米黄浆12~18g/L，L-谷氨酸钠1.0~2.0g/L，KH2PO4 2.0~3.0g/L，K2HPO4 1.3~1.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，CaCl20.7~1.0g/L，柠檬酸铁30~50mg/L，MnSO4·H2O40~60mg/L，植酸0.5~0.8g/L，L-脯氨酸160~200mg/L，苏氨酸100~150mg/L，四甲基戊二酸5.0~7.0mg/L，γ-氨基丁酸3.3~3.9mg/L，硝普钠0.3~0.7mg/L，氢化可的松30~50mg/L，LaCl390~110mg/L，氨基寡糖素2.5-3.3g/L，洋甘菊浸出液16~24ml/L，芹菜汁16~24ml/L。
所述洋甘菊浸出液的制备方法为：将洋甘菊与沸水按照50~100g:1L的比例水煎提取1~2h，然后以四层纱布过滤取滤液。
所述培养基的初始pH 值调节为7.0~7.4。
包括以下步骤：
a）菌种活化：将低温保存的生防芽孢杆菌菌种解冻复苏，然后划线接种于活化培养基上，32℃培养24h，转接2次备用；
b）种子液制备：用接种环挑取2~3个活化培养基上的单菌落接入装有种子培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为35~50mL/250mL，在32℃、180r/min条件下振荡培养24h；
c）发酵培养：将种子液按照4~6%（v/v）的接种量接入盛有权利要求1所述培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为180~200mL/1L，在转速为200~240r/min的条件下变温发酵培养36h；发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL。
所述生防芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌中的一种。
所述活化培养基由以下组分及其浓度组成：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
所述液体种子培养基由以下组分及其浓度组成：葡萄糖8~12g/L，蔗糖7~9g/L，胰蛋白胨10~13g/L，L-谷氨酸钠2~4g/L，KCl 0.4~0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4~0.6g/L，KH2PO4 1~2g/L，FeSO4·7H2O 0.1~0.2mg/L，MnSO4·H2O 4.3~4.7mg/L，生物素0.25~0.30mg/L，康多酚1.1~1.5mg/L，pH7.0。
所述变温发酵培养是指0~24h发酵温度为32℃，25~36h发酵温度升高至37℃。
所述植物病原真菌是指尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
本发明的技术方案具有以下优势：
1、本发明提供的用于生防芽孢杆菌发酵培养的培养基，采用马铃薯和蔗糖作为碳源，玉米黄浆和L-谷氨酸钠作为氮源，还提高了金属离子铁和锰的浓度，能够促进芽孢杆菌对营养物质的吸收和利用，有利于芽孢杆菌的生长繁殖，而且碳源、氮源的原料相对廉价，能够降低生产成本。
2、本发明的培养基中通过添加植酸、L-脯氨酸、苏氨酸、四甲基戊二酸、γ-氨基丁酸、硝普钠、氢化可的松、LaCl3、氨基寡糖素、洋甘菊浸出液和芹菜汁这些抑菌活性增效因子，能有效激发生防芽孢杆菌的活性，促进芽孢杆菌生长繁殖，增强其抑菌物质分泌和病原菌水解酶活性等作用，从而显著提高生防芽孢杆菌对植物病原菌的抑菌活性，进而提高生防芽孢杆菌对植物真菌病害的防治效力。
3、本发明的培养基及培养方法具有广泛的适用性，对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等多种生防芽孢杆菌都具有提高抑菌活性的作用，可以推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。
实施例1
1.1菌株
供试芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏编号为BNCC110695，购于苏州北纳创联生物技术有限公司。
植物病原真菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），大丽轮枝菌（Verticillium dahlia），灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum），均由淮海工学院海洋学院微生物实验室提供。
1.2培养基
活化培养基：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，蔗糖8g/L，胰蛋白胨11.5g/L，L-谷氨酸钠3g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 4.5mg/L，生物素0.28mg/L，康多酚1.3mg/L，pH7.0。
发酵培养基：马铃薯200g/L，蔗糖17g/L，玉米黄浆15g/L，L-谷氨酸钠1.5g/L，KH2PO4 2.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，CaCl20.8g/L，柠檬酸铁40mg/L，MnSO4·H2O 50mg/L，植酸0.65g/L，L-脯氨酸180mg/L，苏氨酸125mg/L，四甲基戊二酸6.0mg/L，γ-氨基丁酸3.6mg/L，硝普钠0.5mg/L，氢化可的松40mg/L，LaCl3100mg/L，氨基寡糖素2.9g/L，洋甘菊浸出液20ml/L，芹菜汁20ml/L，初始pH 值调节为7.2；其中洋甘菊浸出液的制备方法为：将洋甘菊与沸水按照75g:1L的比例水煎提取2h，然后以四层纱布过滤取滤液。
1.3培养方法
a）菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种解冻复苏，然后划线接种于活化培养基上，32℃培养24h，转接2次备用。
b）种子液制备：用接种环挑取2~3个活化培养基上的单菌落接入装有种子培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为50mL/250mL，在32℃、180r/min条件下振荡培养24h。
c）发酵培养：将种子液按照5%（v/v）的接种量接入盛有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为200mL/1L，在转速为220r/min的条件下变温发酵培养36h，其中0~24h发酵温度为32℃，25~36h发酵温度升高至37℃；发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL。
1.4抑菌活性测定方法
将植物病原真菌接种于PDB液体培养基中，在28℃、180r/min条件下振荡培养3d，得到植物病原真菌菌液；将病原真菌菌液涂布于PDA平板培养基上，28℃培养7d，在菌落边缘选取直径5mm的菌饼，备用。用直径为5mm的滤纸片蘸取供试芽孢杆菌发酵液放置于新的PDA平板培养基中央，在距离滤纸片2cm处等距离处放置3个植物病原真菌菌饼，每个处理3次重复，以未接供试芽孢杆菌（无菌水）的处理为对照。接菌后28℃培养5d，测量抑菌圈大小，计算抑菌率。抑菌率（%）＝［r1-（d-r2）］/r1×100%，其中，r1为两病原菌心间距离，r2为菌心到病原菌垂直距离，d为菌心到病原菌心间距离。
实施例2
2.1玉米黄浆浓度对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响
根据实施例1提供的方法，在含有0、5、10、15、20g/L玉米黄浆的发酵培养基中分别接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL，然后进行抑菌活性测定，结果见下表1。
玉米黄浆又叫玉米浆，是玉米淀粉加工的副产物，也是一种廉价易得的原料。玉米黄浆含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，可以作为微生物生长的有机氮源，还可能促进芽孢杆菌抑菌物质的生物合成。由表1可知，在实验浓度范围内，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率均随添加浓度的升高先升后降，当玉米黄浆浓度为15g/L时，发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率达到最大，因此15g/L是发酵培养基中玉米黄浆的最佳浓度。
2.2四甲基戊二酸浓度对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响
根据实施例1提供的方法，在含有0、3.0、6.0、9.0、12.0mg/L四甲基戊二酸的发酵培养基中分别接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL，然后进行抑菌活性测定，结果见下表2。
四甲基戊二酸是一种植物生长调节剂，是促进植物生长发育的重要激素之一。对微生物而言，四甲基戊二酸同样具有调控微生物细胞生长代谢的作用，因此可作为一种抑菌活性增效因子添加到发酵培养基中，来提高芽孢杆菌的抑菌活性。由表2可知，当四甲基戊二酸浓度为0~6.0mg/L时，随着浓度的增大，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率也逐渐增大，在四甲基戊二酸浓度为6.0mg/L时，抑菌率均达到最大值，之后随着四甲基戊二酸浓度的继续增大，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率逐渐减小，但与对照组（四甲基戊二酸浓度为0）相比抑菌率仍然高于对照组，因此6.0mg/L是发酵培养基中四甲基戊二酸的最适浓度。
2.3氢化可的松浓度对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响
根据实施例1提供的方法，在含有0、20、40、60、80mg/L氢化可的松的发酵培养基中分别接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL，然后进行抑菌活性测定，结果见下表3。
氢化可的松是一种甾体化合物，具有很多生物活性，对微生物的生长繁殖以及代谢产物的合成积累具有调节作用，因此可作为一种抑菌活性增效因子添加到发酵培养基中，来提高芽孢杆菌的抑菌活性。由表3可知，当氢化可的松浓度为0~40mg/L时，随着浓度的增大，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率也逐渐增大，在氢化可的松浓度为40mg/L时，抑菌率均达到最大值，当氢化可的松浓度超过40mg/L之后，随着浓度的继续增大，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率明显减小，当氢化可的松浓度为80mg/L时，抑菌率已经低于对照组（氢化可的松浓度为0），说明产生了一定的抑制作用，因此40mg/L是发酵培养基中氢化可的松的最适浓度。
2.4 LaCl3浓度对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响
根据实施例1提供的方法，在含有0、100、200、300、400mg/L LaCl3的发酵培养基中分别接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL，然后进行抑菌活性测定，结果见下表4。
镧是一种稀土元素，有研究表明适宜浓度的稀土元素对微生物生长有刺激作用，同时对微生物的代谢产物和胞外酶的分泌能力有一定影响。由表4可知，在低浓度下，当LaCl3浓度为100mg/L时，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率均达到最大值，当LaCl3浓度超过200mg/L之后，随着浓度的继续增大，枯草芽孢杆菌发酵液对4种植物病原真菌的抑菌率明显减小，说明高浓度的LaCl3对枯草芽孢杆菌产生了一定的抑制作用，随着LaCl3浓度的升高，抑制的作用不断增强，当LaCl3浓度为400mg/L时，抑菌率显著低于对照组（LaCl3浓度为0），所以100mg/L是发酵培养基中LaCl3的最适浓度。
实施例3
根据实施例1提供的方法，将枯草芽孢杆菌种子液分别接种到LB、营养肉汤这两种常规培养基中进行发酵培养，发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL，然后进行抑菌活性测定，结果见下表5。
由表5可知，采用本发明的培养基发酵所得的枯草芽孢杆菌发酵液，对尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、核盘菌这4种植物病原真菌的抑菌率分别为74.9%、78.0%、80.6%、68.8%，与采用常规培养基发酵相比有了明显提高。本发明的培养基中通过添加植酸、L-脯氨酸、苏氨酸、四甲基戊二酸、γ-氨基丁酸、硝普钠、氢化可的松、LaCl3、氨基寡糖素、洋甘菊浸出液和芹菜汁这些抑菌活性增效因子，能有效激发生防芽孢杆菌的活性，促进芽孢杆菌生长繁殖，增强其抑菌物质分泌和病原菌水解酶活性等作用，从而显著提高生防芽孢杆菌对植物病原菌的抑菌活性，进而提高生防芽孢杆菌对植物真菌病害的防治效力。
实施例4
1.1菌株
供试芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏编号为BNCC195265，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），保藏编号为BNCC336909，购于苏州北纳创联生物技术有限公司。
植物病原真菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），大丽轮枝菌（Verticillium dahlia），灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum），均由淮海工学院海洋学院微生物实验室提供。
1.2培养基
活化培养基：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，蔗糖8g/L，胰蛋白胨11.5g/L，L-谷氨酸钠3g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 4.5mg/L，生物素0.28mg/L，康多酚1.3mg/L，pH7.0。
发酵培养基：马铃薯200g/L，蔗糖17g/L，玉米黄浆15g/L，L-谷氨酸钠1.5g/L，KH2PO4 2.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，CaCl20.8g/L，柠檬酸铁40mg/L，MnSO4·H2O 50mg/L，植酸0.65g/L，L-脯氨酸180mg/L，苏氨酸125mg/L，四甲基戊二酸6.0mg/L，γ-氨基丁酸3.6mg/L，硝普钠0.5mg/L，氢化可的松40mg/L，LaCl3100mg/L，氨基寡糖素2.9g/L，洋甘菊浸出液20ml/L，芹菜汁20ml/L，初始pH 值调节为7.2；其中洋甘菊浸出液的制备方法为：将洋甘菊与沸水按照75g:1L的比例水煎提取2h，然后以四层纱布过滤取滤液。
1.3培养方法
a）菌种活化：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌种解冻复苏，然后划线接种于活化培养基上，32℃培养24h，转接2次备用。
b）种子液制备：用接种环挑取2~3个活化培养基上的单菌落接入装有种子培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为50mL/250mL，在32℃、180r/min条件下振荡培养24h。
c）发酵培养：将种子液按照5%（v/v）的接种量接入盛有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为200mL/1L，在转速为220r/min的条件下变温发酵培养36h，其中0~24h发酵温度为32℃，25~36h发酵温度升高至37℃；发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL。
1.4抑菌活性测定方法
将植物病原真菌接种于PDB液体培养基中，在28℃、180r/min条件下振荡培养3d，得到植物病原真菌菌液；将病原真菌菌液涂布于PDA平板培养基上，28℃培养7d，在菌落边缘选取直径5mm的菌饼，备用。用直径为5mm的滤纸片蘸取供试芽孢杆菌发酵液放置于新的PDA平板培养基中央，在距离滤纸片2cm处等距离处放置3个植物病原真菌菌饼，每个处理3次重复，以未接供试芽孢杆菌（无菌水）的处理为对照。接菌后28℃培养5d，测量抑菌圈大小，计算抑菌率。抑菌率（%）＝［r1-（d-r2）］/r1×100%，其中，r1为两病原菌心间距离，r2为菌心到病原菌垂直距离，d为菌心到病原菌心间距离。
由表6可知，采用本发明的培养基对解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别进行发酵培养，所得发酵液对尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、核盘菌这4种植物病原真菌的抑菌率均高于65%，处于较高的水平，表明本发明的培养基对解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌也具有提高抑菌活性的作用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基，其特征在于：所述培养基由以下组分及其浓度组成：马铃薯195~205g/L，蔗糖14~20g/L，玉米黄浆12~18g/L，L-谷氨酸钠1.0~2.0g/L，KH2PO4 2.0~3.0g/L，K2HPO4 1.3~1.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，CaCl20.7~1.0g/L，柠檬酸铁30~50mg/L，MnSO4·H2O40~60mg/L，植酸0.5~0.8g/L，L-脯氨酸160~200mg/L，苏氨酸100~150mg/L，四甲基戊二酸5.0~7.0mg/L，γ-氨基丁酸3.3~3.9mg/L，硝普钠0.3~0.7mg/L，氢化可的松30~50mg/L，LaCl390~110mg/L，氨基寡糖素2.5-3.3g/L，洋甘菊浸出液16~24ml/L，芹菜汁16~24ml/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基，其特征在于：所述洋甘菊浸出液的制备方法为：将洋甘菊与沸水按照50~100g:1L的比例水煎提取1~2h，然后以四层纱布过滤取滤液。
3.根据权利要求1所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基，其特征在于：所述培养基的初始pH 值调节为7.0~7.4。
4.一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
a）菌种活化：将低温保存的生防芽孢杆菌菌种解冻复苏，然后划线接种于活化培养基上，32℃培养24h，转接2次备用；
b）种子液制备：用接种环挑取2~3个活化培养基上的单菌落接入装有种子培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为35~50mL/250mL，在32℃、180r/min条件下振荡培养24h；
c）发酵培养：将种子液按照4~6%（v/v）的接种量接入盛有权利要求1所述培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为180~200mL/1L，在转速为200~240r/min的条件下变温发酵培养36h；发酵结束后采用无菌水稀释所得发酵液，使菌体浓度达到1×108~1×109CFU/mL。
5.根据权利要求4所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养方法，其特征在于：所述生防芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养方法，其特征在于：所述活化培养基由以下组分及其浓度组成：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
7.根据权利要求4所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养方法，其特征在于：所述液体种子培养基由以下组分及其浓度组成：葡萄糖8~12g/L，蔗糖7~9g/L，胰蛋白胨10~13g/L，L-谷氨酸钠2~4g/L，KCl 0.4~0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4~0.6g/L，KH2PO4 1~2g/L，FeSO4·7H2O 0.1~0.2mg/L，MnSO4·H2O 4.3~4.7mg/L，生物素0.25~0.30mg/L，康多酚1.1~1.5mg/L，pH7.0。
8.根据权利要求4所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养方法，其特征在于：所述变温发酵培养是指0~24h发酵温度为32℃，25~36h发酵温度升高至37℃。
9.根据权利要求1-8所述的一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法，其特征在于：所述植物病原真菌是指尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
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